In the present thesis, a novel gridding technique, as well as, two new segmentation methods applied to complementary DNA (cDNA) microarray images is proposed. More precise, a new gridding method based on continuous wavelet transform (CWT) was performed. Line profiles of x and y axis were calculated, resulting to 2 different signals. These signals were independently processed by means of CWT at 15 different levels, using daubechies 4 mother wavelet. A summation, point by point, was performed on the processed signals, in order to suppress noise and enhance spot’s differences. Additionally, a wavelet based hard thresholding filter was applied to each signal for the task of alleviating the noise of the signals. 10 real microarray images were used in order to visually assess the performance of our gridding method. Each microarray image contained 4 sub-arrays, each sub-array 40x40 spots, thus, 6400 spots totally. According to our results, the accuracy of our algorithm was 98% in all 10 images and in all spots. Additionally, processing time was less than 3 sec on a 1024×1024×16 microarray image, rendering the method a promising technique for an efficient and fully automatic gridding processing. Following the gridding process, the Gaussian Mixture Model (GMM) and the Fuzzy GMM algorithms were applied to each cell, with the purpose of discriminating foreground from background. In addition, markov random field (MRF), as well as, a proposed wavelet based MRF model (SMRF) were implemented. The segmentation abilities of all the algorithms were evaluated by means of the segmentation matching factor (SMF), the Coefficient of Determination (r2), and the concordance correlation (pc). Indirect accuracy performances were also tested on the experimental images by means of the Mean Absolute Error (MAE) and the Coefficient of Variation (CV). In the latter case, SPOT and SCANALYZE software results were also tested. In the former case, SMRF attained the best SMF, r2, and pc (92.66%, 0.923, and 0.88, respectively) scores, whereas, in the latter case scored MAE and CV, 497 and 0.88, respectively. The results and support the performance superiority of the SMRF algorithm in segmenting cDNA images. / Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται ραγδαία ανάπτυξη της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών (microarrays) με αποτέλεσμα την ποιοτική και ποσοτική μέτρηση της έκφρασης χιλιάδων γονιδίων ταυτοχρόνως σ’ ένα και μόνο πείραμα. Εικόνες μικροσυστοιχιών, στις οποίες έχει λάβει χώρα υβριδοποίηση δείγματος DNA, χρησιμοποιούνται ευρέως για την εξαγωγή αξιόπιστων αποτελεσμάτων γονιδιακής έκφρασης και προσδιορισμό των μηχανισμών που ελέγχουν την ενεργοποίηση των γονιδίων σ’ έναν οργανισμό. Συνεπώς, η δημιουργία κατάλληλων υπολογιστικών τεχνικών για την επεξεργασία των εικόνων αυτών συντελεί καθοριστικά στην εξαγωγή ορθών και έγκυρων αποτελεσμάτων. Στη παρούσα Διδακτορική Διατριβή αναπτύχθηκε στο πρώτο στάδια μια νέα πλήρως αυτοματοποιημένη τεχνική διευθυνσιοδότησης και στο δεύτερο στάδιο δύο νέες τεχνικές τμηματοποίησης. Πιο συγκεκριμένα, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος διευθυνσιοδότησης η οποία βασίζεται στο συνεχή μετασχηματισμό κυματιδίου (Continuous Wavelet Transform CWT) για την αυτόματη εύρεση των κέντρων των κηλίδων, καθώς και των ορίων μεταξύ δύο διαδοχικών κηλίδων. Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν δύο νέες μέθοδοι κατάτμησης της εικόνας για τον διαχωρισμό των κηλίδων από το φόντο, οι οποίες βασίζονται στη τεχνική μίξης ασαφών μοντέλων Γκάους (Fuzzy Gaussian Mixture Models FGMM) καθώς και στη τεχνική συνδυασμού τυχαίων πεδίων Μαρκόφ (Markov Random Field MRF) και μετασχηματισμού κυματιδίου (Wavelet Transform WT) (SMRF). Με σκοπό την αξιολόγηση (validation) των προτεινόμενων μεθόδων της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής, δημιουργήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν τόσο πραγματικές εικόνες μικροσυστοιχιών, καθώς και απομιμούμενες (simulated) σύμφωνα με μεθοδολογία η οποία προτείνεται απο τη διεθνή βιβλιογραφία. Όσον αφορά την διευθυνσιοδότηση, χρησιμοποιώντας οπτική ανασκόπηση για κάθε κηλίδα χωριστά σε όλες τις πραγματικές εικόνες, δημιουργήθηκαν δύο κατηγορίες, ανάλογα με το αν οι γραμμές του πλέγματος εφάπτονταν πάνω σε κάποια κηλίδα ή όχι. Η προτεινόμενη μεθοδολογία ήταν ακριβής σε ποσοστό 98% στον ακριβή εντοπισμό των κηλίδων σε όλες τις εικόνες. Σύγκριση ανάμεσα στην απόδοση των GMM, FGMM, MRF και SMRF στις απομιμούμενες εικόνες σε διαφορετικά επίπεδα θορύβου πραγματοποιήθηκε και τα αποτελέσματα σε όλα τα μετρικά, segmentation matching factor (SMF), coefficient of variation ( ), και coefficient of determination ( ), μας έδειξαν ότι η μέθοδος SMRF είναι πιο αξιόπιστη στο να μπορέσει να αναδείξει την πραγματική περιφέρεια της κηλίδας, τόσο σε εικόνες με μεγάλο λόγο σήματος προς θόρυβο, όσο και σε μικρό λόγο. Ενδεικτικά αποτελέσματα σε 1 db SNR για την περίπτωση του SMRF είναι SMF = 92.66, =0.923, και = 0.88, ακολουθούμενο από το MRF ( SMF = 92.15, =0.91, και = 0.85), FGMM ( SMF = 91.07, =0.92, και = 0.86)και GMM (SMF = 90.73, =0.89, και = 0.83). Στη συνέχεια πάρθηκαν αποτελέσματα τα οποία προέκυψαν από τη χρήση πραγματικών εικόνων μικροσυστοιχιών. Και σε αυτή τη περίπτωση, αναδείχθηκε η υπεροχή του WMRF, έναντι των άλλων αλγορίθμων ταξινόμησης μέση τιμή MAE = 497 και CV = 0.88. Τέλος, θα πρέπει να τονιστεί ότι τα παραπάνω μετρικά υπολογίστηκαν και σε αποτελέσματα από δύο ευρέως χρησιμοποιούμενα πακέτα επεξεργασίας εικόνων μικροσυστοιχιών, τα οποία χρησιμοποιούνται και είναι διαθέσιμα. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν το SCANALYSE και το SPOT, τα οποία χρησιμοποιούν τις τεχνικές τμηματοποίησης Fixed Circle και Seeded Region Growing, αντίστοιχα. Στη περίπτωση αυτή η τεχνική SMRF κατάφερε να υπολογίσει καλύτερα αποτελέσματα από τα δύο αυτά πακέτα. Πιο συγκεκριμένα η τεχνική GMM πέτυχε MAE = 1470 και CV = 1.29, η τεχνική FGMM πέτυχε MAE = 1430 και CV = 1.21, η τεχνική MRF πέτυχε MAE = 1215 και CV = 1.15, η τεχνική WMRF πέτυχε MAE = 497 και CV = 0.88, η τεχνική FC του λογισμικού πακέτου SCANALYZE πέτυχε MAE = 503 και CV = 0.90, και τέλος η τεχνική SRG του λογισμικού πακέτου SPOT πέτυχε MAE = 1180 και CV = 0.93.

Η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών επιτρέπει τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης χιλιάδων γονιδίων ταυτόχρονα σε ένα μόνο πείραμα δημιουργώντας έτσι ένα τεράστιο σύνολο δεδομένων για ανάλυση. Για να είναι δυνατή η εξαγωγή σημαντικής πληροφορίας για το υπό μελέτη βιολογικό σύστημα, έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες μέθοδοι προεπεξεργασίας και ανάλυσης των δεδομένων. Στις μεθόδους προεπεξεργασίας των δεδομένων συμπεριλαμβάνονται και οι μέθοδοι κανονικοποίησης. Σκοπός της κανονικοποίησης είναι η ελαχιστοποίηση των συστηματικών σφαλμάτων που εντοπίζονται στα εκτιμώμενα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων, έτσι ώστε οι εμφανιζόμενες διαφορές τους να οφείλονται κυρίως σε βιολογικούς παράγοντες. Επίσης, η κανονικοποίηση καθιστά εφικτή τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης δεδομένων από περισσότερες της μίας μικροσυστοιχίες. Στην παρούσα διπλωματική εργασία παρατίθεται μια ανασκόπηση των μεθόδων κανονικοποίησης για δεδομένα γονιδιακής έκφρασης cDNA μικροσυστοιχιών καθώς και μια σύγκριση των αναλυόμενων μεθόδων κανονικοποίησης. / Microarray technology allows the measurement of gene expression levels of thousands of genes simultaneously in a single experiment, therefore creating a vast set of data for analysis. In order to be able to extract the most essential information for the biological system under examination in a specific microarray, various methods are used for data pre-processing and analysis. These data pre-processing methods also include normalization methods. The purpose of normalization is the minimization of the systematic errors that are found in the estimated gene expression levels, so as the observed biological differences be due mainly to biological factors. Furthermore, the normalization makes possible the comparison of gene expression levels of data from more than one microarrays. In the present thesis a review of the normalization methods for gene expression microarray data is presented, as well as a comparison between the analysed normalization methods.

Η νόσος Αλτσχάιμερ καταλαμβάνει την πρωτοκαθεδρία στις μη αναστρέψιμες άνοιες με τους επιδημιολογικούς της δείκτες να αυξάνονται όσο μεγαλώνει το προσδόκιμο ζωής του ανθρώπου. Η χρήση φαρμάκων, με αρχική στόχευση άλλη πάθηση, στη νόσο Αλτσχάιμερ αποκαλείται φαρμακευτικός επαναπροσδιορισμός και προσφέρει σαφή πλεονεκτήματα στην ασφάλεια, την ταχύτητα και το κόστος ανάπτυξης μίας εν δυνάμει θεραπείας, ιδιαίτερα όταν η μέχρι σήμερα αντιμετώπιση της πάθησης περιορίζεται στην καθυστέρηση εξέλιξης της βλάβης και τις δευτερογενείς εκδηλώσεις. Στην παρούσα εργασία, εκμεταλλευτήκαμε εργαλεία φαρμακευτικής επαναστόχευσης που βασίζονται στις γονιδιακές υπογραφές πέντε μελετών μικροσυστοιχιών της νόσου Αλτσχάιμερ. Καίριο στάδιο στη συγκρότηση γονιδιακών υπογραφών είναι ο προσδιορισμός της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων. Εφαρμόζοντας τρεις διαφορετικές τεχνικές (Limma, ChDir, mAP-KL) για το σκοπό αυτό και τοποθετώντας τα αποτέλεσματα σε τέσσερα ξεχωριστά εργαλεία φαρμακευτικής επαναστόχευσης (cMap, SPIEDw, sscMap, LINCS-L1000), αναδείξαμε φάρμακα που συστηματικά αντιστρατεύονται τη νόσο. Η περαιτέρω ανάλυση σε επίπεδο χημικής δομής, λειτουργικών μονοπατιών και δικτυακής θεώρησης προσδιόρισε το μηχανισμό δράσης των φαρμάκων και πρότεινε νέα βιοδραστικά μόρια ως δυνατικές θεραπευτικές επιλογές. / Alzheimer’s disease dominates dementias of irreversible cause with alarming epidemiologic characteristics due to rise of human life expectancy. The use of initially otherwise purposed drugs in Alzheimer is described as drug repositioning and offers clear advantages in terms of safety, speed and cost issues in the development of a potential therapy, particularly when current treatments are limitited to symptoms’ delay and secondary comorbidities. In this study, we exploited drug repurposing tools based on gene signatures from five microarray experiments of Alzheimer’s disease. A fundamental step in constructing gene signatures is to define differential gene expression. For this purpose, we used three different methods (Limma, ChDir, mAP-KL) which we analyzed with four distinct drug repurposing tools (cMap, SPIEDw, sscMap, LINCS-L1000) and found drugs that systematically reverse the disease signature. Further processing of the results with regard to chemical structure, pathway and network analysis revealed the mode of the drugs’ actions and highlighted them as potential therapeutic choices for Alzheimer’s disease.

The advent of efficient genome sequencing tools and high-throughput experimental biotechnology has lead to an enormous progress in life sciences. Among the most important innovations is the microarray technology. It allows to quantify the expression of thousands of genes simultaneously by measuring the hybridization from a tissue of interest to probes on a small glass or plastic slide. Before launching into microarray research it is important to recall that the characteristics of this data include a fair amount of noise and an atypical dimensionality (which makes difficult the use of classic statistics tools – experimental samples in the order of dozens and measured parameters in thousands or tens of thousands). Therefore, the main goal of this thesis is the development of adequate computational methods and algorithms, capable of extracting valuable biological knowledge from this type of data. Applications of microarray technology as a tool for gene expression analysis range from the assignment of functional categories for genes of unknown biological function (based on the analysis of genes with already established biological role), to precise and early diagnosis of different tumor malignancies. However, the main goal of computational analysis of gene expression data is the extraction of regulatory knowledge at genetic level that may be used to provide a broader understanding on the functioning of complex cellular systems. In this direction, revealing the structures of regulatory networks based of gene expression data becomes a pivotal task. The thesis contributes with a framework for the discovery of biological functional category of genes based on the synergy of ICA and a dynamic SOM-based clustering algorithm, that accurately finds groups of co-regulated genes, while identifying interesting regulatory signals within the data with the help of ICA decomposition. We also pursue the task of molecular characterization of different tumor types using gene expression profiling, by providing a novel method for tissue samples classification, based on an ensemble of classifiers sequentially trained on reweighted versions of the data. The algorithm, known as boosting, is adapted to peculiarities of gene expression data and employed in conjunction with SVMs. Additionally, the novel concept of finding predictive genes whose signatures are significant for phenotype discrimination is treated. Finally, the thesis presents a method developed for reverse-engineering gene regulatory networks based on recurrent neuro-fuzzy networks, which exploits the advantages of fuzzy-based models, in terms of results interpretability, and those of neural systems, in terms of computational power and time series prediction capabilities. / H έλευση ικανών υπολογιστικών εργαλείων για την μελέτη της γενομικής ακολουθίας και της ερευνητικής βιοτεχνολογίας υψηλής ανάλυσης, οδήγησε σε μια τεράστια πρόοδο στις επιστήμες ζωής. Μεταξύ των πιο σημαντικών καινοτομιών είναι η τεχνολογία μικροσυστοιχιών. H τεχνολογία αυτή επιτρέπει την ποσοτικοποίηση της έκφρασης χιλιάδων γονιδίων ταυτόχρονα, μετρώντας τον υβριδισμό από έναν ιστό ενδιαφέροντος έως σε δείγματα σε μικρό γυαλί η σε πλαστικά τσιπ. Πριν ξεκινήσουμε την έρευνα πάνω στις μικροσυστοιχίες είναι σημαντικό να θυμόμαστε ότι τα χαρακτηριστικά των δεδομένων αυτής περιλαμβάνουν αρκετό ποσό θορύβου και ένα μη τυπικό αριθμό διαστάσεων (το οποίο καθιστά δύσκολη την χρήση κλασσικών στατιστικών μεθόδων – μέγεθος δείγματος σε δωδεκάδες και μέγεθος χαρακτηριστικών σε χιλιάδες η δεκάδες η εκατοντάδες). Επομένως, ο κύριος στόχος αυτής της διδακτορικής εργασίας είναι η ανάπτυξη ικανών υπολογιστικών μεθόδων και αλγόριθμων έτσι ώστε να εξάγουν πολύτιμη βιολογική γνώση από τον συγκεκριμένο τύπο δεδομένων. Εφαρμογές της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών σαν ένα εργαλείο για την ανάλυση έκφρασης γονιδίων ξεκινούν από την εύρεση και απόδοση λειτουργικών κατηγοριών για γονίδια άγνωστης βιολογικής λειτουργικότητας (βασισμένη στην ανάλυση των γονιδίων ήδη εδραιωμένου βιολογικού ρόλου) έως την ακριβή και πρώιμη διάγνωση διαφορετικών κακοήθων όγκων. Όμως ο κύριος στόχος της υπολογιστικής ανάλυσης της έκφρασης γονιδίων είναι η εξαγωγή ρυθμιζόμενης γνώσης στο γενετικό επίπεδο το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ώστε να παρέχει μία ευρύτερη κατανόηση της λειτουργίας πολύπλοκων κυτταρικών συστημάτων. Σε αυτή την κατεύθυνση, το να αναδεικνύεις τις δομές ρυθμιστικών δικτύων βασισμένων στην έκφραση γονιδίων γίνεται καίριο έργο. Η διδακτορική διατριβή συνεισφέρει στο πλαίσιο για την ανακάλυψη βιολογικά λειτουργικών κατηγοριών γονιδίων βασισμένη στην συνεργία της ΙCA και της δυναμικού βασισμένου στη SOM ομαδοποίηση αλγορίθμου η οποία με ακρίβεια βρίσκει ομάδες γονιδίων που συν-ρυθμίζονται ενώ παράλληλα αναγνωρίζει ενδιαφέροντα ρυθμιστικά σήματα μέσα στα δεδομένα με τη βοήθεια της ΙCA αποδόμησης. Eπίσης, προσανατολιζόμαστε στην εύρεση του μοριακού χαρακτηρισμού διαφορετικών τύπων όγκων χρησιμοποιώντας το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, βασισμένο σε ένα σύνολο κατηγοριοποιητών οι οποίοι εκπαιδεύτηκαν σειριακά σε επανασταθμισμένες παραλλαγές των δεδομένων. Ο αλγόριθμος, γνωστός και σαν boosting, έχει προσαρμοστεί στις ιδιαιτερότητες των δεδομένων έκφρασης γονιδίου και εφαρμόζεται σε συνδυασμό με τα SVMs. Επιπλέον, εξετάζεται η πρωτοποριακή τεχνική της εύρεσης προβλέψιμων τιμών των οποίων οι υπογραφές είναι σημαντικές για τον χαρακτηρισμό φαινότυπου. Τελικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει μια μέθοδο που αναπτύχθηκε για αντίστροφα μηχανικά ελεγχόμενα από γονίδια νευρωνικά δίκτυα βασισμένα σε αναδρομικά νευρωνικά δίκτυα τύπου fuzzy, τα οποία αξιοποιούν τα πλεονεκτήματα των μοντέλων τύπου fuzzy σε βάση επεξηγηματικότητας αποτελεσμάτων, και αυτών των νευρωνικών δικτύων σε βάση υπολογιστικής δύναμης και ικανότητας πρόβλεψης χρονοσειρών.

The expression of genetic information, in all organisms, might be characterized as in a constant state of flux with only a fraction of the gene within a genome being expressed at any given time. The genes’ expression pattern reflects the response of cells to stimuli that control growth, development and signal environmental changes. Understanding genes’ expression at the level of transcription and/or other stages of gene regulation at the mRNA level (half life of mRNA, RNA production from primary transcript) might reveal insights into the genes expression mechanisms that control these changes. With the DNA microarray technology researchers are now able to determine, in a single experiment, the gene expression profiles of hundreds to tens of thousands of genes in tissue, tumors, cells or biological fluids. Accordingly, and since the patterns of gene expression are strongly functionally correlated, microarrays might provide unprecedented information both on basic research (e.g. expression profiles of different tissues) and on applied research (e.g. human diseases, drug and hormone action etc). While the simultaneous measurement of thousands of gene expression levels potentially serves as source of profound knowledge, genes quantification (i.e. extraction of the genes expression levels) is confounded by various types of noise originating both from the microarray experimental procedure (e.g. sample preparation) and the probabilistic characteristics of the microarray detection process (e.g. scanning errors). The “noisy” nature of the measured gene expression levels obscures some of the important characteristics of the biological processes of interest. The latter, as a direct effect, renders the extraction of biological meaningful conclusions through microarray experiments difficult and affects the accuracy of the biological inference. Thus, as a major challenge in DNA microarray analysis, and especially for the accurate extraction of genes expression levels, might be considered the effective separation of “true” gene expression values from noise. Noise reduction is an essential process, which has to be incorporated into the microarray image analysis pipeline in order to minimize the “errors” that propagate throughout the microarray analysis pipeline and, consequently, affect the extracted gene expression levels. A possible solution, as proposed in previous studies, for addressing microarray image noise is image enhancement. Results of these studies have indicated a superior quality of the enhanced images, without however examining whether enhancement leads to more accurate spot segmentation or reduces the variability of the extracted gene expression levels. As foresaid, noise also complicates the extraction of meaningful biological conclusions. While more advanced methods have been introduced [28-32] that attempt to prevent the noisy set of genes from being grouped, there is a lack of consensus among experts on the selection of a single method for determining meaningful clusters of genes. The latter, directly affects the biological inference, since different number of clusters are produced when different clustering techniques or either different parameters in the clustering algorithms are utilized. Thus, it turns up that it is not only important to assess the performance of each analysis stage independently (i.e. whether the techniques employed in the microarray analysis pipeline provide accurate extracted gene expression levels or the clustering techniques group biologically related genes) but it is also necessary to ensure an acceptable performance of all steps, as a whole, in terms of biologically meaningful information. This thesis has been carried out towards the development of a complete microarray image processing and analysis framework in order to improve the extraction and, consequently, the quantification of gene expression levels on spotted complementary DNA (cDNA) microarray images. The aims of the present thesis are: a) to model and address the effects of cDNA microarray image noise in such a way that it will increase the accuracy of the extracted gene expression levels, b) to investigate the impact of noise and facilitate genes expression data analysis in order to allow biologists to develop an integrated understanding of the process being studied, c) to introduce a semi-supervised biologically informed criterion for the detection of meaningful biological clusters of genes that answer specific biological questions, d) to investigate the performance and the impact of various state-of-art and novel cDNA microarray image segmentation techniques in the quantification of genes expression levels For exploring all of these aspects, a complete and robust framework of microarray image processing and analysis techniques was designed, built and implemented. The framework incorporated in the microarray analysis pipeline a novel combination of image processing and analysis techniques originating from the comprehensive quantitative investigation of the impact of noise on spot segmentation, intensity extraction and data mining. Additionally, novel formulations of known image segmentation techniques have been introduced, implemented and evaluated in the task of microarray image segmentation. The usefulness of the proposed methods has been validated experimentally on both simulated and real cDNA microarray images. / Η έκφραση της γενετικής πληροφορίας, σε όλους τους οργανισμούς, χαρακτηρίζεται από μια σταθερή κατάσταση «ροής» στην οποία όμως μόνο ένα μέρος του γονιδίου μέσα στο γονιδίωμα (genome) εκφράζεται ανά χρονική στιγμή. Το γονιδιακό μοτίβο έκφρασης (gene expression pattern or gene expression profile) θα μπορούσαμε να πούμε ότι αντανακλά την αντίδραση των κυττάρων στα διάφορα εξωτερικά ερεθίσματα. Για να μπορέσουν να απαντηθούν ερωτήματα σχετικά με τους μηχανισμούς που επηρεάζουν και μεταβάλλουν τη γονιδιακή έκφραση ανάλογα με το εξωτερικό ερέθισμα είναι απαραίτητη η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης σε μεταγραφικό επίπεδο (transcription level) ή/και άλλα στάδια (παράγοντες) που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση (gene regulation) σε επίπεδο mRNA. Με τη χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών, οι ερευνητές έχουν πλέον τη δυνατότητα να μελετήσουν ταυτόχρονα την γονιδιακή έκφραση δεκάδων ή και εκατοντάδων χιλιάδων γονιδίων σε ιστούς, κύτταρα όγκους κλπ με τη χρήση ενός και μόνο πειράματος. Κατά συνέπεια, και από τη στιγμή που τα γονιδιακά μοτίβα έκφρασης συσχετίζονται έντονα λειτουργικά (functionally correlated), η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών παρέχει ανεκτίμητης αξίας πληροφορίες που μπορούν να δώσουν ώθηση τόσο στην ανάπτυξη της βασικής έρευνας π.χ. μελέτη των γονιδιακών προφίλ έκφρασης διαφορετικών ιστών όσο και στην ανάπτυξη της εφαρμοσμένης έρευνας π.χ. μελέτη ασθενειών, δράση φαρμάκων και ορμονών κλπ. Παρά τη δυνατότητα που παρέχει η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών για την ταυτόχρονη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης χιλιάδων γονιδίων, η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης (δηλ. η εξαγωγή των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων), επηρεάζεται από τους διάφορους τύπους θορύβου που υπεισέρχονται τόσο κατά την πειραματική διαδικασία κατασκευής των μικροσυστοιχιών (π.χ. προετοιμασία δειγμάτων) όσο και από τα πιθανοκρατικά χαρακτηριστικά που διέπουν τη διαδικασία ανίχνευσης (microarray scanning procedure) των μικροσυστοιχιών (π.χ. λάθη ανίχνευσης). Η «θορυβώδης» φύση των γονιδίων και κατά συνέπεια των μετρούμενων γονιδιακών εκφράσεων «κρύβει» (obscure) μερικά από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των βιολογικών διαδικασιών ενδιαφέροντος και καθιστά δύσκολη την εξαγωγή χρήσιμων βιολογικών συμπερασμάτων. Από τα παραπάνω διαφαίνεται ότι η μείωση του θορύβου είναι μια πολύ σημαντική διαδικασία η οποία θα πρέπει να ενσωματωθεί στην αλγοριθμική μεθοδολογία που μέχρι στιγμής χρησιμοποιείται για την εξαγωγή των γονιδιακών εκφράσεων από τις εικόνες μικροσυστοιχιών. Με αυτό τον τρόπο θα ελαχιστοποιηθούν τα πιθανά «λάθη» τα οποία μεταφέρονται (propagate) κατά τη διαδικασία εξαγωγής των εντάσεων (μέσω της χρησιμοποιούμενης αλγοριθμικής μεθοδολογίας) και τελικά επηρεάζουν την «ακριβή» εξαγωγή των γονιδιακών εκφράσεων. ‘Ως πιθανή λύση για την αντιμετώπιση του θορύβου στις εικόνες μικροσυστοιχιών, έχει προταθεί στη διεθνή βιβλιογραφία η χρήση τεχνικών αναβάθμισης εικόνας. Τα αποτελέσματα αυτών των επιστημονικών εργασιών συμπεραίνουν ότι με τη χρήση τεχνικών αναβάθμισης η ποιότητα των επεξεργασμένων εικόνων είναι σαφώς καλύτερη. Ωστόσο, καμία από αυτές τις εργασίες δεν μελετάει εάν οι τεχνικές αναβάθμισης οδηγούν στον ακριβέστερο προσδιορισμό των παρυφών των κουκίδων (spot) από τις οποίες εξάγονται οι γονιδιακές εκφράσεις ή εάν βοηθάνε στη μείωση της μεταβλητότητας (variability) των εξαγόμενων γονιδιακών εκφράσεων. Επιπρόσθετα, όπως έχει ήδη προαναφερθεί, ο θόρυβος παρεμποδίζει την εξαγωγή χρήσιμων βιολογικών συμπερασμάτων. Παρά το μεγάλο πλήθος εξελιγμένων μεθόδων που έχουν προταθεί στη διεθνή βιβλιογραφία για την αποτροπή της ομαδοποίησης γονιδίων που χαρακτηρίζονται ως «θορυβώδη», δεν έχει καθοριστεί ακόμα (από τους ειδικούς) μια ενιαία μέθοδος που να βρίσκει και να ομαδοποιεί γονίδια τα οποία θα παρέχουν βιολογικά χρήσιμες πληροφορίες. Αποτέλεσμα αυτής της «ασυμφωνίας» μεταξύ των ειδικών αποτελεί η εξαγωγή διαφορετικών βιολογικών συμπερασμάτων ανάλογα α) με τον αριθμό των δημιουργούμενων γονιδιακών ομάδων (που εξαρτάται άμεσα από τη διαφορετική μέθοδο ομαδοποίησης (clustering)) και β) με τις διαφοροποιήσεις που μπορεί να έχουμε στις παραμέτρους των διαφόρων μεθόδων ομαδοποίησης. H παρούσα διατριβή στοχεύει στη δημιουργία ενός ολοκληρωμένου πλαισίου για την επεξεργασία και ανάλυση εικόνων μικροσυστοιχιών με σκοπό την βελτιστοποίηση της εξαγωγής και κατά συνέπεια της ποσοτικοποίησης των γονιδιακών εντάσεων από εικόνες μικροσυστοιχιών κουκίδων (spotted cDNA microarray images). Οι στόχοι της παρούσας διατριβής συνοψίζονται ως εξής: α) μοντελοποίηση και περιορισμός των επιδράσεων του θορύβου σε εικόνες μικροσυστοιχιών κουκίδων κατά τέτοιο τρόπο ώστε να αυξηθεί η ακρίβεια των εξαγόμενων γονιδιακών εκφράσεων, β) μελέτη της επίδρασης του θορύβου και βελτιστοποίηση των μεθόδων ανάλυσης των γονιδιακών εκφράσεων με σκοπό τη διευκόλυνση των βιολόγων στην εξαγωγής βιολογικών συμπερασμάτων και την καλύτερη κατανόηση της βιολογικής διεργασίας που μελετάται, γ) εισαγωγή ενός ημιεποπτευόμενου (semi-supervised) κριτηρίου που στηριζόμενο σε βιολογικές πληροφορίες θα αποσκοπεί στην ανεύρεση βιολογικά σημαντικών ομάδων γονιδίων τα οποία ταυτόχρονα θα απαντούν σε συγκεκριμένα βιολογικά ερωτήματα ,δ) μελέτη της επίδρασης και της απόδοσης διαφόρων τεχνικών κατάτμησης εικόνων μικροσυστοιχιών κουκίδων, τόσο ανωτάτου επιπέδου (state-of-art) όσο και νέων, στην ποσοτικοποίηση γονιδιακών εκφράσεων. Για την πραγματοποίηση των παραπάνω στόχων σχεδιάστηκε και κατασκευάστηκε μια πλήρως δομημένη μεθοδολογία (a complete and robust framework) που περιελάμβανε αλγοριθμους επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνας κουκίδων μικροσυστοιχιών Η προτεινόμενη μεθοδολογία ενσωμάτωσε στην ήδη υπάρχουσα αλγοριθμική μεθοδολογία (microarray analysis pipeline) έναν πρωτότυπο συνδυασμό τεχνικών επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνας βασισμένο στην εις βάθος ποσοτική έρευνα της επίδρασης του θορύβου στην κατάτμηση κουκίδων (spot segmentation), στην εξαγωγή εντάσεων και στην εξόρυξη δεδομένων (data mining). Επιπρόσθετα, κατά την παρούσα διατριβή προτάθηκαν, κατασκευάστηκαν και αξιολογήθηκαν νέες τεχνικές κατάτμησης εικόνας από μικροσυστοιχές κουκίδων. Η χρησιμότητα των προτεινόμενων μεθοδολογιών αξιολογήθηκε τόσο σε εικονικές (simulated) όσο και σε πραγματικές εικόνες μικροσυστοιχιών κουκίδων.

Η θερμοκρασία ανάπτυξης αποτελεί παράγοντα μεγάλης σημασίας στην οντογένεση των ιχθύων, αφού ως ποικιλόθερμοι οργανισμοί είναι συνεχώς εκτεθειμένοι στις μεταβολές του περιβάλλοντός τους. Έχει παρατηρηθεί πως η θερμοκρασία ανάπτυξης δύναται να προκαλέσει μετατόπιση του χρονοδιαγράμματος των οντογενετικών γεγονότων και πλαστικότητα σε μορφολογικούς και φυσιολογικούς χαρακτήρες (πχ στο μυοσκελετικό και το καρδιαγγειακό σύστημα). Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχει μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης του zebrafish και σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του ολικού μεταγραφικού προτύπου νυμφών zebrafish. Για το λόγο αυτό σχεδιάστηκαν δύο πειράματα, όπου τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες ανάπτυξης (22, 28 και 32oC) εφαρμόστηκαν στην πρώιμη οντογενετική περίοδο: για το διάστημα 0-20 dpf* (1ο πείραμα) και 10-20 dpf (2ο πείραμα). Πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA από τα άτομα ηλικίας 20 dpf όλων των πληθυσμών και από τα άτομα ηλικίας 10 dpf του πληθυσμού των 28oC του 2ου πειράματος και ακολούθησε υβριδοποίηση σε ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες Affymetrix, με 15.509 αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες γονιδίων (probe sets). Τα 21 μεταγραφικά προφίλ επεξεργάσθηκαν με τα εξειδικευμένα προγράμματα ανάλυσης μικροσυστοιχιών, dChip και MeV (v.4.5.1). Η κανονικοποίηση και το φιλτράρισμα των δεδομένων των μικροσυστοιχιών απέδωσε μεταγραφικά πρότυπα με 9.488 probe sets. Με τεχνικές πολυπαραμετρικής στατιστικής ανάλυσης (HCL και PCA) πραγματοποιήθηκαν οι συγκρίσεις των μεταγραφικών προτύπων μεταξύ των πειραματικών πληθυσμών για κάθε θερμοκρασία ανάπτυξης και οντογενετικό στάδιο. Οι HCL και PCA αναλύσεις έδειξαν i) σαφή διαχωρισμό των μεταγραφικών προτύπων μεταξύ των δύο πειραμάτων, ii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 28oC και 32oC ως προς αυτά των 22oC και στα δύο πειράματα, και iii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 28oC διαφορετικού οντογενετικού σταδίου (ηλικίας 10 dpf vs 20 dpf). Θα αναμέναμε τα πρότυπα έκφρασης των 28oC να παρουσιάζουν παρόμοιο πρότυπο, κάτι που δεν παρατηρείται. Αυτό οφείλεται στο πειραματικό σφάλμα που υπεισέρχεται από το διαφορετικό χρόνο πραγματοποίησης των δύο πειραμάτων και τις ρυθμίσεις κατά την υβριδοποίηση. Έτσι πραγματοποιήθηκε η κανονικοποίηση των “28”, που απαλείφει το πειραματικό σφάλμα. Οι HCL και PCA αναλύσεις έδειξαν i) σαφή διαχωρισμό των μεταγραφικών προτύπων των 28oC και 32oC ως προς αυτά των 22oC ως αποτέλεσμα της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, ii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 22oC των δύο πειραμάτων ως αποτέλεσμα της επίδρασης της περιόδου εφαρμογής και διάρκειας της θερμοκρασιακής αγωγής και iii) σαφή διαχωρισμό των πρότυπων των 28oC (ηλικίας 10 dpf vs 20 dpf) ως αποτέλεσμα της επίδρασης του οντογενετικού σταδίου. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε ανάλυση σημαντικότητας (SAM) και λειτουργική γονιδιωματική ανάλυση (λογισμικό DAVID) των στατιστικώς σημαντικών γονιδίων που διαφοροποιούν τα πρότυπα. Η ανάλυση των γονιδίων, ως προς την ιστοειδική έκφραση ανέδειξε γονίδια που σχετίζονται με την ανάπτυξη του ματιού, των θωρακικών πτερυγίων και του εγκεφάλου στους πληθυσμούς των 22oC έναντι των 28oC και 32oC. Η παρούσα εργασία αποδεικνύει την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης και της διάρκειας της θερμοκρασιακής αγωγής, καθώς επάγει μηχανισμούς πλαστικότητας στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Τέλος, υποδεικνύεται πως η πρώιμη οντογενετική περίοδος τείνει να είναι περισσότερο θερμοευαίσθητη, καθώς παρατηρείται εντονότερη επίδραση της θερμοκρασίας (στην περίπτωση των 22οC)στην ανάπτυξη του ατόμου. *dpf: days post fertilization / Developmental temperature plays a principal role in the ontogeny of fish. It is known that developmental temperature may shift the initiation time of the ontogenetic stages and induce plasticity in morphological and physiological characters e.g. the musculoskeletal and the cardiovascular system. However, its effect on the gene expression pattern has not previously been attempted for zebrafish. In the present study, zebrafish Affymetrix microarrays of 15,509 probe sets were used to map the transcriptome profile of: a) 20 dpf* old zebrafish larvae at three developmental temperatures, i.e. 22oC, 28oC and 32oC (1st experiment) and b) 20 dpf old zebrafish larvae, which were all grown at 28oC for the first 10 days and subsequently divided into three groups, which were grown at 22oC, 28oC and 32oC, respectively; the profile of 10 dpf old larvae was also measured (2nd experiment). We have isolated total RNA from the above populations and then, hybridization of RNA samples has been done on oligonucleotide Affymetrix microarrays of 15,509 probe sets. All 21 profiles were normalized and filtered (dChip software), and multivariate statistical analysis techniques were used on the normalized 9,488 probe set expression profiles (TM4 MeV software). Hierarchical Clustering (HCL) and Principal Component Analysis (PCA) on expression profiles indicated: a) clear separation of the two experiments based on their transcriptomic patterns, b) clustering of the 28oC and 32oC profiles of the 20 dpf old larvae separately from those at 22oC in both experiments and c) clear separation of the 28oC profiles based on the developmental stage. We would expect expression profiles of 28oC to be clustered together, though this was not observed because of experimental parameters during the hybridization, as the two experiments were carried out independently on different dates. So the normalization of “28” profiles took place, in order to eliminate the experimental noise. HCL and PCA, then, indicated: a) clustering of the 28oC and 32oC profiles of the 20 dpf old larvae separately from those at 22oC, as the effect of developmental temperature, b) clear separation of 22oC profiles of the two experiments, based on the effect of the period and duration of thermal conditions and c) clear separation of the 28oC profiles based on the developmental stage. Then, Significant Analysis of Microarrays (SAM) and Functional Genomic Classification Analysis (DAVID software) of statistically significant genes was carried out. Analysis of genes based on tissue-specific expression indicated characteristic genes for the development of the eye, pectoral fins and brain in 22oC profiles versus 28oC and 32oC profiles. The present study has proved that thermal effect is determinative among the early ontogenetic stage, especially in the case of longer cold thermal period, and developmental temperature may induce plastic response of gene expression, that could affect the fate of fish. *dpf: days post fertilization

Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αντιψωριασικών φαρμάκων σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων με τη χρήση μικροσυστοιχιών DNA. Σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT χορηγήθηκαν τα παράγωγα του ρετινοϊκού οξέος all-trans retinoic acid (ATRA) και acitretin, σε διαβαθμισμένες δόσεις, προκειμένου να διαπιστωθεί η επίδραση τους στα κύτταρα. Μελετήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τις δοκιμασίες της χρωστικής Trypan Blue και ΜΤΤ. Επιλέχθηκαν δύο συγκεντρώσεις (10^-6 και 10^-8 Μ) των φαρμάκων που αντιστοιχούσαν σε βιωσιμότητα κυττάρων περίπου 80%, οι οποίες χορηγήθηκαν εκ νέου σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, έγινε εκχύλιση του RNA και έλεγχος της ποιότητας του με ηλεκτροφόρηση (Bioanalyzer). Το RNA χρησιμοποιήθηκε για την in vitro μεταγραφή cDNA που σημάνθηκε με φθοριοχρώματα και άμεσα ακολούθησε υβριδισμός σε πλακίδιο μικροσυστοιχιών (OneArray) το οποίο περιείχε ανιχνευτές για όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα μαζί με τους κατάλληλους μάρτυρες. Σε κάθε πλακίδιο υβριδίστηκαν ταυτόχρονα cDNA από κύτταρα στα οποία είχε χορηγηθεί ρετινοειδές και κύτταρα στα οποία δεν είχε χορηγηθεί. Η επεξεργασία των δεδομένων της σαρώσεως με ειδικό λογισμικό ανέδειξε 700 περίπου γονίδια που ρυθμίζονται θετικά ή αρνητικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τις μικροσυστοιχίες, επιλέχθηκαν 34 γονίδια τα οποία συμμετέχουν σε βασικές βιολογικές διεργασίες όπως πρωτεϊνοσύνθεση, κυτταρική σηματοδότηση, πολλαπλασιασμός, κυτταρική διαφοροποίηση, κυτταρικός θάνατος, φλεγμονή. Επιπρόσθετα, επιλέχθηκαν 22 γονίδια τα οποία έχουν επίσης κομβικό ρόλο σε σηματοδοτικά μονοπάτια και κυτταρικές λειτουργίες. Η επιλογή αυτή έγινε για να μελετηθεί πιο σφαιρικά η επίδραση των φαρμάκων σε βασικούς κυτταρικούς μοριακούς μηχανισμούς. Στο σύνολο των επιλεγμένων γονιδίων έγινε ποσοτική Real-Time PCR και για το σκοπό αυτό έγινε σχεδιασμός ειδικών εκκινητών. Η qRT-PCR εν τέλει, επιβεβαίωσε τα αρ-χικά αποτελέσματα από τα microarrays. Διαπιστώθηκε ότι η κυτταρική απόκριση στη χορήγηση των ρετινοειδών, εξειδικευμένα για κάθε δραστική ουσία και για κάθε δόση δεν είναι μονοσήμαντη, αλλά ότι ταυτόχρονα επάγονται λειτουργικά μονοπάτια με διαφορετικούς ρόλους. Επίσης διαπιστώθηκε ότι η μεταβολή κατά δύο τάξεις μεγέθους της δόσης που προσλαμβάνουν τα κύτταρα επάγει αντίρροπες κυτταρικές αποκρίσεις. Συγκεκριμένα, η ολιστική προσέγγιση της μεταβολής της γονιδιακής έκφρασης ανέδειξε ότι η χορήγηση ATRA σε συγκέντρωση 10^-6Μ στις κυτταροκαλλιέργειες ευνοεί την πρωτεϊνοσύνθεση και την διαφοροποίηση των κυττάρων ενώ ασκεί αντιφλεγμονώδη δράση. Η χορήγηση της δραστικής ουσίας ATRA στη δόση 10^-8Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων HaCaT σε μεγαλύτερο βαθμό από τον πολλαπλασιασμό τους. Επιπλέον, φαίνεται ότι σε αντίθεση με τη μεγαλύτερη δόση, ευνοείται η σύνθεση μορίων που επάγουν την φλεγμονή. Παρόμοια, η ασιτρετίνη στη δόση 10^-6Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων και την σύνθεση μορίων που επάγουν τη φλεγμονή. Η ασιτρετίνη στην μικρότερη δόση (10^-8 Μ) ευνοεί κύρια την διαφοροποίηση, λιγότερο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και φαίνεται ότι προάγει σε σημαντικό βαθμό την απόπτωση. Οι μεγαλύτερες δόσεις των ρετινοειδών που μελετήθηκαν φαίνεται ότι είναι απαγορευτικές για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αντίθεση με τις μικρότερες δόσεις. Επισημαίνεται ότι για τη θεραπεία της ψωρίασης όπου χρησιμοποιούνται, επιθυμητές δράσεις είναι η παραγωγή μορίων με αντιφλεγμονώδη δράση, ο περιορισμός του αυξημένου κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αύξηση της κυτταρικής απόπτωσης και τέλος πολύ ση-μαντικό είναι η επιτυχής περάτωση της διαφοροποίησης των κυττάρων. Συμπερασματικά, η χρήση τεχνικών υψηλής απόδοσης, κύρια των μικροσυστοιχιών cDNA που επιτρέπουν την εκτεταμένη μελέτη του γονιδιώματος και της qRT-PCR για πιο στοχευμένη μελέτη, μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην εξακρίβωση μοριακών μηχανισμών. / In the current project we performed gene expression profiling, using cDNA microarrays, when specific doses of derivatives of retinoic acid were applied in HaCaT cell culture. These specific drugs are used in the treatment of psoriasis but their exact effect in molecular level remains elusive. All-trans retinoic acid and acitretin were applied in gradient doses. Cell viability was monitored using MTT and Trypan blue assays. Two specific doses (10^-6 & 10^-8 M), in which cell viability was approximately 80%, were chosen for the treatment of HaCaT cells. Subsequently, the treated cells were collected and RNA was extracted using standard methods. At a next step, RNA quality was examined by electrophoresis (Bioanalyzer) and spectrometry. High quality RNA showing no traces of degradation was used as template for in vitro transcription. Finally, synthesis of fluoro-labeled cDNA was performed from RNA derived from both treated and untreated samples and was immediately hybridized to DNA microarray slides (OneArray). Analysis of the hybridization data was performed using specific software. As a result, 700 genes (both up-regulated and down-regulated) were chosen for further analysis. Among them, 34 genes were chosen to validate the microarrays results by the use of quantitative Real-Time PCR. These genes appeared to play crucial role in basic cellular functions like protein synthesis, signal transduction, cell death, cell differentiation and proliferation. Furthermore, 22 additional essential genes that are related to the above processes were chosen in aim to examine drugs effects. The data processing revealed that the 10^-6 M dose of ATRA has a positive effect in protein synthesis, cell differentiation and anti-inflammatory action. Moreover ATRA at a concentration of 10^-8 M promotes differentiation more than proliferation and it has inflammatory effect as well as acitretin has in 10^-6 M dose. On the other, hand acitretin in 10^-8 M dose facilitates differentiation more than proliferation but mainly induces cell death. Generally, high doses (10-6 M) of the drugs inhibit cell proliferation more efficient than low doses (10-8 M). In fact, during psoriasis treatment, the anti-inflammatory action, inhibition of cell proliferation, induction of cell differentiation and cell death are considered desirable drug effects. Our study shows that cDNA microarray analysis represents a powerful tool that can be used for extended genomic studies and the results that are obtained can be validated and used for the elucidation of several molecular mechanisms.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προτείνονται μεθοδολογίες υπολογιστικής νοημοσύνης για την επεξεργασία και ανάλυση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών cDNA. Πιο συγκεκριμένα, στο πρώτο σκέλος αναπτύσσονται δύο νέες προσεγγίσεις για την εύρωστη εκτίμηση και διόρθωση του θορύβου υποβάθρου: η διόρθωση υποβάθρου βάσει εκατοστημορίων και η διόρθωση υποβάθρου βάσει παλινδρόμησης loess. Οι προσεγγίσεις αυτές καινοτομούν κυρίως στο ότι χρησιμοποιούν μία εύρωστη εκτίμηση του θορύβου υποβάθρου, γεγονός που τις καθιστά ιδανικές σε περιπτώσεις, όπου τα δεδομένα είναι θορυβώδη. Επιπροσθέτως, αναπτύσσεται ένα νέο, γενικής χρήσεως, πλαίσιο για τη συστηματική αξιολόγηση του βαθμού επίδρασης των μεθόδων διόρθωσης υποβάθρου. Μέσω του πλαισίου αυτού, οι δύο προτεινόμενες προσεγγίσεις, καθώς και άλλες ευρέως χρησιμοποιούμενες μέθοδοι, αξιολογούνται βάσει εφαρμογής τους σε διαφορετικά σύνολα δεδομένων αυτο-υβριδοποίησης, με τις πρώτες να εμφανίζουν ιδιαιτέρως καλή απόδοση. Το πλαίσιο αυτό καινοτομεί στο ότι ενσωματώνει νέα κριτήρια και τρόπους γραφικής απεικόνισης. Τόσο οι προτεινόμενες μέθοδοι εκτίμησης και διόρθωσης θορύβου υποβάθρου, όσο και το πλαίσιο συστηματικής αξιολόγησής τους, συνιστούν μία νέα, ενδελεχή μελέτη που προσανατολίζει στην εφαρμογή ή απόρριψη μίας συγκεκριμένης προσέγγισης, συνεισφέροντας εν τέλει στην κατάκτηση καλλίτερης ποιότητας δεδομένων μικροσυστοιχιών. Επίσης, στο δεύτερο σκέλος της διατριβής αναπτύσσεται ένα νέο, ολοκληρωμένο και γενικής χρήσεως πλαίσιο ανάλυσης δεδομένων μικροσυστοιχιών ούτως, ώστε να διερευνηθεί το ζήτημα εάν στην T-λευχαιμική κυτταρική σειρά CCRF-CEM επικρατούν εγγενείς ή επίκτητοι μηχανισμοί αντοχής στην πρεδνιζολόνη. Συγκεκριμένα, καταλλήλως επιλεχθέντα δεδομένα μικροσυστοιχιών cDNA – που διευκολύνουν την εξέταση τόσο της εξαρτώμενης από τη συγκέντρωση δράσης, όσο και της δυναμικής της ανταπόκρισης στην πρεδνιζολόνη (πρώιμη και όψιμη δράση) – γίνονται αντικείμενο επεξεργασίας και ενδελεχούς ανάλυσης, και βάσει συγκεκριμένων, προ-διατυπωμένων συλλογισμών, προσεγγίζεται το εν λόγω ερώτημα. Το πλαίσιο αυτό είναι καινοτόμο, εφόσον, πέραν του ότι ενσωματώνει μία πρωτότυπη ακολουθία μεθόδων, προσεγγίζει συστηματικά το πρόβλημα της εγγενούς ή επίκτητης αντοχής, συνεισφέροντας, έτσι, στην ευρύτερη προσπάθεια διερεύνησης των επακριβών μηχανισμών αντοχής των λευχαιμικών κυττάρων στα γλυκοκορτικοειδή. Τα αποτελέσματα από την εφαρμογή του στα δεδομένα της εν λόγω κυτταρικής σειράς συνηγορούν υπέρ της ύπαρξης μίας σύνθετης ανταπόκρισης του υπό μελέτη συστήματος στα γλυκοκορτικοειδή, η οποία όμως τείνει περισσότερο προς έναν εγγενή μηχανισμό αντοχής. / In the present Ph.D. thesis, computational intelligence methods for processing and analyzing cDNA microarray gene expression data are designed and developed. More specifically, in the first part of this thesis, the problem of background estimation and correction of two-channel microarray data is addressed and two novel algorithms are proposed, namely the percentiles-based and the loess-based background correction methods. Both approaches are based on the multiplicative model of background, while utilizing robust background noise estimators, thus making them ideal for noisy datasets. Furthermore, a new, generic framework for the systematic evaluation of the impact of the background estimating methodologies is suggested, whereupon the aforementioned methods as well as other approaches are evaluated by application to various publicly available self-self hybridization datasets. As suggested by this thorough, comparative evaluation our algorithms perform very well regarding noise reduction. The evaluation framework, which is based mainly on different and widely used statistical measures, incorporates new criteria and visualization methods. Moreover, it represents a novel, detailed contribution to the examination of the impact of background correction methods to the final interpretation of microarray experiments, conferring explicit guidance on the pros and cons of them and when they should be applied. Additionally, in the second part of this thesis, a new, generic, computational microarray data analysis framework is described, in order to examine the hypothesis of whether the resistant T-cell leukemia cell line CCRF-CEM posses an intrinsic or exert an acquired mechanism of resistance and to investigate the molecular imprint of this, upon prednisolone treatment. More analytically, using the above explained computational analysis workflow, microarray data that enable the examination of both the dose effect of prednisolone exposure and the dynamics (early and late) of the molecular response of the cells at the transcriptomic layer, are systematically analyzed based on specific, predefined formulations. The analysis of the results supports a complex mechanism of action for the cells which seems to favor though more the intrinsic mechanism of resistance.