Η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι ένα φαινόμενο στρατηγικής σημασίας για την ανάπτυξη, διαφοροποίηση και διατήρηση της ακεραιότητος ενός ιστού. Είναι πλέον γνωστό όμως ότι τόσο η υπέρμετρη όσο και η ανεπαρκής ενεργοποίηση των αποπτωτικών μηχανισμών μπορούν να οδηγήσουν στην εκδήλωση διαφόρων παθήσεων. Η απόπτωση χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένες μορφολογικές και βιοχημικές μεταβολές ενώ η ρύθμισή της ελέγχεται γενετικά μέσω της εκφράσεως ή καταστολής διαφόρων ογκογονιδίων. Ιδιαίτερη σημασία για την ρύθμιση της αποπτώσεως έχουν τα γονίδια της οικογένειας του bcl-2. Συγκεκριμένα το bcl-2 και το bcl-xL καταστέλλουν την απόπτωση ενώ το bax την προάγει. Η ψωρίαση είναι μία χρόνια υποτροπιάζουσα φλεγμονώδης δερματοπάθεια η οποία προσβάλλει ποσοστό 1%-3% του γενικού πληθυσμού. Η ψωρίαση κατά πλάκας αποτελεί την συχνότερη μορφή της νόσου, η οποία χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση σε γενετικώς προδιατεθειμένα άτομα, ερυθηματολεπιδωδών πλακών με σαφή αφορισμό από το πέριξ υγιές δέρμα. Χαρακτηρίζεται από έντονη υπερπλασία της επιδερμίδος, μειωμένη ωρίμανση των κερατινοκυττάρων, φλεγμονώδη διήθηση στην επιδερμίδα (CD8+) και το χόριο (CD4+) και νεοαγγειογένεση. Πρωταρχικό ρόλο στην έναρξη και διατήρηση των ψωριασικών αλλοιώσεων παίζουν τα Τ- λεμφοκύτταρα, τα οποία εκκρίνουν πληθώρα κυτταροκινών Τh1 τύπου. Παρά τα σημαντικά βήματα προόδου που έχουν γίνει τα τελευταία χρόνια στην έρευνα της ψωριάσεως, η παθογένεια της νόσου αυτής παραμένει ακόμα αδιευκρίνιστη. Τα κύτταρα της ψωριασικής επιδερμίδας αποτελούν έναν από τους ταχύτερα αναπτυσσόμενους και πολλαπλασιαζόμενους κυτταρικούς πληθυσμούς του ανθρώπινου οργανισμού. Θεωρητικά τουλάχιστον, η ακάνθωση της ψωριασικής επιδερμίδος θα μπορούσε να προκύπτει όχι μόνο από την αυξημένη μιτωτική δραστηριότητα των κερατινοκυττάρων αλλά επίσης και από έναν μειωμένο κυτταρικό θάνατο στις ζώσες στιβάδες της επιδερμίδος. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία διαπιστώθηκε ότι υπό αγωγή και με τα δύο θεραπευτικά σχήματα επέρχεται ομαλοποίηση της εκφράσεως της bcl-2 στην ψωριασική διατυπωθεί η υπόθεση ότι τα ευρήματα της παρούσης εργασίας σε σχέση με αυτές τις δύο πρωτεΐνες συνδέονται με την υποστροφή των ψωριασικών αλλοιώσεων και όχι με τους μηχανισμούς θεραπευτικής δράσεως των χορηγηθέντων φαρμάκων. Τόσο υπό ασιτρετίνη όσο και υπό ανθραλίνη + καλσιποτριόλη παρατηρήθηκε μια σημαντική μείωση της εκφράσεως της πρωτεΐνης bcl-x στα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδος της ψωριασικής επιδερμίδος. Το εύρημα αυτό σε συνδυασμό με την αντιαποπτωτική δράση της πρωτεΐνης bcl-x στην ψωριασική επιδερμίδα έχει ιδιαίτερη σημασία, αφού η μείωση της εκφράσεως της πρωτεΐνης αυτής υπό θεραπεία ίσως να συμμετέχει στους μηχανισμούς αντιψωριασικής δράσεως των χορηγηθέντων φαρμάκων αφού συνεπάγεται την είσοδο των ψωριασικών κερατινοκυττάρων στην απόπτωση. / Apoptosis or programmed cell death is a phenomenon of crucial importance for the growth, differentiation and maintenance of the integrity of tissues. However, it is well known that excessive or insufficient activation of apoptotic mechanisms can lead to the clinical manifestation of various diseases. Apoptosis is characterized by specific morphological and biochemical alterations, whereas its regulation is genetically determined by the induction or suppression of various oncogenes. Regulatory control of apoptosis is achieved through mechanisms in which proteins encoded by the bcl-2 gene family are involved. Thus, bcl-2 and bcl-xL inhibit the apoptotic process, whereas bax is a proapoptotic protein. Psoriasis is a chronic relapsing inflammatory genodermatosis affecting 1%-3% of general population. Plaque-type psoriasis, the most common form of the disease, is clinically characterized by the appearance of well-circumscribed erythematosquamous lesions in genetically predisposed individuals. On light microscopy, psoriatic lesions reveal marked acanthosis, incomplete maturation of keratinocytes, inflammatory infiltration of the dermis (CD4+) and the epidermis (CD8+) and enhanced angiogenesis. The role of T-cell-mediated immune mechanisms in the triggering of the disease is of particular importance. Despite the considerable progress in the research on various aspects of psoriasis, the pathogenesis of this disorder still remains unclear. Psoriatic keratinocytes represent one of the most rapidly developing and proliferating cellular populations of human body. Theoretically, acanthosis of psoriatic epidermis may have been caused from both, keratinocyte hyperproliferation and decreased cell death in the living epidermal layers. In the present study a normalization of bcl-2 protein expression was observed in psoriatic epidermis under both types of treatment. After 3 and 6 weeks of treatment, the reduction in the expression of bax in the spinous layer of psoriatic epidermis was higher under acitretin, as compared to that seen under topical application of anthralin + calcipotriol, as compared to the pretreatment status. Taking into account the limited differences in the expression of bcl-2 and bax proteins between the two groups (with the intensity of staining inside the normal limits), as well as the apparent absense of contributory role of bcl-2 and bax proteins in the regulation of the apoptosis of psoriatic keratinocytes, we can suppose that the findings of the present study are related to the regression of psoriatic lesions and not to the therapeutic action of the drugs used. Under both therapeutic regimens bcl-x immunoreactivity was reduced in the spinous layer of psoriatic epidermis. This finding, in combination with the antiapoptotic action of bcl-x protein in psoriatic epidermis, is of particular importance since the reduction in the expression of this protein under treatment is possibly implicated in the mechanisms of therapeutic action of these drugs.

- / -

Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αντιψωριασικών φαρμάκων σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων με τη χρήση μικροσυστοιχιών DNA. Σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT χορηγήθηκαν τα παράγωγα του ρετινοϊκού οξέος all-trans retinoic acid (ATRA) και acitretin, σε διαβαθμισμένες δόσεις, προκειμένου να διαπιστωθεί η επίδραση τους στα κύτταρα. Μελετήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τις δοκιμασίες της χρωστικής Trypan Blue και ΜΤΤ. Επιλέχθηκαν δύο συγκεντρώσεις (10^-6 και 10^-8 Μ) των φαρμάκων που αντιστοιχούσαν σε βιωσιμότητα κυττάρων περίπου 80%, οι οποίες χορηγήθηκαν εκ νέου σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, έγινε εκχύλιση του RNA και έλεγχος της ποιότητας του με ηλεκτροφόρηση (Bioanalyzer). Το RNA χρησιμοποιήθηκε για την in vitro μεταγραφή cDNA που σημάνθηκε με φθοριοχρώματα και άμεσα ακολούθησε υβριδισμός σε πλακίδιο μικροσυστοιχιών (OneArray) το οποίο περιείχε ανιχνευτές για όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα μαζί με τους κατάλληλους μάρτυρες. Σε κάθε πλακίδιο υβριδίστηκαν ταυτόχρονα cDNA από κύτταρα στα οποία είχε χορηγηθεί ρετινοειδές και κύτταρα στα οποία δεν είχε χορηγηθεί. Η επεξεργασία των δεδομένων της σαρώσεως με ειδικό λογισμικό ανέδειξε 700 περίπου γονίδια που ρυθμίζονται θετικά ή αρνητικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τις μικροσυστοιχίες, επιλέχθηκαν 34 γονίδια τα οποία συμμετέχουν σε βασικές βιολογικές διεργασίες όπως πρωτεϊνοσύνθεση, κυτταρική σηματοδότηση, πολλαπλασιασμός, κυτταρική διαφοροποίηση, κυτταρικός θάνατος, φλεγμονή. Επιπρόσθετα, επιλέχθηκαν 22 γονίδια τα οποία έχουν επίσης κομβικό ρόλο σε σηματοδοτικά μονοπάτια και κυτταρικές λειτουργίες. Η επιλογή αυτή έγινε για να μελετηθεί πιο σφαιρικά η επίδραση των φαρμάκων σε βασικούς κυτταρικούς μοριακούς μηχανισμούς. Στο σύνολο των επιλεγμένων γονιδίων έγινε ποσοτική Real-Time PCR και για το σκοπό αυτό έγινε σχεδιασμός ειδικών εκκινητών. Η qRT-PCR εν τέλει, επιβεβαίωσε τα αρ-χικά αποτελέσματα από τα microarrays. Διαπιστώθηκε ότι η κυτταρική απόκριση στη χορήγηση των ρετινοειδών, εξειδικευμένα για κάθε δραστική ουσία και για κάθε δόση δεν είναι μονοσήμαντη, αλλά ότι ταυτόχρονα επάγονται λειτουργικά μονοπάτια με διαφορετικούς ρόλους. Επίσης διαπιστώθηκε ότι η μεταβολή κατά δύο τάξεις μεγέθους της δόσης που προσλαμβάνουν τα κύτταρα επάγει αντίρροπες κυτταρικές αποκρίσεις. Συγκεκριμένα, η ολιστική προσέγγιση της μεταβολής της γονιδιακής έκφρασης ανέδειξε ότι η χορήγηση ATRA σε συγκέντρωση 10^-6Μ στις κυτταροκαλλιέργειες ευνοεί την πρωτεϊνοσύνθεση και την διαφοροποίηση των κυττάρων ενώ ασκεί αντιφλεγμονώδη δράση. Η χορήγηση της δραστικής ουσίας ATRA στη δόση 10^-8Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων HaCaT σε μεγαλύτερο βαθμό από τον πολλαπλασιασμό τους. Επιπλέον, φαίνεται ότι σε αντίθεση με τη μεγαλύτερη δόση, ευνοείται η σύνθεση μορίων που επάγουν την φλεγμονή. Παρόμοια, η ασιτρετίνη στη δόση 10^-6Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων και την σύνθεση μορίων που επάγουν τη φλεγμονή. Η ασιτρετίνη στην μικρότερη δόση (10^-8 Μ) ευνοεί κύρια την διαφοροποίηση, λιγότερο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και φαίνεται ότι προάγει σε σημαντικό βαθμό την απόπτωση. Οι μεγαλύτερες δόσεις των ρετινοειδών που μελετήθηκαν φαίνεται ότι είναι απαγορευτικές για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αντίθεση με τις μικρότερες δόσεις. Επισημαίνεται ότι για τη θεραπεία της ψωρίασης όπου χρησιμοποιούνται, επιθυμητές δράσεις είναι η παραγωγή μορίων με αντιφλεγμονώδη δράση, ο περιορισμός του αυξημένου κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αύξηση της κυτταρικής απόπτωσης και τέλος πολύ ση-μαντικό είναι η επιτυχής περάτωση της διαφοροποίησης των κυττάρων. Συμπερασματικά, η χρήση τεχνικών υψηλής απόδοσης, κύρια των μικροσυστοιχιών cDNA που επιτρέπουν την εκτεταμένη μελέτη του γονιδιώματος και της qRT-PCR για πιο στοχευμένη μελέτη, μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην εξακρίβωση μοριακών μηχανισμών. / In the current project we performed gene expression profiling, using cDNA microarrays, when specific doses of derivatives of retinoic acid were applied in HaCaT cell culture. These specific drugs are used in the treatment of psoriasis but their exact effect in molecular level remains elusive. All-trans retinoic acid and acitretin were applied in gradient doses. Cell viability was monitored using MTT and Trypan blue assays. Two specific doses (10^-6 & 10^-8 M), in which cell viability was approximately 80%, were chosen for the treatment of HaCaT cells. Subsequently, the treated cells were collected and RNA was extracted using standard methods. At a next step, RNA quality was examined by electrophoresis (Bioanalyzer) and spectrometry. High quality RNA showing no traces of degradation was used as template for in vitro transcription. Finally, synthesis of fluoro-labeled cDNA was performed from RNA derived from both treated and untreated samples and was immediately hybridized to DNA microarray slides (OneArray). Analysis of the hybridization data was performed using specific software. As a result, 700 genes (both up-regulated and down-regulated) were chosen for further analysis. Among them, 34 genes were chosen to validate the microarrays results by the use of quantitative Real-Time PCR. These genes appeared to play crucial role in basic cellular functions like protein synthesis, signal transduction, cell death, cell differentiation and proliferation. Furthermore, 22 additional essential genes that are related to the above processes were chosen in aim to examine drugs effects. The data processing revealed that the 10^-6 M dose of ATRA has a positive effect in protein synthesis, cell differentiation and anti-inflammatory action. Moreover ATRA at a concentration of 10^-8 M promotes differentiation more than proliferation and it has inflammatory effect as well as acitretin has in 10^-6 M dose. On the other, hand acitretin in 10^-8 M dose facilitates differentiation more than proliferation but mainly induces cell death. Generally, high doses (10-6 M) of the drugs inhibit cell proliferation more efficient than low doses (10-8 M). In fact, during psoriasis treatment, the anti-inflammatory action, inhibition of cell proliferation, induction of cell differentiation and cell death are considered desirable drug effects. Our study shows that cDNA microarray analysis represents a powerful tool that can be used for extended genomic studies and the results that are obtained can be validated and used for the elucidation of several molecular mechanisms.