Η χρονική και χωρική ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής του DNA συντονίζεται από τη διαδικασία της «αδειοδότησης της αντιγραφής», η οποία εξασφαλίζει ότι η αντιγραφή θα λάβει χώρα μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Η αδειοδότηση της αντιγραφής περιλαμβάνει την κατά βήμα συγκρότηση ενός συμπλόκου πρωτεϊνών, του προαντιγραφικού συμπλόκου, στις περιοχές έναρξης της αντιγραφής. Μείζον συστατικό του συμπλόκου αυτού είναι η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία επίσης αποτελεί πρωτεολυτικό στόχο των σημείων ελέγχου κυττάρων που φέρουν βλάβες στο DNA. Στα μετάζωα, υπάρχει μια μικρή πρωτεΐνη καλούμενη Geminin, η οποία προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, αναστέλλοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής. Η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με ομοιοτικούς μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες που αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη και πιστεύεται ότι αποτελεί πιθανό κρίκο που συνδέει τις διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε πως η πρωτεΐνη Geminin κατατμείται σε πρωτογενή κύτταρα και καρκινικές κυτταρικές σειρές που οδηγούνται προς απόπτωση. Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin διαμεσολαβείται από την κασπάση- 3 τόσο in vivo όσο και in vitro. Δύο περιοχές στο καρβοξυτελικό τμήμα της Geminin (Κ1 και Κ2), στοχεύονται κατά την απόπτωση προκαλώντας τη δημιουργία θρυσμάτων της πρωτεΐνης Geminin. Δείξαμε ότι η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin στη θέση Κ1 προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο και ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης από την κινάση Casein Kinase II. Αντίθετα, μετά από κατάτμηση στη θέση Κ2, η πρωτεΐνη Geminin χάνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη Brm, καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης SWI/SNF, ενώ διατηρεί την ικανότητα να προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, υποδεικνύοντας πως η στόχευση της πρωτεΐνης Geminin κατά την απόπτωση, επηρεάζει διαφορικά τη λειτουργία του μορίου. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε τη ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο και στο χρόνο σε κύτταρα με βλάβες στο DNA. Για το σκοπό αυτό, χαρακτηρίσαμε μια μέθοδο που προκαλεί εντοπισμένες βλάβες στο DNA των κυττάρων, βασιζόμενη στη χρήση ενός παλμικού UVA laser. Με τη χρήση της μεθόδου αυτής, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης τόσο σε καρκινικά όσο και πρωτογενή κύτταρα, παράλληλα με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση στη βλάβη (γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70, pATM κ.ά.). Η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 λαμβάνει χώρα ταχύτατα και προηγείται της αποικοδόμησής της. Με τη δημιουργία μεταλλαγμένων μορφών της πρωτεΐνης Cdt1 και την καταστολή της έκφρασης πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη Cdt1 με τη χρήση siRNA, δείξαμε πως η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης απαιτεί αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη PCNA. Βρέθηκε πως η πρωτεΐνη Cdt2, που αποτελεί μέλος του συμπλόκου της λιγάσης της ουβικουϊτίνης Cul4-DDB1Cdt2 επίσης στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης. Ποσοτικοποίηση της κινητικής συσσώρευσης πρωτεϊνών στην περιοχή της βλάβης έδειξε ότι η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 υφίσταται κορεσμό νωρίτερα από τις πρωτεΐνες PCNA και Cdt2, ενώ αποσιώπηση της πρωτεΐνης Cdt1 δεν επηρεάζει τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών PCNA και Cdt2. Πειράματα προσδιορισμού κινητικών αλληλεπιδράσεων με τη μέθοδο FRAP, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη PCNA παραμένει σταθερά προσδεδεμένη στην περιοχή της βλάβης, ενώ η πρωτεΐνη Cdt1 εμφανίζει ιδιαίτερα γρήγορη κινητική. Οι μελέτες αυτές οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η πρόκληση εντοπισμένης βλάβης στο DNA οδηγεί σε εντοπισμένη κυτταρική απόκριση και στη στρατολόγηση της πρωτεΐνης PCNA στην περιοχή της βλάβης η οποία δρά ως ικρίωμα για τη δυναμική αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Cdt1. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της διδακτορική διατριβής περιγράφεται για πρώτη φορά ότι η πρωτεϊνη Geminin στοχεύεται για κατάτμηση κατά την απόπτωση, διαλευκάνονται τα μοριακά μονοπάτια που ρυθμίζουν το φαινόμενο αυτό και διερευνάται η φυσιολογική του σημασία. Προτείνεται ότι η στόχευση της Geminin από την κασπάση 3 επηρεάζει τη φυσιολογική ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής δείχνεται ότι η πρωτεϊνη Cdt1 στρατολογείται σε περιοχές της χρωματίνης που φέρους βλάβες στο DNA. Η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης, παράλληλα με πρωτεϊνες απόκρισης στη βλάβη όπως οι BRCA1, pATM και Ku70, οδηγεί σε μία νέα υπόθεση για πιθανή εμπλοκή της πρωτεϊνης Cdt1 στην κυτταρική απόκριση σε βλάβες στο DNA. / The timely initiation of DNA replication is achieved through a process called licensing, which ensures that only after passage through mitosis the chromatin becomes competent for a new round of DNA replication. Licensing involves the stepwise formation of a multiprotein complex at the origins of replication, called prereplicative complex. A major component of this complex is Cdt1, which is also a critical and evolutionarily conserved proteolytic target of the DNA damage checkpoint. In metazoans, a small protein called Geminin binds to Cdt1, inhibiting replication licensing. Geminin has been proposed to coordinate cell cycle and differentiation events through balanced interactions with the cell cycle regulator Cdt1 and with homeobox transcription factors and chromatin remodeling activities implicated in cell fate decisions. Here we show that Geminin is cleaved in primary cells and cancer cell lines induced to undergo apoptosis by a variety of stimuli. Geminin targeting is mediated by caspase-3 both in vivo and in vitro. Two sites at the carboxyl terminus of Geminin are cleaved by the caspase (termed K1 and K2), producing truncated forms of Geminin. We provide evidence that Geminin cleavage is regulated by phosphorylation by Casein kinase II. Geminin cleaved at site K1 has a proapoptotic effect. Geminin cleaved at the site K2 has lost the ability to interact with Brahma (Brm), a catalytic subunit of the SWI/SNF chromatin remodeling complex, while binding efficiently to Cdt1, indicating that targeting of Geminin during apoptosis differentially affects interactions with its binding partners. In the second part of this thesis, we investigated the spatiotemporal regulation of Cdt1 in DNA-damaged cells. We introduced and characterized a method of inducing localized DNA damage, based on a UVA-pulsed laser. Using this method, we show that Cdt1 is recruited at the site of damage in parallel to the recruitment of known response factors, such as γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70 etc. Cdt1 recruitment at the site of damage precedes its degradation in both cancer cell lines and primary cells. Mutated forms of Cdt1 and siRNA for Cdt1-interacting proteins show that Cdt1 accumulation at the site of damage requires interactions with the protein PCNA. In addition, we found that Cdt2, a member of the Cul4-DDB1Cdt2 complex that ubiquitinates Cdt1 after DNA damage, is recruited at the site of damage. Experiments of knocking down the protein expression using siRNA and quantification of the recruitment kinetics address the molecular interplay of these proteins for the recruitment at the site of damage, while FRAP experiments revealed their dynamics. Taken together our results suggest that following DNA damage, PCNA is recruited to the site of damage, and acts as a scaffold for the dynamic interaction of Cdt1 with the damaged sites. The accumulation of Cdt1 at the site of damage suggest a possible involvement this cell cycle regulator in the DNA damage response.

Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας προϋποθέτει τη σωστή διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Σημαντικό μηχανισμό ελέγχου αποτελεί η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η οποία εξασφαλίζει την πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1 και περιλαμβάνει τη συγκρότηση των προ-αντιγραφικών συμπλόκων στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από τις πρωτεΐνες MCM2-7 οι οποίες έχουν ενεργότητα ελικάσης. Σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης αποτελεί η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία συσσωρεύεται κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και απαιτείται για τη στρατολόγηση των ελικασών MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Στα μετάζωα, η πρωτεΐνη Geminin, η οποία εκφράζεται κατά τις φάσεις S, G2 και Μ, αποτελεί αναστολέα του παράγοντα Cdt1 και προσδένεται σε αυτόν παρεμποδίζοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής. Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι η εκτοπική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 επάγει την επανέναρξη της αντιγραφής του DNA και τον υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος συμβάλλοντας στην ογκογένεση. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας μελετήθηκε η έκφραση του παράγοντα Cdt1 σε κλινικά δείγματα όγκων μαστού. Από την ανάλυση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 υπερεκφράζεται στατιστικώς σημαντικά στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό, γεγονός που καταδεικνύει την πιθανή αξία του παράγοντα ως διαγνωστικού βιοδείκτη. Επιπλέον, η υπερέκφραση του συγκεκριμένου παράγοντα δείχθηκε ότι συσχετίζεται αντίστροφα με την παρουσία ή μη οιστρογονικών (ER) και προγεστερονικών υποδοχέων (PR). Επίσης, διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και της έκφρασης του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 καθώς και του υποδοχέα HER2/neu. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι ο παράγοντας Cdt1 ενδέχεται να αποτελεί δείκτη άσχημης πρόγνωσης στον όγκο μαστού. Επιπλέον η ανάλυση κατέδειξε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 σε όγκους θετικούς για τον υποδοχέα HER2/neu σε σύγκριση με τα περιστατικά που δεν εξέφραζαν τον υποδοχέα. Δεδομένου ότι στο 95% των περιπτώσεων όγκων μαστού όπου διαπιστώνεται υπερέκφραση του υποδοχέα HER2/neu, αυτή οφείλεται σε ενίσχυση του αντίστοιχου γονιδίου, διερευνήθηκε κατά πόσο η γονιδιακή ενίσχυση θα μπορούσε να αποτελεί λειτουργική επίπτωση της ογκογόνου δράσης του παράγοντα Cdt1 στον όγκο μαστού. Η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης Cdt1 και Cdc6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και MCF7 είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη. Έχει δειχθεί ότι η ανθεκτικότητα στο φάρμακο αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη γονιδιακή ενίσχυση του ενζύμου διυδροφολική αναγωγάση (DHFR). Συνεπώς, είναι πιθανό η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 να συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας μελετήθηκε η κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM2-7 με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας. Αρχικά αναπτύχθηκε ένα σύστημα μελέτης το οποίο βασίζεται στις μεθόδους FRAP και FLIP και επιτρέπει τη μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM και κατ’ επέκταση τη χωροχρονική ποσοτική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα. Η ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 7. Περίληψη - Abstract - 212 - αποκάλυψε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την αντίστοιχη του παράγοντα Cdt1, καθώς οι πρωτεΐνες MCM παρουσιάζουν πιο σταθερή αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη. Επίσης, διαπιστώθηκε σταδιακή πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1, περαιτέρω πρόσδεση μορίων MCM στο τέλος της φάσης αυτής και σταδιακή αποδέσμευση αυτών από τη χρωματίνη καθώς εξελίσσεται η φάση S. Πειράματα FLIP αποκάλυψαν ότι η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένες υποπυρηνικές περιοχές. Οι περιοχές αυτές αυξάνονται σε αριθμό με την πρόοδο της φάσης G1 και ελαττώνονται με την εξέλιξη της φάσης S. Η παρατήρηση των υποπεριοχών αυτών κατά τη φάση S κατέδειξε ότι δεν συμπίπτουν με τις υποδομές της πρωτεΐνης PCNA, γεγονός που υποδεικνύει ότι οι πρωτεΐνες MCM2-7 δεν εντοπίζονται στις περιοχές σύνθεσης του DNA. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πιθανή επίδραση της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin είχαν ως αποτέλεσμα τη μείωση του δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 κατά τη διάρκεια της φάσης G1, καθώς και την αποσταθεροποίηση των ήδη δεσμευμένων μορίων στο τέλος της φάσης αυτής. Επίσης, η απουσία της πρωτεΐνης Geminin είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία των κυττάρων να εισέλθουν στη φάση S. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας καταδείχθηκε η πιθανή αξία του παράγοντα Cdt1 ως διαγνωστικού και προγνωστικού βιοδείκτη στον όγκο μαστού. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 πιθανώς συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης, παρατήρηση που προτείνει ένα νέο μηχανισμό ογκογόνου δράσης του παράγοντα αυτού. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διαπιστώθηκε ότι η κινητική των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 αλλάζει κατά τη διάρκεια των φάσεων G1 και S. Επίσης, η πρωτεΐνη Geminin δείχθηκε ότι απαιτείται για την πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη και για την πρόοδο των κυττάρων από τη φάση G1 στη φάση S, παρατήρηση που καταδεικνύει ένα πιθανό θετικό ρόλο της πρωτεΐνης Geminin στην αντιγραφή του DNA. / Tight regulation of the DNA replication initiation is crucial for the maintenance of genomic integrity. Faithful replication in time and space is ensured by a process called DNA licensing, which takes place in late mitosis and during G1 phase. Licensing involves the stepwise assembly of pre-replicative complexes at origins of replication. These complexes render DNA origins competent to initiate replication. Cdt1 is an essential regulator of DNA licensing that accumulates only in G1 phase of the cell cycle and is required for the recruitment of MCM2-7 helicases onto replication origins. In metazoans, Cdt1 is negatively regulated by a protein called Geminin, which is expressed from S to M phases. Geminin binds to Cdt1 preventing replication licensing. Several lines of evidence suggest that Cdt1 overexpression in cell lines and animals drives rereplication and contributes to genomic instability. In the first part of this thesis, Cdt1 expression levels were analyzed in breast cancer specimens. Cdt1 protein expression was correlated to clinicopathological parameters of the disease, proliferation index and HER2/neu status. Analysis revealed that Cdt1 was statistically significantly overexpressed in the invasive tumor areas compared to adjacent non-neoplastic tissue. Moreover, a significant inverse correlation was established between Cdt1 expression levels and oestrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) status. A significant positive correlation of Cdt1 expression with the proliferation index Ki67 was demonstrated. These observations imply that Cdt1 may constitute a useful prognostic and diagnostic biomarker for breast cancer. Additionally, Cdt1 expression levels were significantly higher in HER2/neu score 3+ tumors (known to show HER2/neu gene amplification by FISH in 95% of cases) compared to HER2/neu negative tumors (known to show HER2/neu gene amplification by FISH in only 0-7% of cases). This observation prompted us to investigate whether gene amplification is a direct consequence of Cdt1 overexperssion. To this end, Cdt1 and Cdc6 were overexpressed in HeLa and MCF7 cell lines. The overexperssion of these licensing factors resulted in the generation of methotrexate resistance colonies. Given that the major cause of resistance to methotrexate is the increased expression levels of the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) due to gene amplification, it is probable that Cdt1 overexpression may lead to this type of genomic instability. In the second part of this thesis, live cell imaging techniques were used to assess dynamics of licensing within the cell nucleus. In particular, we established an in vivo licensing assay, which is based on FRAP and FLIP techniques and permits the investigation of the kinetics of MCM helicases within live human cells. FRAP analysis of GFP-MCM2 and GFP-MCM4 kinetics revealed that MCMs maintain stable association with chromatin during G1 phase in contrast to Cdt1, which exhibits transient interaction with chromatin throughout G1 phase. Moreover it was shown that MCMs are gradually bound to chromatin as G1 phase progresses, being maximally bound in late G1, before the onset of DNA replication and are displaced from chromatin during the course of S phase. Fluorescence-Loss-In-Photobleaching (FLIP) experiments indicated that MCM-chromatin association is not homogenous throughout the nucleus but shows subnuclear concentrations which differ as cells progress through G1 and are adjacent to sites of ongoing DNA synthesis in S phase cells. Moreover, it was shown that Geminin is required for MCM proteins being stably bound to chromatin as well as for proper progression of 7. Περίληψη - Abstract - 214 - cells from G1 to S phase. Taken together our results suggest additional levels of regulation of MCM chromatin association during G1 and S phases. Furthermore, Geminin appears to have a positive regulatory role in DNA replication.

No description available.

Η geminin είναι ένα σχετικά καινούριο μόριο το οποίο διαθέτει καίριο ρόλο κατά την ανάπτυξη και την διαφοροποίηση, εξαιτίας του νευροποιητικού δυναμικού της, της ικανότητάς της να αλληλεπιδρά με μέλη των Hox και polycomb πρωτεϊνών, καθώς επίσης και να δρα σαν ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου, λειτουργώντας ως αναστολέας του παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, CDT1. Στα πλαίσια της εργασίας αυτής, κλωνοποιήσαμε το γονίδιο της geminin στο ποντίκι το οποίο αποτελείται από 7 εξώνια και καλύπτει μία περιοχή γύρω στα 10Kb. Σχεδιάσαμε και κλωνοποιήσαμε ένα πλασμιδιακό όχημα στόχευσης για το γονίδιο της mgeminin και εισήγαμε 3 θέσεις loxP στο γενωμικό locus αυτής, με σκοπό να δημιουργήσουμε υπό συνθήκη ελλειμματικούς ποντικούς για το γονίδιό της. Χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο φορέα στόχευσης αδρανοποιήσαμε το γονίδιο της Geminin σε pc3 (protamine Cre 3) πολυδύναμα κύτταρα ποντικού, δημιουργώντας ετερόζυγους ES κλώνους που φέρουν το «floxed» αλληλόμορφο, καθώς επίσης και το αλληλόμορφο αγρίου τύπου. Το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ελέγχθηκε τόσο με PCR όσο και με ανάλυση κατά Southern για την ορθότητα του ομόλογου ανασυνδυασμού. Ταυτοποιήσαμε 15 ορθά ανασυνδυασμένους ES κλώνους, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία υπό συνθήκη knockout ποντικών για το γονίδιο της geminin, μετά από έγχυση σε B6 βλαστοκύστεις και επακόλουθη μεταφορά αυτών σε θετές μητέρες. / Geminin is a novel bifunctional molecule with a pivotal role in the processes of differentiation and cell cycle regulation, due to its neuralizing potential, its ability to interact through Hox and polycomb group members, as well as in the inhibition of cell cycle progression through protein-protein interactions with the licensing factor Cdt1. We have cloned the mouse Geminin gene, which consists of 7 exons and spans approximately a region of 10Kb. We have generated a vector and introduced 3 loxP sites in the Geminin locus, in order to create conditional knockout mice. Using this knockout construct we inactivated the geminin locus in pc3 mouse embryonic stem cells, creating heterozygous ES clones, carrying a “floxed” and a “WT” allele for geminin. The mutant allele in the targeted ES cells has been verified with Southern blotting and PCR for the correct homologous recombination events. We identified 15 correctly targeted ES clones, which can be used for the generation of conditional geminin knockout mice, upon injection into B6 blastocysts and subsequent transfer to foster mothers.

Η δημιουργία του εγκεφαλικού φλοιού στηρίζεται στη διαδοχική εμφάνιση πληθυσμών προγονικών νευρώνων, οι οποίοι δίνουν γένεση σε νευρικά και γλοιακά κύτταρα. Κατά την νευρογένεση όλοι οι νευρώνες του εγκεφαλικού φλοιού προέρχονται από το νευροεπιθήλιο που βρίσκεται δίπλα από τις πλευρικές κοιλίες. Τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα αρχικά διαιρούνται με σκοπό την δημιουργία ικανού αριθμού πρόδρομων κυττάρων που θα δώσουν γένεση στον αναπτυσσόμενο φλοιό. Αργότερα, τα κύτταρα αυτά, διαφοροποιούνται προς τις άλλες κατηγορίες πρόδρομων κυττάρων και προς τους διαφοροποιημένους νευρώνες. Η πρωτεΐνη Geminin έχει προταθεί ως ένα μόριο που ρυθμίζει τόσο τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό όσο και την κυτταρική διαφοροποίηση. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος της πρωτεΐνης Geminin in vivo στη δημιουργία νευρώνων, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης της Geminin στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό του μυός κατά την Ε14.5 dpc. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δείχνουν ότι η υπερέκφραση της Geminin οδηγεί στην αύξηση του αριθμού των κυττάρων της ανώτερης στοιβάδας και μείωση του αριθμού των κυττάρων της κατώτερης στοιβάδας. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας προτείνουν ότι η Geminin συμμετέχει στη ρύθμιση του πληθυσμού των φλοιϊκών νευρώνων. / Cortical development is a highly ordered process, involving the timely orchestration of the appearance of different neural progenitor lineages, which succeed one another in order to generate the neurons and glia comprising the cortex.During neurogenesis, the cortical neurons are originated from the neuroepithelium that lies next to the lateral vesicles. At the beginning, neuroepithelial cells divide in order to expand their population and to create the number of progenitor cells that would give rise to the neurons and glia that comprise the cortex. Geminin has been shown to regulate cell proliferation, fate determination and organogenesis, representing a potential link between these processes. In order to investigate the in vivo role of Geminin in the creation of the cortical neurons, we performed overexpression experiments with of Geminin in the developing mouse cortex. Our results indicate that overexpression of Geminin in the developing cerebral cortex increases the number of the upper layer cells and reduces the number of the deep layer cells at E14.5 dpc. Our work suggests that Geminin is a molecule that participates in the regulation of the correct number of cortical progenitors and neurons in the cerebral cortex.

Μηχανισμοί οι οποίοι εξασφαλίζουν τη σωστή διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου συμβάλλουν στη διασφάλιση της γονιδιωματικής σταθερότητας των κυττάρων. Η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η συγκρότηση επί των αφετηριών της αντιγραφής του DNA του προ-ανιγραφικού συμπλόκου, καθορίζει τη σωστή χρονικά και τοπικά έναρξη της αντιγραφής. Βασικό συστατικό αυτού του συμπλόκου είναι ο παράγοντας Cdt1. Η Geminin προσδένεται στο Cdt1, αναστέλοντας τη δράση του από την S μέχρι και την Μ φάση, παρεμποδίζοντας, έτσι, την αδειοδότηση της αντιγραφής. Παρά το οτι φυσική αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών έχει δειχθεί τόσο in vitro όσο και in vivo, προηγούμενες μελέτες δείχνουν οτι έκφραση των Cdt1 και Geminin εντοπίζεται σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τα φυσιολογικά κύτταρα, ανάλογα με τα μηνύματα που δέχονται, είτε παραμένουν σε μιτωτικό κύκλο, είτε εξέρχονται από αυτόν προς φάση ηρεμίας (ή G0), διαφοροποίηση ή γήρανση. Αυστηρός συντονισμός των παραπάνω διαδικασιών είναι απαραίτητος προκειμένου να διασφαλιστεί η ομοιόσταση των πολύπλοκων δομών των ιστών των μεταζώων. Προηγούμενες μελέτες προτείνουν το σύστημα της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA ως έναν βασικό ρυθμιστή της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο και της επανεισόδου στη G1. Οι παράγοντες Cdt1 και Geminin ρυθμίζονται αρνητικά κατά την έξοδο των κυττάρων σε G0, ενώ έκφρασή τους χαρακτηρίζει διαιρούμενα κύτταρα. Σε αντίθεση με τις άλλες καταστάσεις εκτός κυτταρικού κύκλου, λίγα είναι γνωστά αναφορικά με τη ρύθμιση των Cdt1 και Geminin κατά την κυτταρική γήρανση. Στο πρώτο μέρος της διατριβής εστιαστήκαμε στη μελέτη του προτύπου έκφρασης των Cdt1 και Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου πρωτογενών ανθρώπινων ινοβλαστών, και στη σύγκρισή του με εκείνο των καρκινικών κυττάρων. Διαπιστώσαμε οτι τόσο η ενδοκυτταρική εντόπιση όσο και η ικανότητα των Cdt1 και Geminin να εκφράζονται σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, δεν διαφοροποιούνται στους πρωτογενείς φυσιολογικούς ινοβλάστες σε σχέση με κύτταρα που προέρχονται από καρκινικό ιστό. Επιπλέον, δείξαμε οτι ο παράγοντας Cdt1 εκφράζεται αποκλειστικά σε BrdU-αρνητικά κύτταρα, σε αντίθεση με την Geminin, η οποία δείχνει να συσσωρεύεται σταδιακά μετά την έναρξη της S φάσης, ενώ δεν εντοπίστηκε συνέκφραση των δύο πρωτεϊνών στο χρονικό παράθυρο της G1/S μετάβασης. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας εστιαστήκαμε στη μελέτη της έκφρασης του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 και του αρνητικού ρυθμιστή αυτού, Geminin, κατά την είσοδο των κυττάρων σε κυτταρική γήρανση και εξετάσαμε την πιθανή λειτουργική εμπλοκή τους στην εξέλιξη του φαινομένου. Δείξαμε οτι, ενώ οι παράγοντες Cdt1 και Geminin διατηρούν τη σωστή ενδοκυτταρική εντόπιση και το σωστό πρότυπο έκφρασης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, υφίστανται αρνητική ρύθμιση σε κύτταρα που εισέρχονται σε κυτταρική γήρανση, τόσο αναπαραγωγική όσο και πρόωρη, επαγόμενη από οξειδωτικό στρες. Το γεγονός οτι η μείωση της έκφρασης της Geminin προηγήθηκε της εμφάνισης του γηρασμένου φαινοτύπου, μας ώθησε στην περαιτέρω διερεύνιση του λειτουργικού ρόλου της Geminin στην επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης. Για το σκοπό αυτό, απορρυθμίσαμε τα επίπεδα έκφρασης της Geminin σε πρωτογενή φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπου και ποντικού, αξιοποιώντας την τεχνολογία του RNAi και ρετροϊικά συστήματα υπερέκφρασης γονιδίων αντίστοιχα. Δείξαμε οτι η μείωση της έκφρασης της Geminin σε ανθρώπινους ινοβλάστες (χρησιμοποιώντας siRNAs αλλά και pSUPER πλασμιδιακούς φορείς αποσιώπησης γονιδίων που κατασκευάστηκαν ειδικά για την Geminin) επάγει αύξηση της κυτταρικής γήρανσης της καλλιέργειας. Επιπλέον, κύτταρα που στερούνταν της έκφρασης της Geminin ήταν πιο επιρρεπή σε γήρανση επαγόμενη από οξειδωτικό στρες, σε σχέση με τα κύτταρα-μάρτυρες. Ετεροζυγώτες για το γονίδιο της Geminin εμβρυικοί ινοβλάστες ποντικού εμφάνιζαν μεγαλύτερα ποσοστά κυτταρικής γήρανσης σε σχέση με τους αντίστοιχους ινοβλάστες αγρίου τύπου. Αντίθετα, αύξηση των επιπέδων της Geminin σε αγρίου τύπου εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικού προκάλεσε μείωση της εμφανιζόμενης γήρανσης. Τέλος, η μείωση των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 σε ανθρώπινα κύτταρα ήταν, επίσης, σε θέση να επάγει ισχυρό φαινότυπο κυτταρικής γήρανσης. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα μας αναδεικνύουν την κρισιμότητα του ισοζυγίου Cdt1:Geminin στα κύτταρα, και προτείνουμε οτι η διατάραξη της ισορροπίας αυτής είναι ικανή να επάγει κυτταρική γήρανση, μέσω διαδικασιών όπως η υπεραδειοδότηση ή η υποαδειοδότηση της αντιγραφής του DNA. / Genome integrity relies on the strict alternation of S and M phases of the cell cycle, so that one and only round of DNA replication takes place per cell cycle. This is achieved through replication licensing, which involves the formation of a multi-protein complex, the pre-replicative complex, onto origins of replication. Cdt1 is a crucial component of this complex and Geminin, a small protein shown to tightly bind Cdt1, inhibits its licensing function from S to M phase, when licensing is illegitimate. Although previous experimental evidence shows that Cdt1 and Geminin are expressed in different phases of the cell cycle, physical interaction between these two proteins has been demonstrated in vitro as well as in vivo. The fate of a normal cell is not perpetual division. Cells may exit the mitotic cell cycle to enter quiescence, to terminally differentiate or to senesce. These “out-of-cycle-states” must be strictly regulated in order to establish and maintain the hierarchical organization of complex tissues in metazoa. Replication licensing has been proposed to coordinate cell-cycle exit and re-entry in vitro and in metazoan tissues. Cdt1 and Geminin down-regulation during exit to quiescence supports the idea that their expression correlates with cell proliferation. In contrast to other out-of-cycle states, little is known about the regulation of Cdt1 and Geminin expression during cellular senescence. Senescence refers to the irreversible resting state of cells grown for succeeding passages in culture, as a response to DNA damage caused by telomeres erosion. Other stimuli, such as oxidative or oncogenic stress, may force mitotically competent cells to respond similarly, a phenomenon termed as Stress Induced Premature Senescence (SIPS). The first part of this work focused on the study of the expression patterns of Cdt1 and Geminin during the unperturbed cell cycle of primary human fibroblasts and compared to that of tumor-derived cell lines. The cell cycle specific expression and the intracellular localization of both proteins, as assessed at a single-cell level using indirect immunofluorescence and a new monoclonal antibody against Geminin, appear similar in primary fibroblasts compared to the cancer cells examined. Cdt1 is strictly expressed in BrdU-negative cells, whereas Geminin starts accumulating after S phase onset. The two proteins are, therefore, not co-expressed at the ”time-window” of G1/S transition of the cell cycle. We showed that Cdt1 levels, but not those of Geminin, are mainly regulated in a proteasome-dependent way during normal cell cycle of human primary and cancer cells. The second part of this work focused on the investigation of Cdt1 and Geminin during cellular senescence and their possible role in the establishment of the senescence phenotype. To this end, primary human fibroblasts were maintained in culture for succeeding passages in order to induce them to undergo replicative senescence. Alternatively, an H202-induced senescence protocol was applied to force cells to undergo premature senescence (Stress-Induced Premature Senescence/SIPS). We show that, although Cdt1 and Geminin retain their nuclear localization and are correctly expressed during specific phases of the cell cycle during both replicative and Η202-induced premature senescence, their expression levels are down-regulated. In SIPS-experiments, Geminin down-regulation is an early event during the establishment of the senescent-phenotype, as assessed by senescence-associated β-Galactosidase and BrdU incorporation assays. This prompted us to further examine Geminin’s functional significance in the establishment of cellular senescence. To achieve this, we interfered with Geminin expression levels in human and mouse cells. Using RNA interference techniques, we were able to show that Geminin depletion from human cells is able to induce a senescent-phenotype in a fraction of the treated culture. Similarly, Geminin-depleted human cells were more susceptible to Η202-induced premature senescence, compared to control cells. Heterozygotes for Geminin mouse embryonic fibroblasts were more prone to senescence compared to their control counterparts. In contrast, when Geminin was over-expressed in control mouse embryonic fibroblasts cultures, senescent phenotype was reduced. Finally, a strong senescent-phenotype was induced when the licensing regulator, Cdt1, was silenced within human cells. Taken together, we conclude that Cdt1:Geminin balance within cells is crucial, and when disturbed, is able to promote a senescent phenotype, possibly through a mechanism that involves over- or under-licensing of DNA replication.

Η ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος ξεκινά από πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, τα οποία διαδοχικά δίνουν γένεση σε ενδιάμεσους πληθυσμούς προγονικών κυττάρων οι οποίοι σταδιακά χάνουν την ικανότητά τους για αυτοανανέωση και τελικά δίνουν γένεση στα πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα της μυελικής και λεμφικής σειράς. Η συγκεκριμένη διαδικασία στηρίζεται στο λεπτό συντονισμό της αυτοανανέωσης, αλλά και της διαφοροποίησης, απαιτεί δε την έκφραση διαφορετικών γονιδίων που σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, τη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων, αλλά και συμπλόκων αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση. Η geminin έχει προταθεί ότι ρυθμίζει την απόφαση ενός κυττάρου για πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση. Αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες, με σύμπλοκα αναδιάταξης της δομής της χρωματίνης, ρυθμίζοντας την έκφραση γονιδίων που ελέγχουν τη νευρωνική διαφοροποίηση. Παράλληλα, δρα σαν αναστολέας του κυτταρικού κύκλου, προσδενόμενη στο παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, CDT1. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε τον in vivo ρόλο της Geminin στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό, στο ανοσοποιητικό σύστημα. Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, βασιζόμενοι στο σύστημα Cre-loxP, δημιουργήσαμε μύες που επιτρέπουν την υπό συνθήκη εξάλειψη (knockout) του γονιδίου της geminin, πλαισιώνοντας τα εξώνια 3 και 4 του γονιδίου της με θέσεις loxP. Η στόχευση του γονιδίου και η παρεμβολή των 3 loxP θέσεων πραγματοποιήθηκε σε pc3 εμβρυικά πολυδύναμα κύτταρα μυός, χρησιμοποιώντας κατάλληλο πλασμιδιακό knockout φορέα, που έφερε τη κασέτα επιλογής TKneo. Μετά από ένεση των ορθά ανασυνδυασμένων pc3 κλώνων σε βλαστοκύστεις, τη δημιουργία χιμαιρικών μυών που εκφράζουν την Cre ρεκομπινάση στη γαμετική σειρά, και την επακόλουθη διασταύρωσή τους με μύες αγρίου τύπου, δημιουργήθηκαν ετερόζυγοι μύες για το πλαισιωμένο με loxP θέσεις αλληλόμορφο της Geminin, που παράλληλα έφερε και τη κασέτα επιλογής TKneo («floxed-ΤΚneo»), το πλαισιωμένο με loxP θέσεις αλληλόμορφο της Geminin, που στερούνταν της κασέτας επιλογής TKneo (floxed), καθώς επίσης και το αλληλόμορφο που στερούνταν των εξωνίων 3 και 4 και είναι το πλήρες knockout (ΔGEM ΚΟ -null) αλληλόμορφο). Από διασταυρώσεις ετερόζυγων για το ΔGEM ΚΟ αλληλόμορφο της geminin, δεν προέκυψαν ομόζυγοι μύες για το ΔGEM ΚO αλληλόμορφο (-/-), τόσο μεταγεννητικά όσο και in utero. Η μειωμένη αντιπροσώπευση των ΔGEM+/- μυών σε συνδυασμό με την αύξηση των Thy1-/B220- κυττάρων σε σπλήνα και λεμφαδένες ενήλικων μυών, η σημαντική αύξηση των Thy1+ και ειδικότερα των CD8+ Τ κυττάρων, καθώς επίσης και η αισθητή μείωση των CD4+ Τ κυττάρων του σπλήνα σε ζώα ηλικίας 5 μηνών, προτείνει ένα είδος απλοανεπάρκειας των ετερόζυγων για Geminin μυών. Σε παραπλήσια αποτελέσματα οδηγηθήκαμε και μετά από την ανάλυση των GT KO για το γονίδιο της Geminin (GT) μυών με τη μεθοδολογία της παγίδευσης γονιδίων. Τα ετερόζυγα GT ζώα διασταυρώθηκαν με ετερόζυγα ζώα για το πλήρες ΚΟ του BRG1 (BRG) και με ετερόζυγα ζώα που υπερεκφράζουν μια επικρατούσα κατασταλτική μορφή του BAF57 (BAFΔΝ, BAF), προκειμένου να διαπιστωθεί εάν υπάρχει γενετική αλληλεπίδραση μεταξύ της Geminin και των μελών του συμπλέγματος αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF, BRG1 και BAF57 που έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη και διαφοροποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Ιστοειδικά, χρησιμοποιώντας την floxedΤΚneo σειρά μυών σε συνδυασμό με την CD2-Cre, που επιτρέπει την εξάλειψη του γονιδίου από το στάδιο των DN κυττάρων του θύμου και μετά, είδαμε ότι η ανάπτυξη του θύμου δεν φαίνεται να επηρεάζεται κατά την απουσία της Geminin, ενώ αντίθετα ο ολικός αριθμός των σπληνοκυττάρων μειώνεται στα FlTKneo/KO;CD2 σε σχέση με τα WT. Μιτωγονική διέγερση με ConA εναιωρήματος σπληνοκυττάρων από FlTKneo/KO;CD2 και WT ζώα, έδειξε ότι τα FlTKneo/KO;CD2 Τ λεμφοκύτταρα αδυνατούν να διαιρεθούν. Τέλος, έγινε προσπάθεια για ιστοειδική υπερέκφραση στο ανοσοποιητικό σύστημα της ανθρώπινης Geminin συντηγμένης με τη πράσινη φθορίζουσα χρωστική (GFP). Το συγκεκριμένο σύστημα επιτρέπει την υψηλή έκφραση του διαγονιδίου κυρίως στα Τ κύτταρα. Ενώ προέκυψαν ιδρυτές για όλες τις πιο πάνω σειρές τόσο με χαμηλή όσο και με υψηλή ενσωμάτωση του διαγονιδίου, η έκφραση της GFP δεν κατέστη δυνατόν να ανιχνευθεί με FACS. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η Geminin είναι ιδιαίτερα σημαντική κατά τα αρχικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου μυός, ενώ ιστοειδικά στο ανοσοποιητικό σύστημα η πλήρης εξάλειψή της δεν έχει καμία επίπτωση στην ανάπτυξη του θύμου αδένα, ενώ αντίθετα στη σπλήνα εμφανίζονται μειωμένοι οι πληθυσμοί των ώριμων CD4 και CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Τέλος, φαίνεται να συνεργάζεται με το σύμπλεγμα αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF στη ρύθμιση των CD4 κυττάρων του θύμου αδένα και των CD8 του σπλήνα. / Immune system development initiates from a multipotent hematopoietic stem cell that consecutively generates intermediate progenitors that concomitantly lose their self-renewal ability and finally generate the fully differentiated cells of the myeloid and lymphoid lineage. The whole procedure is based on the fine tuning of the processes of both self-renewal and differentiation, and requires the expression of diverse genes that are implicated in the processes of cell cycle regulation, transcriptional regulation, and are constituents of chromatin remodeling complexes that operate during differentiation. Geminin has been proposed to control a cell’s decision to proliferate or differentiate. It interacts with transcription factors, with chromatin remodeling complexes, regulating neurospecific gene transcription. At the same time, Geminin acts as a cell cycle inhibitor through direct binding to the DNA licensing factor CDT1. Our goal was to investigate Geminin’s in vivo role in differentiation and cell cycle regulation in the immune system. In this thesis, using Cre-loxP system, we generated conditional knockout mice for Geminin’s gene, flanking exons 3 and 4 with loxP sites. Gene targeting and the insertion of the three loxP sites was performed in pc3 mouse embryonic stem cells, using a suitable knockout plasmid vector, which bared the TKneo cassette selection marker. Upon injection of the homologously recombined pc3 clones into blastocysts, the generation of chimeric mice that expressed Cre recombinase in their germ line, and their subsequent cross to wild type mice, we were able to generate heterozygote mice for the flanked by loxP sites allele of Geminin that also bared TKneo selection marker (“floxed-TKneo” allele), the flanked by loxP sites allele of Geminin that was deprived of the TKneo selection marker (the floxed allele) and the complete knockout allele of Geminin (ΔGEM KO (null) allele) that was deprived of exons 3 and 4. From ΔGEM+/- intercrosses we didn’t recover any homozygote knockout mice, both postnatally and in utero. The reduced number of the ΔGEM+/- obtained, in combination with the dramatic increase of Thy1-B220- cells from spleen and lymph nodes from ΔGEM+/- adult mice, the significant increase in Thy1+ and CD8+ from lymph nodes and the discernible decrease of spleenic CD4 T cells in ΔGEM+/- aged 5 months suggest that ΔGEM+/- mice are haploinsufficient. Similar results were obtained from the analysis of the GT knockout that we generated, using a gene trap mutagenesis approach. GT heterozygote mice were crossed with heterozygote mice for BRG1 Knockout (BRG mice) and with heterozygote mice that overexpressed a dominant negative form of BAF57 (BAFΔN, BAF mice), so as to investigate whether there is a genetic interaction between Geminin and the two members of the SWI/SNF chromatin remodeling complex that have significant roles during development and differentiation of the immune system. Upon conditional inactivation of Geminin’s gene in the immune system, using floxedTKneo and CD2-Cre mouse lines, that allowed the deletion of the gene from the DN stage and on, we were surprised to see that in the Geminin conditional knockout mice, thymic development was largely unaffected. On the contrary, spleenic cellularity from Geminin conditional knockout mice was fairly reduced, when compared to WT control littermates. Mitogenic stimulation with ConA of spleenic whole cell extract from Geminin conditional KO (FlTKneo/KO;CD2) and WT mice demonstrated that the mutant T cells were unable to divide. Finally, we tried to overexpress human Geminin tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) specifically in the immune system. This particular system would ensure high expression of the transgene mainly in T cells. We obtained founders for all of the cloned constructs, both with low and high copy transgene integration, but we were unable to detect GFP expression by FACS analysis. Our results show that Geminin has a pivotal role during early mouse embryonic development, whereas tissue specific inactivation in the immune system leaves thymic development largely unaffected, whereas mature CD4 and CD8 T cells in the spleen are drastically reduced. Finally, Geminin seems to operate with SWI.SNF complex for the regulation of thymic CD4 and spleenic CD8.

Κατά την ανάπτυξη ενός οργανισμού η απόκτηση εξειδικευμένων κυτταρικών λειτουργιών είναι μια προοδευτική διαδικασία η οποία περιλαμβάνει την ασύμμετρη διαίρεση των βλαστικών κυττάρων για την παραγωγή προγονικών κυττάρων τα οποία σταδιακώς εξέρχονται από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποιούνται μέσω της εγκαθίδρυσης του κατάλληλου μεταγραφικού προγράμματος. Προκειμένου να κατανοήσουμε τη ρύθμιση αυτών των γεγονότων μελετήσαμε την Geminin, ένα κεντρικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, στο ανοσοποιητικό σύστημα. Δημιουργήσαμε ζωικά μοντέλα στα οποία απενεργοποιήσαμε το γονίδιο της Geminin στα λεμφοκύτταρα. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η απενεργοποίηση της Geminin στα λεμφοκύτταρα δεν επηρεάζει σημαντικά τη διαφοροποίηση των προγονικών Τ κυττάρων στο θύμο. Απουσία της Geminin τα προγονικά θυμοκύτταρα δεσμεύονται προς διαφοροποίηση στην Τ κυτταρική σειρά και παράγουν διαφοροποιημένα θυμοκύτταρα. Παρατηρήθηκαν μικρές μειώσεις στον αριθμό των DN1, DN4 και DP κυττάρων. Σε αντίθεση τα αθώα (naïve), ρυθμιστικά (regulatory) και Τ κύτταρα μνήμης (memory T cells), παρουσίασαν σημαντικές μειώσεις απουσία της Geminin. Επιπλέον βρήκαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των περιφερικών Τ κυττάρων ύστερα από την ενεργοποίηση τους μέσω του TCR υποδοχέα παρουσίασε σημαντικές ανωμαλίες ενώ παρατηρήθηκαν και σημαντικές διαταραχές της προόδου του κυτταρικού κύκλου απουσία της Geminin. Οι μεταβολές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση του Cdt1 και σε κυκλίνες των ενεργοποιημένων περιφερικών Τ κυττάρων μπορεί να εμπλέκονται στο μηχανισμό που εξηγεί τις διαταραχές των περιφερικών Τ κυττάρων απουσία της Geminin. Επίσης Τ κύτταρα από τα οποία είχε απενεργοποιηθεί η Geminin δεν είναι ικανά να αποικίσουν τα λεμφοειδή όργανα μυών από τους οποίους απουσιάζουν τα λεμφοκύτταρα, αποτέλεσμα το οποίο δείχνει διαταραχές του ομοιοστατικού πολλαπλασιασμού αυτών των κυττάρων. Συμπερασματικά η Geminin είναι απαραίτητη για την αυστηρή ρύθμιση των επαναλαμβανόμενων κυτταρικών διαιρέσεων των περιφερικών Τ κυττάρων αλλά δεν επηρεάζει σημαντικά την διαφοροποίηση των προγονικών Τ κυττάρων. Επιπλέον τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι υπάρχουν εγγενείς διαφορές στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μεταξύ θυμοκυττάρων και περιφερικών Τ κυττάρων. / During development, acquisition of specialized function is a progressive, gradual process that involves the asymmetric divisions of stem cells to generate progeny that will exit the cell cycle and terminally differentiate through the establishment of an appropriate transcriptional program. In order to understand this process we studied Geminin, a key cell cycle regulator, that has been shown to affect cellular decisions of differentiation. Towards this direction we focused on the immune system and investigated the role of Geminin in self-renewal and differentiation of stem and progenitor cells. In order to gain insight into the in vivo role of Geminin in progenitor cell division and differentiation, we have deleted Geminin in cells of the lymphoid lineage. The inactivation of Geminin in the lymphoid lineage does not alter progenitor T cell differentiation in the thymus. In the absence of Geminin progenitor T cells commit, differentiate and generate differentiated thymocytes. Minor reduction in the number of DN1, DN4 and DP progenitor T cells were observed. In contrast naïve, regulatory and memory peripheral T cells show a significant reduction in the absence of Geminin. Moreover, proliferation of Geminin deficient peripheral T cells upon TCR activation is severely compromised, accompanied by cell cycle progression defects. The deregulated protein levels of Cdt1 and cyclins in activated peripheral T cells lacking Geminin, may be involved in the mechanism responsible for the observed phenotype of Geminin deficient peripheral T cells. More importantly Geminin deficient T cells fail to repopulate lymphopenic hosts suggesting defects in homeostatic proliferation. In conclusion Geminin is essential to regulate the repeated divisions of peripheral T cells but does not significantly affect progenitor T cell differentiation. In addition our results suggest that there are intrinsic differences in cell cycle regulation of thymocytes and peripheral T cells.