Η ασιτρετίνη, τα ψωραλένια και η μινοξιδίλη αποτελούν φάρμακα επιλογής για την αντιμετώπιση δερματικών ασθενειών (ψωρίαση, καρκίνος δέρματος, λεύκη, ανδρογενής αλωπεκία). Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναπτύχθηκαν συγκλίνουσες συνθετικές μεθοδολογίες για την ολική σύνθεση αναλόγων της ασιτρετίνης με μεταβολές στο λιπόφιλο τμήμα της. Επιπλέον, τροποποιήθηκαν με χημικό τρόπο ψωραλένια, όπως το τριοξαλένιο, το μπερκαπτένιο και το ξανθοτοξένιο και συντέθηκε μια πληθώρα υβριδικών αναλόγων και συζευγμάτων τους με όξινα ρετινοειδή. Τέλος, αναπτύχθηκαν μεθοδολογίες για την ολική σύνθεση αναλόγων και συζευγμάτων της μινοξιδίλης με πολυαμίνες και άλλα βιοδραστικά μόρια. / Acitretin, Psoralens and Minoxidil are the drug of choice for the treatment of several dermatological disorders, such as psoriasis, vitiligo, cancer and adrogenic alopecia. In the context of the present thesis we developed efficient convergent synthetic methodologies for the total syntheses of acitretin analogs, incorporating changes in the lipophilic part. Moreover, psoralens, such as trioxsalen, bergapten and xanthotoxin, were chemically modified, in order to synthesize, hybrid analogs and conjugates with acidic retinoids. Finally, we developed efficient synthetic methodologies for the total synthesis of analogs and conjugates of Minoxidil with polyamines and other molecules with biological interest.

Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αντιψωριασικών φαρμάκων σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων με τη χρήση μικροσυστοιχιών DNA. Σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT χορηγήθηκαν τα παράγωγα του ρετινοϊκού οξέος all-trans retinoic acid (ATRA) και acitretin, σε διαβαθμισμένες δόσεις, προκειμένου να διαπιστωθεί η επίδραση τους στα κύτταρα. Μελετήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τις δοκιμασίες της χρωστικής Trypan Blue και ΜΤΤ. Επιλέχθηκαν δύο συγκεντρώσεις (10^-6 και 10^-8 Μ) των φαρμάκων που αντιστοιχούσαν σε βιωσιμότητα κυττάρων περίπου 80%, οι οποίες χορηγήθηκαν εκ νέου σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, έγινε εκχύλιση του RNA και έλεγχος της ποιότητας του με ηλεκτροφόρηση (Bioanalyzer). Το RNA χρησιμοποιήθηκε για την in vitro μεταγραφή cDNA που σημάνθηκε με φθοριοχρώματα και άμεσα ακολούθησε υβριδισμός σε πλακίδιο μικροσυστοιχιών (OneArray) το οποίο περιείχε ανιχνευτές για όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα μαζί με τους κατάλληλους μάρτυρες. Σε κάθε πλακίδιο υβριδίστηκαν ταυτόχρονα cDNA από κύτταρα στα οποία είχε χορηγηθεί ρετινοειδές και κύτταρα στα οποία δεν είχε χορηγηθεί. Η επεξεργασία των δεδομένων της σαρώσεως με ειδικό λογισμικό ανέδειξε 700 περίπου γονίδια που ρυθμίζονται θετικά ή αρνητικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τις μικροσυστοιχίες, επιλέχθηκαν 34 γονίδια τα οποία συμμετέχουν σε βασικές βιολογικές διεργασίες όπως πρωτεϊνοσύνθεση, κυτταρική σηματοδότηση, πολλαπλασιασμός, κυτταρική διαφοροποίηση, κυτταρικός θάνατος, φλεγμονή. Επιπρόσθετα, επιλέχθηκαν 22 γονίδια τα οποία έχουν επίσης κομβικό ρόλο σε σηματοδοτικά μονοπάτια και κυτταρικές λειτουργίες. Η επιλογή αυτή έγινε για να μελετηθεί πιο σφαιρικά η επίδραση των φαρμάκων σε βασικούς κυτταρικούς μοριακούς μηχανισμούς. Στο σύνολο των επιλεγμένων γονιδίων έγινε ποσοτική Real-Time PCR και για το σκοπό αυτό έγινε σχεδιασμός ειδικών εκκινητών. Η qRT-PCR εν τέλει, επιβεβαίωσε τα αρ-χικά αποτελέσματα από τα microarrays. Διαπιστώθηκε ότι η κυτταρική απόκριση στη χορήγηση των ρετινοειδών, εξειδικευμένα για κάθε δραστική ουσία και για κάθε δόση δεν είναι μονοσήμαντη, αλλά ότι ταυτόχρονα επάγονται λειτουργικά μονοπάτια με διαφορετικούς ρόλους. Επίσης διαπιστώθηκε ότι η μεταβολή κατά δύο τάξεις μεγέθους της δόσης που προσλαμβάνουν τα κύτταρα επάγει αντίρροπες κυτταρικές αποκρίσεις. Συγκεκριμένα, η ολιστική προσέγγιση της μεταβολής της γονιδιακής έκφρασης ανέδειξε ότι η χορήγηση ATRA σε συγκέντρωση 10^-6Μ στις κυτταροκαλλιέργειες ευνοεί την πρωτεϊνοσύνθεση και την διαφοροποίηση των κυττάρων ενώ ασκεί αντιφλεγμονώδη δράση. Η χορήγηση της δραστικής ουσίας ATRA στη δόση 10^-8Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων HaCaT σε μεγαλύτερο βαθμό από τον πολλαπλασιασμό τους. Επιπλέον, φαίνεται ότι σε αντίθεση με τη μεγαλύτερη δόση, ευνοείται η σύνθεση μορίων που επάγουν την φλεγμονή. Παρόμοια, η ασιτρετίνη στη δόση 10^-6Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων και την σύνθεση μορίων που επάγουν τη φλεγμονή. Η ασιτρετίνη στην μικρότερη δόση (10^-8 Μ) ευνοεί κύρια την διαφοροποίηση, λιγότερο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και φαίνεται ότι προάγει σε σημαντικό βαθμό την απόπτωση. Οι μεγαλύτερες δόσεις των ρετινοειδών που μελετήθηκαν φαίνεται ότι είναι απαγορευτικές για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αντίθεση με τις μικρότερες δόσεις. Επισημαίνεται ότι για τη θεραπεία της ψωρίασης όπου χρησιμοποιούνται, επιθυμητές δράσεις είναι η παραγωγή μορίων με αντιφλεγμονώδη δράση, ο περιορισμός του αυξημένου κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αύξηση της κυτταρικής απόπτωσης και τέλος πολύ ση-μαντικό είναι η επιτυχής περάτωση της διαφοροποίησης των κυττάρων. Συμπερασματικά, η χρήση τεχνικών υψηλής απόδοσης, κύρια των μικροσυστοιχιών cDNA που επιτρέπουν την εκτεταμένη μελέτη του γονιδιώματος και της qRT-PCR για πιο στοχευμένη μελέτη, μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην εξακρίβωση μοριακών μηχανισμών. / In the current project we performed gene expression profiling, using cDNA microarrays, when specific doses of derivatives of retinoic acid were applied in HaCaT cell culture. These specific drugs are used in the treatment of psoriasis but their exact effect in molecular level remains elusive. All-trans retinoic acid and acitretin were applied in gradient doses. Cell viability was monitored using MTT and Trypan blue assays. Two specific doses (10^-6 & 10^-8 M), in which cell viability was approximately 80%, were chosen for the treatment of HaCaT cells. Subsequently, the treated cells were collected and RNA was extracted using standard methods. At a next step, RNA quality was examined by electrophoresis (Bioanalyzer) and spectrometry. High quality RNA showing no traces of degradation was used as template for in vitro transcription. Finally, synthesis of fluoro-labeled cDNA was performed from RNA derived from both treated and untreated samples and was immediately hybridized to DNA microarray slides (OneArray). Analysis of the hybridization data was performed using specific software. As a result, 700 genes (both up-regulated and down-regulated) were chosen for further analysis. Among them, 34 genes were chosen to validate the microarrays results by the use of quantitative Real-Time PCR. These genes appeared to play crucial role in basic cellular functions like protein synthesis, signal transduction, cell death, cell differentiation and proliferation. Furthermore, 22 additional essential genes that are related to the above processes were chosen in aim to examine drugs effects. The data processing revealed that the 10^-6 M dose of ATRA has a positive effect in protein synthesis, cell differentiation and anti-inflammatory action. Moreover ATRA at a concentration of 10^-8 M promotes differentiation more than proliferation and it has inflammatory effect as well as acitretin has in 10^-6 M dose. On the other, hand acitretin in 10^-8 M dose facilitates differentiation more than proliferation but mainly induces cell death. Generally, high doses (10-6 M) of the drugs inhibit cell proliferation more efficient than low doses (10-8 M). In fact, during psoriasis treatment, the anti-inflammatory action, inhibition of cell proliferation, induction of cell differentiation and cell death are considered desirable drug effects. Our study shows that cDNA microarray analysis represents a powerful tool that can be used for extended genomic studies and the results that are obtained can be validated and used for the elucidation of several molecular mechanisms.

Os doentes transplantados renais têm alto risco para desenvolver queratoses actínicas e câncer de pele. Para verificar o efeito quimioprofilático da acitretina estudamos a evolução de 13 doentes transplantados renais com queratoses actínicas múltiplas e história de carcinomas cutâneos submetidos a tratamento por 12 meses (20mg/dia). Fez-se a avaliação clínica e laboratorial regularmente em todo o período do estudo. Realizou-se exame histopatológico, demonstração imuno-histoquímica de sub-populações de linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer e células de Langerhans, sua quantificação e comparação em biopsias de pele, sem lesão, de área exposta e protegida do sol antes, após seis e 12 meses de tratamento. Observou-se melhora das lesões cutâneas e ausência de aparecimento de novos tumores em 12 dos 13 pacientes. Não ocorreram alterações laboratoriais relacionadas a função renal, hepatotoxicicidade e hiperlipidemia. Não houve diferenças significativas histopatológicas e da população de linfócitos T e células natural killer da pele exposta e protegida do sol com o tratamento. Verificou-se aumento numérico de células de Langerhans epidérmicas aos 12 meses quando comparado aos da pele antes e após seis meses de tratamento (p = 0,002 e p = 0,003). Em nossa casuística o uso de acitretina em doses baixas foi útil para melhorar o aspecto cutâneo e prevenir lesões cutâneas pré-cancerosas e carcinomas. O aumento das células de Langerhans epidérmicas estaria relacionado ao efeito imunomodular da acitretina. / Renal transplant recipients have an increased incidence of actinic keratosis and skin cancer. In order to examine the chemoprophylatic effects of low-dose acitretin on skin cancer development we submitted 13 renal transplanted patients to acitretin therapy (20 mg/day) for 12 month. The patients were assessed at monthly intervals during the first 6 months and every two months until the 12th month for new skin lesions and for acitretin toxicity. Normal skin biopsies of sun exposed and sun protected area were taken for histopathological exam and submitted to immunohistochemistry technique to demonstrate CD4+ and CD8+ T lymphocytes, natural killer cells and Langerhans cells wich were counted and compared in the beginning, after 6th month and 12th month of the treatment. There was an improvement of actinic keratosis and all patients but one did not develop new skin cancer. Side-effects were well-tolerated and no significant biochemical effects were observed. Although there were no differences in the microscopic aspects of the skin and in the number of CD4+ and CD8+ T lymphocytes and natural killer cells, there was a significant increase in the number of epidermal Langerhans cells after 12 months of acitretin therapy. The data obtained permit us to conclude that low dose acitretin therapy is safe, well-tolerated and partially effective in chemoprophylaxis of skin cancer in renal transplant recipients. The increase in epidermal Langerhans cells observed may be an expression of the immunomodulatory effect of acitretin.

Os doentes transplantados renais têm alto risco para desenvolver queratoses actínicas e câncer de pele. Para verificar o efeito quimioprofilático da acitretina estudamos a evolução de 13 doentes transplantados renais com queratoses actínicas múltiplas e história de carcinomas cutâneos submetidos a tratamento por 12 meses (20mg/dia). Fez-se a avaliação clínica e laboratorial regularmente em todo o período do estudo. Realizou-se exame histopatológico, demonstração imuno-histoquímica de sub-populações de linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer e células de Langerhans, sua quantificação e comparação em biopsias de pele, sem lesão, de área exposta e protegida do sol antes, após seis e 12 meses de tratamento. Observou-se melhora das lesões cutâneas e ausência de aparecimento de novos tumores em 12 dos 13 pacientes. Não ocorreram alterações laboratoriais relacionadas a função renal, hepatotoxicicidade e hiperlipidemia. Não houve diferenças significativas histopatológicas e da população de linfócitos T e células natural killer da pele exposta e protegida do sol com o tratamento. Verificou-se aumento numérico de células de Langerhans epidérmicas aos 12 meses quando comparado aos da pele antes e após seis meses de tratamento (p = 0,002 e p = 0,003). Em nossa casuística o uso de acitretina em doses baixas foi útil para melhorar o aspecto cutâneo e prevenir lesões cutâneas pré-cancerosas e carcinomas. O aumento das células de Langerhans epidérmicas estaria relacionado ao efeito imunomodular da acitretina. / Renal transplant recipients have an increased incidence of actinic keratosis and skin cancer. In order to examine the chemoprophylatic effects of low-dose acitretin on skin cancer development we submitted 13 renal transplanted patients to acitretin therapy (20 mg/day) for 12 month. The patients were assessed at monthly intervals during the first 6 months and every two months until the 12th month for new skin lesions and for acitretin toxicity. Normal skin biopsies of sun exposed and sun protected area were taken for histopathological exam and submitted to immunohistochemistry technique to demonstrate CD4+ and CD8+ T lymphocytes, natural killer cells and Langerhans cells wich were counted and compared in the beginning, after 6th month and 12th month of the treatment. There was an improvement of actinic keratosis and all patients but one did not develop new skin cancer. Side-effects were well-tolerated and no significant biochemical effects were observed. Although there were no differences in the microscopic aspects of the skin and in the number of CD4+ and CD8+ T lymphocytes and natural killer cells, there was a significant increase in the number of epidermal Langerhans cells after 12 months of acitretin therapy. The data obtained permit us to conclude that low dose acitretin therapy is safe, well-tolerated and partially effective in chemoprophylaxis of skin cancer in renal transplant recipients. The increase in epidermal Langerhans cells observed may be an expression of the immunomodulatory effect of acitretin.