Spelling suggestions: "subject:"διαφοροποίηση"" "subject:"διαφοροποίησης""
1 |
Διερεύνηση των επιπτώσεων της μειωμένης έκφρασης της Geminin σε κυτταρικές διεργασίεςΚαραμήτρος, Δημήτριος 22 September 2009 (has links)
Η geminin δρα ως ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης συμμετέχοντας στην οργάνωση της χρωματίνης και των μεταγραφικών προγραμμάτων των πρόγονων κυττάρων μέσω της αλληλεπίδρασης της με διάφορους παράγοντες. Ο αυστηρός έλεγχος του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης είναι βασικός για την παραγωγή του κατάλληλου αριθμού και τύπου κυττάρων που συμμετέχουν στην οργανογένεση. Επιπλέον η ικανότητα αυτό-ανανέωσης των πρόδρομων κυττάρων βασίζεται στον πολλαπλασιασμό τους, χωρίς διαφοροποίηση και είναι απαραίτητη για την ανανέωση των ιστών. Ωστόσο η απορρύθμιση των μηχανισμών που ελέγχουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό είναι επιζήμια για τον οργανισμό αφού είναι το πρώτο βήμα κατά την καρκινογένεση. Η κυτταρική γήρανση έχει προταθεί ότι είναι ένας ογκοκατασταλτικός μηχανισμός.
Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε το ρόλο της geminin στην ρύθμιση των φυσιολογικών κυτταρικών διαδικασιών της διαφοροποίησης και της γήρανσης. Για αυτό το σκοπό, χρησιμοποιήσαμε ποντικούς στους οποίους η geminin απενεργοποιείται ειδικά στην λεμφοειδή κυτταρική σειρά. Δείξαμε ότι η απουσία της geminin οδηγεί σε μείωση του συνολικού αριθμού κυττάρων του θύμου και του σπλήνα. Επιπρόσθετα οι CD4 και CD8 Τ κυτταρικοί πληθυσμοί επηρεάστηκαν από την απενεργοποίηση της geminin.
Για την εύρεση ενός πιθανού ρυθμιστικού ρόλου της geminin στην επαγωγή κυτταρικής γήρανσης χρησιμοποιήσαμε ινοβλάστες ποντικού που εκφράζουν μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης. Δείξαμε ότι οι ινοβλάστες με μειωμένα επίπεδα της geminin παρουσιάζουν φαινότυπο γήρανσης νωρίτερα από τους ινοβλάστες αγρίου τύπου όπως καθορίστηκε από τη χρώση για σχετιζόμενη με γήρανση β-γαλακτοσιδάση. / Geminin acts as a coordinator of proliferation and differentiation by regulating the chromatin organization and transcription programs of progenitor cells through its interaction with several partners. The tight control of proliferation and differentiation, is essential in the generation of mature cells of the proper number and type necessary for organ formation. Moreover the self-renewing capacity of progenitor cells depends on proliferation without differentiation of the cells and is indispensable in tissue regeneration. However the deregulation of the mechanisms that control the proliferation capacity of a cell has deleterious effects for the organisms since it is the first step of carcinogenesis. Cellular senescence was proposed to be a tumour-suppressive mechanism.
In the present study we addressed the role of geminin in the physiological processes of cellular differentiation and senescence. We have used a mouse line in which geminin is specifically inactivated in the lymphoid lineage. We showed that geminin’s absence leads to reductions in the thymic and splenic cellularities. In addition to that, CD4 and CD8 T cell populations of the thymus and the spleen of conditional KO animals, were affected by geminin’s ablation.
To study a potential regulatory role of geminin in the induction of cellular senescence we used mouse fibroblasts that express reduced levels of the protein. We found that the fibroblasts with reduced levels of geminin’s expression present senescent phenotype earlier than the WT fibroblasts as determined by SA-β-gal staining.
9
|
2 |
Έκφραση της geminin και της cdt1 στο φλοιό του εγκεφάλου κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του μυόςΣπέλλα, Μάγδα 19 December 2008 (has links)
Ο σχηματισμός του νευρικού συστήματος επιτυγχάνεται από αναπτυξιακούς μηχανισμούς που ελέγχουν τις διαδικασίες του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής διαφοροποίησης. Το χαρακτηριστικό αυτό υποδεικνύει ότι μόρια που συμμετέχουν και στις δύο παραπάνω διαδικασίες ενδεχομένως διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην πορεία της νευρογένεσης. Η Geminin είναι μία πρωτεΐνη που εμπλέκεται στους δύο προαναφερόμενους μηχανισμούς. Η Geminin ελέγχει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ρυθμίζοντας τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1. Επίσης, η Geminin εμφανίζει και νευροεπαγωγική δράση, καθώς προάγει το σχηματισμό νευρικού ιστού στα έμβρυα του Xenopus laevis. Επιπρόσθετα, η Geminin αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες και παράγοντες αναδιαμόρφωσης της δομής της χρωματίνης, όπως είναι τα μόρια Six3, Hox, Brg1, Brahma και Polycomb, επηρεάζοντας με αυτόν τον τρόπο την ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης.
Μελετήσαμε το πρότυπο έκφρασης των πρωτεϊνών Geminin και Cdt1 στο αναπτυσσόμενο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) εμβρύων ποντικού με τις τεχνικές του in situ υβριδισμού και της ανοσοϊστοχημείας. Η παρουσία της Geminin ανιχνεύτηκε στην κοιλιακή ζώνη του αναπτυσσόμενου ΚΝΣ, όπου εδρεύουν τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα. Το πρότυπο έκφρασης της Cdt1 ήταν παρόμοιο με αυτό της Geminin. Τα κύτταρα που εκφράζουν τις Geminin και Cdt1 κατανέμονται μεταξύ των κυττάρων που εκφράζουν τον παράγοντα Sox2, έναν μοριακό δείκτη πρόδρομων νευρικών κυττάρων. Ανιχνεύσαμε ένα μερικώς αλληλεπικαλυπτόμενο πρότυπο έκφρασης των δύο πρωτεϊνών με το αντίστοιχο του μορίου Mash1, το οποίο καταδεικνύει πρόδρομα κύτταρα που έχουν αρχίσει να διαφοροποιούνται προς νευρώνες. Τέλος, η κατανομή των Geminin και Cdt1 είναι τελείως διακριτή από την κατανομή της πρωτεΐνης Τουμπουλίνη βΙΙΙ που εκφράζεται μόνο από τους ώριμους νευρώνες. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι οι πρωτεΐνες Geminin και Cdt1 εκφράζονται από τα πρόδρομα αδιαφοροποίητα κύτταρα του αναπτυσσόμενου νευρικού συστήματος. / Nervous system formation is accomplished through developmental mechanisms which integrate tight control of proliferation and differentiation. This feature indicates that molecules participating in both of these processes may have prominent roles during neurogenesis. Geminin is a protein involved in both of these mechanisms. It controls proliferation by negatively regulating the DNA replication licensing factor Cdt1 and, in addition, it acts as a neuralizing factor during early gastrulation of Xenopus embryos, defining in dorsal ectoderm a future nervous territory. Moreover, Geminin’s interaction with transcription and chromatin remodeling factors such as Six3, Hox, Brg1, Brahma and Polycomb proteins affects the balance between proliferation and differentiation.
We performed a detailed analysis of the expression patterns of Geminin and Cdt1 in the central nervous system of mouse embryos by in situ hybridization and immunohistochemistry. We detected Geminin at the ventricular zone (VZ) of the developing CNS, where the proliferating progenitors reside, and its expression pattern overlapped that of Cdt1. Geminin and Cdt1 expressing cells defined a subpopulation of the Sox2 positive cells, which is a marker of neural progenitor cells. A partial co-localization was seen with Mash1, a marker of precursor cells committed towards a neuronal phenotype, whereas no overlap was detected with the neuronal marker TubulinβIII. Our results indicate that Geminin and Cdt1 are localized in progenitors/stem cells of the developing CNS.
|
3 |
Μελέτη και προσομοίωση μετάδοσης με χρήση OFDM / Study and simulation of transmission using OFDMΓκιργκινούδη, Αντωνία 11 January 2011 (has links)
Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη και η παρουσίαση της μεθόδου πολύπλεξης OFDM. Στο Κεφάλαιο 2 γίνεται αναφορά στα ασύρματα κανάλια επικοινωνίας. Παρουσιάζεται το κανάλι πολλαπλής διόδευσης με διαλείψεις (multipath fading), καθώς και το μοντέλο βασικής ζώνης του ασύρματου συστήματος. Η αναφορά σε φυσικές παραμέτρους του καναλιού, όπως η συνοχή στο χρόνο (coherence time) και η συνοχή εύρους ζώνης (coherence bandwidth), καθώς και σε έννοιες όπως η εξάπλωση Doppler (Doppler spread) και η εξάπλωση καθυστέρησης (delay spread), οδηγεί στην κατηγοριοποίηση των ασύρματων καναλιών. Επίσης παρουσιάζονται διάφορα στατιστικά μοντέλα για το κανάλι πολλαπλής διόδευσης με διαλείψεις.
Στη συνέχεια, στο Κεφάλαιο 3 παρουσιάζονται μέθοδοι ανίχνευσης και διαφοροποίησης (diversity). Η διαφοροποίηση είναι ένας τρόπος βελτίωσης της απόδοσης της μετάδοσης μέσω καναλιού. Παρουσιάζονται δυο είδη ανίχνευσης: Η σύμφωνη ανίχνευση, όπου ο δέκτης έχει γνώση του καναλιού και η μη σύμφωνη ανίχνευση, όπου ο δέκτης δε γνωρίζει το κανάλι και συγκρίνονται οι πιθανότητες σφάλματος κάθε περίπτωσης. Επίσης μελετώνται τρία είδη διαφοροποίησης: η διαφοροποίηση στο χρόνο, στο χώρο και στη συχνότητα.
Βασική αρχή της μεθόδου OFDM, η οποία αναλύεται εκτενώς στο 4ο κεφάλαιο, είναι η ταυτόχρονη μετάδοση πολλών ροών σε χαμηλό ρυθμό σε περισσότερες από μια υποφέρουσες αντί για μετάδοση μιας ροής με γρήγορο ρυθμό σε όλο το φάσμα. Η OFDM αποτελεί μέθοδο διαμόρφωσης, αλλά και πολυπλεξίας. Γίνεται εκτενής αναφορά στο μαθηματικό υπόβαθρο της διαμόρφωσης OFDM και παρουσιάζονται τρόποι αντιμετώπισης τόσο της διασυμβολικής όσο και της διακαναλικής παρεμβολής. Η διασυμβολική παρεμβολή αντιμετωπίζεται με την κυκλική επέκταση του συμβόλου OFDM, ενώ η διακαναλική παρεμβολή με τη χρήση ορθογώνιων υποφερουσών. Επίσης παρουσιάζεται η τεχνική windowing. Τέλος, αναφέρονται βασικές παράμετροι που λαμβάνονται υπόψη για τη σχεδίαση συστημάτων OFDM, όπως ο αριθμός υποφερουσών, ο χρόνος φύλαξης (guard time), η διάρκεια συμβόλου, το εύρος ζώνης (bandwidth), και ο ρυθμός μετάδοσης (bit rate).
Στο Κεφάλαιο 5 προσομοιώνεται ένα σύστημα OFDM σε διάφορα περιβάλλοντα μετάδοσης (διάφορα είδη καναλιών). Παρατίθενται τα αποτελέσματα των προσομοιώσεων και γίνεται αποτίμηση και σύγκριση, για την εξαγωγή συμπερασμάτων. / The main objective of this Diploma thesis is a comprehensive presentation of the OFDM method. In Chapter 2, the wireless channel is presented, multipath fading is described, and the baseband equivalent of the wireless system is introduced. The consideration of physical parameters such as the coherence time, the coherence bandwidth, the Doppler spread and the delay spread leads to a categorization of wireless channels. Several statistical models for multipath fading are also surveyed.
Chapter 3 introduces detection and diversity techniques. Diversity can be used to improve the performance of transmission over the channel. There are two types of detection: coherent and non-coherent. In coherent detection, in contrast to non- coherent, the receiver has full knowledge of the channel. Moreover, three diversity techniques are studied: time, space and frequency diversity.
In Chapter 4, the basics of OFDM are presented. OFDM is a special case of multicarrier transmission, where a single data stream is transmitted over a number of lower-rate subcarriers. It is also a combination of modulation and multiplexing. It is explained how an OFDM signal is formed, how cyclic extension helps mitigate Inter-Symbol Interference (ISI), and how orthogonality between the modulated subcarriers eliminates Inter Channel Interference (ICI) in the absence of frequency offsets. Windowing is also presented. Basic design rules are given on how to choose the OFDM parameters, such as the guard time, the symbol duration, the bandwidth, and the bit rate.
Finally, an OFDM system is simulated in Chapter 5. The simulations take place in different channel environments. The results of the simulations are compared, in order to draw conclusions.
|
4 |
Μελέτη του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα COUP-TF στη διαφοροποίηση πρόδρομων κυττάρων σκελετικού μυόςΚαρπαθάκη, Αγγελική-Φαίδρα 06 December 2013 (has links)
Ο μεταγραφικός παράγοντας COUP-TF είναι ένας ορφανός πυρηνικός υποδοχέας,
ο οποίος είναι πολύ σημαντικός κατά την εμβρυική ανάπτυξη. Στην παρούσα
εργασία επιχειρήθηκε η μελέτη του φυσιολογικού ρόλου του COUP-TFII των
θηλαστικών κατά την αναγέννηση του σκελετικού μυός, χρησιμοποιώντας ως
μοντέλο διαφοροποίησης τη μυοβλαστική σειρά ποντικού C2C12, που προέρχεται
από ενήλικα βλαστικά κύτταρα του ίδιου μυός. Ο mCOUP-TFII εμπλέκεται στη
ρύθμιση της ανάπτυξης του καρδιαγγειακού συστήματος, της μυογένεσης και άλλων
αναπτυξιακών διαδικασιών. Έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τη διαφοροποίηση των
μυοβλαστών C2C12 σε μυοσωλήνες, κυρίως μέσω καταστολής της έκφρασης των
μεταγραφικών παραγόντων μυογένεσης MyoD και Myogenin. Επίσης, η έκφρασή
του στους μυοβλάστες C2C12 καταστέλλεται με την έναρξη της διαφοροποίησης.
Αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, έχουν δείξει ότι μέσω εναλλακτικού ματίσματος στο mRNA του PlCOUP-TF του αχινού προκύπτουν δύο
ισομορφές του υποδοχέα που διαφέρουν ως προς ένα εξώνιο 21 αμινοξέων στην
DBD. H μικρή ισομορφή είναι λειτουργικός μεταγραφικός παράγοντας και δρα ως
ομοδιμερές, ενώ η μεγάλη ισομορφή και τα ετεροδιμερή των δυο ισομορφών εμφανίζουν αδυναμία πρόσδεσης στο DNA. Με αυτόν τον τρόπο, η μεγάλη ισομορφή
ρυθμίζει την ποσότητα του λειτουργικού μεταγραφικού παράγοντα, δρώντας ως
επικρατής κατασταλτική πρωτεΐνη. Αρχικά, μελετήθηκαν οι ιδιότητες πρόσδεσης του
mCOUP-TFII και η δυνατότητα σχηματισμού ετεροδιμερών με τη μεγάλη ισομορφή
του PlCOUP-TF (L.I.) μέσω δοκιμής in vitro πρόσδεσης (EMSA), δεδομένης της
ικανότητας ετεροδιμερισμού του hCOUP-TFI με την ομόλογη πρωτεΐνη του αχινού.
Βρέθηκε ότι ο mCOUP-TFII δύναται να προσδεθεί στο στοιχείο απόκρισης C1R
με τη μορφή ομοδιμερών και έχει ικανότητα ετεροδιμερισμού με τη PlCOUP-TF
L.I. Τα ομοδιμερή του mCOUP-TFII εμφάνιζαν μειούμενη πρόσδεση στο DNA,
όσο αυξανόταν ο λόγος PlCOUP-TF L.I./mCOUP-TFII. Ο απώτερος στόχος
της έρευνας ήταν η μελέτη του ρόλου του mCOUP-TFII στη μυϊκή διαφοροποίηση, μέσω της υπερέκφρασης της επικρατούς κατασταλτικής PlCOUP-TF L.I. σε
καλλιέργειες κυττάρων C2C12. Η αρχική μας υπόθεση ήταν ότι η PlCOUP-TF L.I.
δύναται να δράσει ως επικρατής κατασταλτική ισομορφή του mCOUP-TFII, μέσω σχηματισμού μη λειτουργικού ετεροδιμερούς μαζί του. Σε αυτή την περίπτωση, θα
αναμενόταν η PlCOUP-TF L.I. να καταστείλει τη δράση του ενδογενούς mCOUP-TFII
των κυττάρων C2C12, με αποτέλεσμα την επαγωγή της διαφοροποίησης των
μυοβλαστών. Αντιθέτως, η υπερέκφραση του mCOUP-TFII, θα αναμενόταν να
συντελέσει στη διατήρηση της αδιαφοροποίητης κατάστασης των μυοβλαστών. Δεν
παρατηρήθηκε διαφορά στις δράσεις των δυο COUP-TFs, ωστόσο, από τα πειράματα
αυτά δεν μπορεί να εξαχθεί κάποιο ασφαλές συμπέρασμα αναφορικά με το ρόλο του
mCOUP-TFII στη διαφοροποίηση των μυοβλαστών και τη δυνατότητα in vivo
αλληλεπίδρασης μεταξύ των δυο υποδοχέων. / The transcription factor COUP-TF is an orphan nuclear receptor, which is
very important during embryonic development. In the present dissertation, we
attempted to study the physiological role of mammalian COUP-TFII during
skeletal muscle regeneration, by use of the myoblast cell line C2C12, which
originates from adult stem cells of skeletal muscle, as a model system of cell
differentiation. mCOUP-TFII is involved in the regulation of cardiovascular
system development, myogenesis and other developmental processes. It has been
shown to inhibit the differentiation of C2C12 myoblasts to myotubes, mainly
through suppression of the myogenic regulatory factors MyoD and Myogenin
gene expression. Moreover, its expression in C2C12 myoblasts is suppressed at
the onset of differentiation. Alternative splicing of the sea urchin PlCOUP-TF
mRNA results in two isoforms, which differ by a 21 aa insertion in the DBD
(unpublished data). The small isoform is a functional transcription factor that
acts as a homodimer, while the large isoform and the heterodimers of the two
isoforms fail to bind DNA. In this way, the large isoform regulates quantitatively
the functional transcription factor, acting as dominant negative protein. Initially,
by using in vitro binding assays (EMSA), we studied the binding properties of
mCOUP-TFII and the possibility of forming heterodimers with the large isoform
of PlCOUP-TF (L.I.), provided that hCOUP-TFI has been reported to be able
to heterodimerize with the sea urchin homologue. We found that mCOUP-TFII
is capable of binding the C1R response element as a homodimer and of forming
heterodimers with PlCOUP-TF L.I. The binding of mCOUP-TFII homodimers
has been shown to reduce as the ratio PlCOUP-TF L.I./mCOUP-TFII increases.
The ultimate goal of this research, was the study of the role of mCOUP-TFII in
muscle differentiation via overexpression of the dominant negative PlCOUP-TF
L.I. in C2C12 cell cultures. Our initial assumption was that PlCOUP-TF L.I. is
capable of acting as a dominant negative isoform of mCOUP-TFII, by forming
non functional heterodimers with it. In this case, PlCOUP-TF L.I. would be
expected to suppress the action of endogenous mCOUP-TFII in C2C12 cells. In
contrast, overexpression of mCOUP-TFII would be expected to contribute to the maintenance of myoblasts in an undifferentiated state. We did not observe
any difference in the actions of the two COUP-TFs, however, we cannot report
any result regarding either the role of mCOUP-TFII in myoblast differentiation
or the ability of in vivo interaction between these receptors.
|
5 |
Ο ρόλος του οξειδωτικού στρες στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση μυκήτων του γένους AspergillusΓκρίντζαλης, Κωνσταντίνος 07 June 2013 (has links)
H παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση της σχέσης του οξειδωτικού στρες με τη σκληρωτιακή διαφοροποίηση και την παραγωγή αφλατοξίνης του μύκητα Aspergillus flavus. Ο μύκητας αυτός έχει σπουδαία αγροτική σημασία διότι μπορεί να επιμολύνει αποθηκευμένους καρπούς. Επίσης μπορεί να αποτελεί παθογόνο μικροοργανισμό για τον άνθρωπο που σχετίζεται με ασπεργιλλώσεις των πνευμόνων και άλλες λοιμώξεις. Πολλά στελέχη παράγουν μεγάλες ποσότητες αφλατοξίνης, μιας καρκινογόνου και εξαιρετικά τοξικής ένωσης. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε ο ρόλος κεντρικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες όπως η λιπιδική και πρωτεϊνική υπεροξείδωση, η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση αλλά και συγκεκριμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων, καθώς και η επίδραση συγκεκριμένων αντιοξειδωτών στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση ενός στελέχους αγρίου τύπου σε σύγκριση με ένα μεταλλαγμένο μη σκληρωτιογόνο και μη αφλατοξινογόνο στέλεχος (ΔveA). Για την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής χρειάστηκε η ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών για την ποσοτικοποίηση στους μύκητες της ολικής πρωτεΐνης, και εξειδικευμένων θειολικών και λιπιδικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν μια σαφή συσχέτιση του οξειδωτικού στρες με τη διαφοροποίηση των σκληρωτιογόνων μυκήτων, αφού το αγρίου τύπου στέλεχος εμφανίζεται περισσότερο στρεσαρισμένο οξειδωτικά σε σύγκριση με το αδιαφοροποίητο μεταλλαγμένο στέλεχος. Η χορήγηση αντιοξειδωτών ανέστειλε πλήρως (με εξαίρεση το ασκορβικό οξύ) τη σκληρωτιογένεση του αγρίου τύπου στελέχους επιδρώντας διαφορετικά στις παραμέτρους του οξειδωτικού στρες, ενώ μείωσε έως ανέστειλε πλήρως τη βιοσύνθεση αφλατοξίνης, αποκαλύπτοντας τη συμμετοχή του οξειδωτικού στρες σε αυτές τις διαδικασίες. Τα αποτελέσματα της διατριβής εκτός από επιστημονικό ενδιαφέρον έχουν και πρακτική σημασία εξαιτίας της παθογένειας του συγκεκριμένου μύκητα τόσο στον άνθρωπο όσο και στα φυτά. / The present thesis aims to elucidate the relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation and aflatoxin production of the fungus Aspergillus flavus. This fungus has great agricultural importance because it can infect stored grains. It can also be a human pathogen, associated with aspergillosis of the lungs and other infections. Many strains produce significant quantities of aflatoxin, a carcinogenic and acutely toxic compound. In particular, the role of central parameters of oxidative stress such as lipid and protein peroxidation, thiol redox state and antioxidant enzymes, and the influence of certain related exogenous antioxidants were studied on the biosynthesis of aflatoxin, on the biogenesis of sclerotia in a wild type in comparative relationship with a non-sclerotiogenic and non-aflatoxigenic mutant strain (ΔveA). The experimental needs of this thesis necessitates the development of new methodologies for the precise quantification of certain thiol and lipid markers of oxidative stress and protein concentration. The results show a clear relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation since the wild type strain is more oxidatively stressed than the mutant non-differentiating strain. Administration of certain antioxidants completely inhibited sclerotiogenesis in the wild type strain (with the exception of ascorbic acid), and decreased or even halted the biosynthesis of aflatoxin, thus revealing an implication of oxidative stress on these processes. The results besides having scientific interest, have also practical importance since this fungi is both human and plant pathogen.
|
6 |
Μελέτη του ρόλου της πρωτεϊνης BM88 στον καθορισμό της νευρωνικής ταυτότητας των κυττάρων / Study of the role of BM8 protein in the comitment of cels to the neuronal identityΚουτμάνη, Γιασεμή 01 December 2008 (has links)
Η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι νευροειδική πρωτεΐνη με ευρεία κατανομή σε κύτταρα του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος των θηλαστικών. O βιοχημικός χαρακτηρισμός του μορίου έδειξε ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εντοπίζεται κυρίως στις μεμβράνες ενδοκυττάριων οργανιδίων (μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο) ενώ το μεγαλύτερο τμήμα του μορίου της προσανατολίζεται προς το κυτταρόπλασμα. Στο ενήλικο κεντρικό νευρικό σύστημα η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε νευρώνες ενώ δεν ανιχνεύεται σε γλοιοκύτταρα. Αναπτυξιακά, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 ανιχνεύεται κατά την έναρξη της νευρογένεσης στον εγκέφαλο του αρουραίου ενώ τα επίπεδα της έκφρασή της αυξάνονται µε την ηλικία και παραµένουν υψηλά στο ενήλικο ζώο. Λειτουργικά πειράματα in vitro υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 συσχετίζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 με την έξοδο των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο και την έναρξη της διαδικασίας διαφοροποίησής τους προς νευρωνικό φαινότυπο. Τα παραπάνω δεδομένα μας ώθησαν να μελετήσουμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης και της διαφοροποίησης των νευρώνων in vivo, έτσι ώστε να διερευνήσουμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε ως σύστημα μελέτης τον αναπτυσσόμενο φλοιό του τελεγκεφάλου των τρωκτικών.
Αρχικά χαρτογραφήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο φλοιό του αναπτυσσόμενου τελεγκεφάλου κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18 και πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι μαρτύρων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όπως είναι η κυκλίνη D1 (μάρτυρας της φάσης G2/M του κυτταρικού κύκλου) και το ανάλογο της θυμιδίνης BrdU (που ενσωματώνεται κατά τη φάση της αντιγραφής του DNA - φάση S του κυτταρικού κύκλου). Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες, όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα προγονικά κύτταρα του αναπτυσσόμενου φλοιού του αρουραίου και του ποντικού.
Κατόπιν, διερευνήσαμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται κατά την περίοδο της νευρογένεσης ειδικά, σε προγονικά κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων ή αν εκφράζεται και σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας του τελεγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν διπλές και τριπλές ανοσοϊστοχημικές χρώσεις με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι νευρωνικών ή γλοιΐκών μαρτύρων, σε συνδυασμό με αντισώματα έναντι μαρτύρων κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται αποκλειστικά και μόνο σε κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας και όχι σε πολλαπλασιαζόμενα ή διαφοροποιημένα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν από το γεγονός ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 προσδιορίστηκε και σε νευροεπιθηλιακά κύτταρα του τύπου «ακτινωτής γλοίας» που σύμφωνα με την τρέχουσα αντίληψη, αποτελούν την πλειοψηφία του πληθυσμού των πρόδρομων νευρογενετικών κυττάρων του φλοιού κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18. Αργότερα μόνο, τα κύτταρα αυτά θα αποτελέσουν προδρόμους της γλοιϊκής γενεαλογίας, και συγκεκριμένα μετά τη 18η εμβρυϊκή ημέρα και κατά τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση.
Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν συνδυαστικά πειράματα σήμανσης των πρόδρομων κυττάρων του εγκεφάλου με δύο διαφορετικούς μάρτυρες της φάσης S του κυτταρικού κύκλου, με τα οποία έγινε εφικτή η παρακολούθηση in vivo, και για το διάστημα 12 και 24 ωρών, του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης μιας ομάδας πρόδρομων νευρικών κυττάρων. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σχετίζεται με τις ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις, η εμφάνιση των οποίων σηματοδοτεί την έναρξη της νευρογένεσης στο φλοιό και την εμφάνιση των πρώτων μεταμιτωτικών νευρώνων. Έτσι, φαίνεται ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πρόδρομα νευρογενετικά κύτταρα προκαλεί την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο.
Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 μελετήθηκε και στον εγκέφαλο του ενήλικου αρουραίου όπου εντοπίστηκε, εκτός από τους ώριμους νευρώνες, και στα πρόδρομα κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (RMS) όπου λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση. Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας και συνδέουν επιπλέον την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 με τη διαδικασία της νευρογένεσης στον ενήλικο εγκέφαλο.
Τέλος, μελετήσαμε τόσο την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 όσο και τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό ποντικών που φέρουν τη μετάλλαξη Small eye (ποντίκια Sey/Sey). Στα ποντίκια αυτά δεν είναι λειτουργικό το γονίδιο Pax6 που είναι υπεύθυνο για την επαγωγή της νευρογένεσης στο ραχιαίο μέρος του τελεγκεφάλου. Έτσι, ο αριθμός των νευρώνων που παράγονται στο φλοιό αυτών των μεταλλαγμένων ποντικών είναι ελαττωμένος στο μισό από αυτόν που συναντάμε στα ποντίκια φυσικού τύπου. Όπως αναμενόταν, παρατηρήθηκε ότι τόσο η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 όσο και τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 είναι μειωμένα στα ποντίκια Sey/Sey.
Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της εργασίας μας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 χαρακτηρίζει τη γενεαλογία των νευρώνων από τα πρόδρομα εμβρυϊκά κύτταρα μέχρι τους ώριμους νευρώνες και επομένως αποτελεί ένα νέο μάρτυρα της νευρωνικής γενεαλογίας. Επιπλέον, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 συγκεντρώνει τις απαραίτητες ιδιότητες που χαρακτηρίζουν ένα «νευρογενετικό παράγοντα». Συγκεκριμένα: α) εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας, β) δεν εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας, γ) εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα νευρώνων κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης στο ενήλικο άτομο και τέλος δ) η έκφρασή της μειώνεται σε ζώα που φέρουν μεταλλάξεις οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ελαττωματικής νευρογένεσης.
Η κατανομή της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου καθώς και ο εντοπισμός της σε βλαστικά κύτταρα του ενήλικου εγκεφάλου, η συσχέτιση της έκφρασης του μορίου με τις ασύμμετρες νευρογενετικές κυτταρικές διαιρέσεις καθώς και η χαρακτηριστική αύξηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη μετάβαση των προγονικών κυττάρων σε διαφοροποιημένους νευρώνες, όλα συνηγορούν για τη συμμετοχή του μορίου στις διαδικασίες της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο και τη διαφοροποίηση των νευρώνων in vivo. Οι παρατηρήσεις αυτές, όχι μόνον είναι συμβατές με προηγούμενα πειραματικά δεδομένα όσον αφορά τον προσδιορισμό του ρόλου της πρωτεΐνης σε in vitro βιολογικά συστήματα, αλλά δημιουργεί ενδιαφέρουσες προοπτικές για την αξιοποίηση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε θεραπευτικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση νευροεκφυλιστικών ασθενειών ή/και τραυματισμών του εγκεφάλου. / BM88 is a neuron-specific protein widely expressed in the cells of the mammalian central and peripheral nervous system. Its biochemical characterization revealed that is an integral membrane protein, located at the membranes of intra-cellular organelles (mitochondria, endoplasmic reticulum) with the bulk of the protein facing towards the cytoplasm. In the adult central nervous system BM88 is expressed in neurons but it is not detected in glial cells. During development, BM8 is initially expressed at the onset of neurogenesis in the rat brain, its levels rise along age and remain high in the adult. In vitro experiments of BM88 protein over-expression suggest that BM88 is implicated in cell cycle exit and the initiation of differentiation into a neuronal phenotype. These findings lead us to study the expression of BM88 during neurogenesis and neuronal differentiation in vivo in purpose to investigate its role in brain development. For this reason, we have chosen as a model of study the developing cortex of rodent telencephalon.
Initially, we investigated the distribution of BM88 protein in the developing cortex. To this end, we performed double-labeling experiments in sections from the developing rat brain at embryonic days E14 and E18 using antibodies to BM88 and markers of the cell cycle such as cyclin D1 (G2/M phase marker) and BrdU, a thymidine analogue that is incorporated during DNA replication (S phase marker). The findings from these experiments revealed that BM88 protein is expressed in the differentiated neurons as well as in actively proliferating progenitor cells of the developing cortex of rat and mouse.
We next sought to investigate whether BM88 is expressed during neurogenesis specifically in the progenitor cells of the neuronal lineage or in the progenitor cells of the glial lineage of the telencephalon as well. For this reason we performed double and triple-labeling experiments with antibodies to BM88 and to markers of the neuronal or glial lineages, in combination with markers of the cell cycle. We observed that BM88 protein is expressed exclusively in the neuronal progenitors and never in the proliferating or differentiated cells of the glial lineage. The above results were supported also by the fact that BM88 protein was detected in neuroepithelial “radial glial” cells that are cells recently reported to be the majority of neuronal progenitors of the cortex during the embryonic days E14-E18. These cells will turn into glial progenitors only after the embryonic day E18 and during early postnatal days.
Moreover, we developed an experimental protocol that allowed us to mark the progenitor cells of the brain with two different markers of the S phase of the cell cycle. Thus, we could observe in vivo, during a period of 12 and 24 hours, the migration and differentiation of a group of neural progenitor cells. The results from this experiment lead us to the conclusion that the expression of BM8 protein is associated with the asymmetric cell divisions that mark the onset of neurogenesis in the cortex and the appearance of the first post-mitotic neurons. Thus, it appears that the expression of BM88 protein in the neuronal progenitor cells causes their exit from the cell cycle.
BM88 protein expression was also detected in the adult rat brain, not only in the mature neurons but also in the precursor cells of the rostral migratory stream (RMS), where the secondary neurogenesis occurs. This result is in accordance with our previous observations and support additionally that there is a correlation between BM88 expression and the process of neurogenesis in the adult brain.
Finally, we investigated the expression of BM88 protein as well as the transcriptional levels of BM88 gene in the developing cortex of Small eye mutant mice (Sey/Sey mice). These mice lack the functional Pax6 gene that is responsible for the induction of neurogenesis in the dorsal telencephalon. Thus, the number of neurons that are produced in the cortex of the mutant mice is reduced by half in comparison to that of the wild type mice. As expected we observed reducer levels of expression both of BM88 protein and BM88 transcripts in the Sey/Sey mice.
To conclude, the results of our study demonstrate that BM88 protein marks the lineage of neurons, all along from the stage of embryonic precursor cells to the stage of mature neurons, and for this reason is a new marker of the neuronal lineage. Furthermore, we showed that BM88 protei has all the characteristics that can identify a molecule as a “neurogenic factor”. More specifically: a) it is expressed both in differentiated neurons and in actively proliferating cells of the neuronal lineage, b) it is absent in the precursors of the glial lineage, c) it is present in the adult neuronal precursors, and finally d its expression is reduced in mutants with neurogenic defects.
The expression pattern of BM88 protein during brain development, its presence in stem cells in the adult brain, its association with the asymmetric divisions of neurons as well as the characteristic high levels of BM88 protein expression during the neuronal transition from the progenitor stage to the differentiated stage, all together coincides to the implication of BM88 in the exit from the cell cycle and in the differentiation of neurons in vivo. These observations not only agree with previous experimental data, but also create new perspectives for the use of BM88 protein in therapeutic approaches in order to control the neurodegenerative diseases or/and brain damages.
|
7 |
Ο ρόλος της θειολικής κατάστασης στην σκληρωτιακή διαφοροποίηση των μυκήτωνΠατσούκης, Νικόλαος 08 December 2008 (has links)
Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης όπως εκφράζεται στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum και S. minor σε σχέση με τη θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ), αλλά και με το οξειδωτικό στρες, στo πλαίσιο της θεωρίας της οξειδωτικώς επαγόμενης σκληρωτικής διαφοροποίησης (που προτάθηκε από το εργαστήριό μας το 1997). Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Στη διαμόρφωση της ΘΟΚ συμμετέχουν πολλά μη πρωτεϊνικά, πρωτεϊνικά και μεικτά θειολικά και δισουλφιδικά συστατικά, ανάμεσα στα οποία η γλουταθειόνη θεωρείται ο κύριος συνδετικός κρίκος. Επειδή στη διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον υπολογισμό όλων των παραγόντων της ΘΟΚ για την εκπλήρωση του στόχου της μελέτης, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες σε όλους τους οργανισμούς. Παράλληλα, αναπτύχθηκε και μια νέα μέθοδος για την εξειδικευμένη ποσοτικοποίηση του μικρο-κατακερματισμένου DNA, καθώς στη διεθνή βιβλιογραφία οι περισσότερες υπάρχουσες μέθοδοι ήταν ποιοτικές και όχι εξειδικευμένες ως προς το μέγεθος των θραυσμάτων DNA. Επιπρόσθετα, η εκτίμηση των οξειδωτικών βλαβών στο DNA έγινε και με τη μέτρηση ενός γενικού δείκτη αυτών των βλαβών (εγκοπές και σπασίματα) με υπάρχουσα μέθοδο ύστερα από σημαντική τροποποίησή της. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της ειδικής ενεργότητας των βασικών ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ και της σχετιζόμενης με τη ΘΟΚ ενδογενούς βιταμίνης C, καθώς και η ποσοτικοποίηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένοι εξωγενείς τροποποιητές της ΘΟΚ. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης των νέων μεθόδων για την ποσοτικοποίηση των παραμέτρων της ΘΟΚ και των οξειδωτικών βλαβών στο DNA ως προς την εξαγωγή πιο ασφαλών συμπερασμάτων για τη συσχέτιση της ΘΟΚ με το οξειδωτικό στρες. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι η σχετιζόμενη με αυτό ΘΟΚ μεταβάλλεται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Το συμπέρασμα αυτό βασίστηκε στη διαπίστωση (α) της ύπαρξης διαφορετικών για κάθε μορφή διαφοροποίησης ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και αντιοξειδωτικών ενζύμων και (β) διαφορετικών προφίλ-διαβαθμίσεων των συγκεντρώσεων των παραμέτρων της ΘΟΚ και των δεικτών οξειδωτικού στρες. Επιπρόσθετα, ο άμεσος αντιοξειδωτικός ρόλος των ενδογενών μη πρωτεϊνικών θειολικών (με –SH ομάδα) παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση επιβεβαιώθηκε και από τη μείωση της τελευταίας κατά την τεχνητή αύξηση αυτών των παραμέτρων ύστερα από τη χορήγηση τροποποιητών της ΘΟΚ, γεγονός που θα μπορούσε να αποδοθεί στην εξ αυτών αύξηση της ενδογενούς γλουταθειόνης και της κυστεΐνης. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύεται και από την ανάλογη αντιοξειδωτική επίδραση των χορηγούμενων θειολών-τροποποιητών της ΘΟΚ Ν-ακετυλοκυστεΐνη (που ανιχνεύτηκε και ενδοκυτταρίως) και γλουταθειόνη και της μη πρωτεϊνικής θειολικής ουσίας-μάρτυρα διθειοθρεϊτόλη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόλο που τα επίπεδα της ενδογενούς γλουταθειόνης και του δισουλφιδίου της καθώς και η μεταξύ τους αναλογία συσχετίζονται συνήθως με το οξειδωτικό στρες στη διεθνή βιβλιογραφία, στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι δεν συμβαδίζουν με τους αποδεδειγμένους δείκτες του οξειδωτικού στρες υπεροξείδωση των λιπιδίων και οξειδωτικές βλάβες του DNA. Έτσι, ο ρόλος των ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση αποδεικνύεται περίπλοκος, ένεκα του ότι δεν δρουν μόνο ως άμεσοι αντιοξειδωτές αλλά και ως υποστρώματα των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ΘΟΚ. Τέλος, και στους τέσσερις τύπους σκληρωτίων ανιχνεύθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και βιταμίνης C, καθώς και ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ, υποδηλώνοντας ότι ο πιθανός στόχος της συσσώρευσης όλων των παραπάνω παραμέτρων της ΘΟΚ στα σκληρώτια είναι η αξιοποίησή τους για αντιοξειδωτική προστασία των υφών του μυελού του πυρήνα τους κατά το χρονικό διάστημα της αναπτυξιακής τους στασιμότητας, μέχρι να βρεθούν σε κατάλληλες συνθήκες για βλάστηση. / The aim of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to thiol redox state (TRS) and oxidative stress under the theory of the oxidative induction of sclerotiogenesis (proposed by our lab in 1997). Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. TRS is known to be comprised of many non-protein, protein and mixed thiol and disulfide components, with glutathione being the central component. Since there was not available any appropriate method for the determination of all TRS components, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. Additionally, another new method was developed for the quantification of small-sized fragmented DNA, since the existing methods were qualitative and not discriminating DNA size. Complementarily, oxidative damage of DNA was also estimated by a general DNA damage (nicks and fragments) marker by a published method that was significantly modified. TRS was also evaluated by the measurement of the specific activity of certain enzymes that regulate it, by the quantification of the TRS-related antioxidant vitamin C, as well as by the determination of oxidative damage on membrane lipids. Certain exogenous TRS modulators were also used. The results of this study verified the need for the development of the new methods for the determination of TRS parameters and oxidative damage of DNA, since their use allowed a more accurate estimation of the relation of TRS with oxidative stress. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that TRS components are variously formed and dependent on the type of sclerotial differentiation. This conclusion was based on (a) the existence of different (for each type of sclerotial differentiation) endogenous TRS thiol parameters and TRS-related antioxidant enzymes and (b) the different profiles-concentration gradients of TRS parameters and oxidative markers. Moreover, the direct antioxidant role of the endogenous TRS non-protein thiol parameters in sclerotial differentiation was verified by the decrease of the latter during the endogenous increase of those parameters after administration of the specified TRS-modulating substances. This could be attributed to the resulting by those substances increase of the endogenous glutathione and cysteine. This result was also supported by the antioxidant effect of the administered TRS-modulating thiol substances N-acetylcysteine (which was traced also intracellularly) and glutathione, and of the non-protein control-thiol dithiothreitol. It is worth noting that in spite of the fact that endogenous glutathione, its disulfide, and their resulting ratio are usually considered as oxidative stress markers, it was found that in this study these markers are not in accordance with the specific markers of oxidative stress lipid peroxidation and DNA damage in the evaluation of the role of oxidative stress and TRS in sclerotial differentiation. Thus, the role of the thiol parameters of TRS in sclerotial differentiation is very complicated in light of the fact that they do not act only as direct antioxidants but also as substrates of the studied TRS-related enzymes. Finally, in all sclerotial types have been found high levels of intracellular thiol parameters of TRS and vitamin C as well as enzymes that participate to TRS regulation, implying that their possible role is to provide antioxidant protection of the hyphae of the sclerotial medulla until the environmental conditions become appropriate for their germination.
|
8 |
Ο ρόλος του υπεροξειδίου του υδρογόνου και της ρίζας του σουπεροξειδίου στην σκληρωτιακή διαφοροποίηση των μυκήτωνΠαπαποστόλου, Ιωάννης 05 November 2007 (has links)
Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, S. sclerotiorum, R. solani και S. minor σε σχέση με το οξειδωτικό στρες. Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Τα πιο σημαντικά υπεροξείδια που συμβάλλουν στην δημιουργία οξειδωτικού στρες είναι: α) η ρίζα του σουπεροξειδίου (O2•-), που είναι το πρωταρχικό αίτιο του οξειδωτικού στρες, β) το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), που κυρίως προκύπτει από την ένωση δύο μορίων O2•- (αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής) και γ) τα λιπιδικά υδροϋπεροξείδια (LOOH), που είναι από τα πρώιμα αποτελέσματα του οξειδωτικού στρες, λόγω της προσβολής των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Επειδή λοιπόν στην διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον προσδιορισμό του O2•-, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες, σε όλους τους οργανισμούς. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης των βασικών ενζύμων που σχετίζονται με τα προαναφερθέντα υπεροξείδια τα οποία είναι: α) η δισμουτάση του O2•- (SOD), που επιταχύνει την αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής, β) η καταλάση (CAT), που καταναλώνει το H2O2, γ) οι μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (NSPX) που χρησιμοποιούν το H2O2 και τα LOOH σαν υπόστρωμα για να οξειδώνουν άλλα μόρια και δ) η οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ), που ανιχνεύεται για πρώτη φορά σε μύκητες και είναι υπεύθυνη μεταξύ άλλων και για την παραγωγή του O2•- και H2O2 στους οργανισμούς. Ακόμη, έγινε εκτίμηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων με τη μέτρηση των αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (MDA). Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εξωγενείς τροποποιητές των παραπάνω μορίων: α) μιμητές της SOD β) H2O2 γ) υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου (λιπιδικό υδροϋπεροξείδιο) και δ) αμινοτριαζόλη (αναστολέας της CAT). Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης της νέας μεθόδου ποσοτικοποίησης του O2•-. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι οι σχετιζόμενοι με αυτό παράγοντες που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη μεταβάλλονται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Τα βασικότερα συμπεράσματα αυτής της μελέτης είναι: α) το O2•- φαίνεται ότι παίζει έμμεσο ρόλο στην έναρξη της σκληρωτιογένεσης των μυκήτων S. rolfsii και S. sclerotiorum και άμεσο στων μυκήτων R. solani και S. minor και κύρια πηγή παραγωγής του O2•- είναι τα μιτοχόνδρια και δευτερευόντως η ΧΟ β) η SOD που υπάρχει σε όλους τους μύκητες χρησιμοποιείται από αυτούς για τη μετατροπή του O2•- σε H2O2 γ) η ΧΟ που μέχρι σήμερα δεν ήταν γνωστή η ύπαρξή της στους μύκητες, καθώς και η EC-SOD αλλά και το EC-H2O2, δεν σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και ως γνωστόν μπορεί να εμπλέκονται στην προσβολή των φυτών ξενιστών από τους μύκητες αυτούς δ) το H2O2 επάγει την έναρξη της σκληρωτιογένεσης δρώντας σαν παράγοντας σημειακού κυτταρικού πολλαπλασιασμού ε) η CAT που υπάρχει σε όλους τους μύκητες στο αδιαφοροποίητο μόνο στάδιο, μάλλον χρησιμοποιείται από αυτούς ώστε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός να μην γίνεται σε μεγάλη ένταση και αναστείλλει την σημειακή διαφοροποίηση ζ) οι NSPX που εντοπίζονται σε όλους τους μύκητες φαίνεται ότι ελέγχουν τα επίπεδα του H2O2 κυρίως στο διαφοροποιημένο στάδιο η) τα LOOH φαίνεται να δρουν στις μεμβράνες των μυκήτων και σχετίζονται με διαδικασίες μεταβίβασης κυτταρικών μηνυμάτων που επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο θ) οι μιμητές της SOD Tiron και Tempol, που είχαν ανασταλτική δράση στην διαφοροποίηση θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μη τοξικά αντιμυκητιακά παρασκευάσματα. / The purpose of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to oxidative stress. Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. The most important peroxides that are responsible for oxidative stress are: a) superoxide radical (O2•-), the primary cause element of oxidative stress, b) hydrogen peroxide (H2O2), produced by the reaction between two O2•- (dismutation reaction), and c) lipid hydroperoxides (LOOH), the primary consequences of oxidative destruction due to free radical attack to polyunsaturated fatty acids. Since there was not available any appropriate method for the quantification of O2•-, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. In addition, the estimation of the concentration of certain enzymes that regulate the levels of the peroxides mentioned above was also used. These enzymes are a) superoxide dismutase (SOD), which catalyzes the dismutation reaction, b) catalase (CAT), which destroys H2O2, c) non-specific peroxidases (NSPX), which use either H2O2 or LOOH as substrates in order to oxidize other molecules and d) xanthine oxidase (XO), which was detected for the first time in fungi and is responsible, among other functions, for the production of O2•- in organisms. Furthermore, the aldehydic adducts of lipid peroxidation (MDA) were measured in order to evaluate the oxidative destruction of membrane lipids. Finally, specific externally added modulators of the above molecules were used, like: a) SOD mimetics b) H2O2 c) cumene hydroperoxide (lipid hydroperoxide) and d) aminotriazole (CAT inhibitor). The results of this study verified the need for the development of the new method for the quantification of O2•-. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that its components, tested in this study, are formed and changed variously, depending on the type of sclerotial differentiation. The most important conclusions of this study are: a) O2•- plays an indirect role in the initiation of sclerotiogenesis in fungi S. rolfsii and S. sclerotiorum, while in R. solani and S. minor its role is direct, and the main source that produces it in all four fungi are mitochondria and secondarily the ΧΟ enzyme, b) SOD is used by these fungi in order to convert O2•- to H2O2 via the dismutation reaction, c) ΧΟ which was found for the first time in fungi as well as EC-SOD and EC-H2O2, are not related with differentiation and possibly they are involved in tha attack of target plants by these fungi, d) H2O2 induces the initiation of sclerotiogenesis acting as a cell proliferating factor, e) CAT which was found in all fungi only in the undifferentiated stage, is probably used by them in order to control cell proliferation so as to avoid inhibition of sclerotiogenesis, f) NSPX are possibly used by these fungi in order to control H2O2 concentration mainly in the differentiated stage, g) LOOH appear to act on cell membrane and are related to signal transduction processes which affect cell cycle and h) SOD mimetics Tiron and Tempol, which reduced differentiation could be used as non-toxic fungicides.
|
9 |
Έκφραση της λαμινίνης και της εντακτίνης κατά την ανάπτυξη του πρώϊμου εμβρύου / Expression of laminin and entactin during development of the early embryoΣταυρίδης, Βασίλης 24 June 2007 (has links)
Οι εξωκυττάριες ουσίες παράγονται από τα κύτταρα, εκκρίνονται από αυτά και αλληλεπιδρώντας τόσο μεταξύ τους όσο και με τα κύτταρα ρυθμίζουν πολλές αναπτυξιακές πορείες. Μελετήσαμε τη χρονική και τοπική εμφάνιση των mRNAs της εντακτίνης και της λαμινίνης, γλυκοπρωτεϊνών των εξωκυττάριων ουσιών, στο πρώϊμο έμβρυο όρνιθας. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνική της in situ υβριδοποίησης, που κατέδειξε διαφορική έκφραση της εντακτίνης και των αλυσίδων της λαμινίνης σε ξεχωριστούς κυτταρικούς πληθυσμούς και όργανα σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου. Επίσης μελετήσαμε την χρονική και τοπική κατανομή του πολυπεπτι- δίου της εντακτίνης από το στάδιο του μοριδίου ως την αρχή της οργανογένεσης με τις τεχνικές του ανοσοφθορισμού και της ανοσοκατακρήμνισης. Ανιχνεύσαμε την παρουσία της εντα-κτίνης ήδη από το στάδιο του όψιμου μοριδίου. Με τη χρήση αντισωμάτων για την εντακτίνη μελετήσαμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη του πρώϊμου εμβρύου. Στα αποτελέσματά μας φάνη-κε οτι η εντακτίνη είναι απαραίτητη για το σωστό προσανατο-λισμό των κυττάρων καθώς μεταναστεύουν κατά την γαστριδίω-ση. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή του σχηματισμού του εμβρυϊκού άξονα. / The extracelular matrix is a complex cell product which regulates many developmental processes. We used specific antisense RNA probes for the laminin α1, β1 and γ1 chains and for entactin, two extracellular matrix glycoproteins, to study the tissue specific and temporal patterns of their mRNAs in the early chick embryo. Our work employing in situ hybridization, showed strong signals of the laminin and of entactin mRNAs at the morula stage and differential express-ion of these mRNAs in the forming embryonic tissues and organs in the developing chick embryo. We also studied the time of appearance and subsequent distribution of the entactin polypeptide using immunofluorescence and immunopre-cipitation from the morula stage up to the early organogene-sis in the chick embryo. The first presence of entactin was detected at the late morula stage and showed differential expression in the various cell populations in the develop- ing embryo. To study the role of entactin in the major cell-ular migrations during gastrulation we used blocking anti- bodies in set of functional studies. Entactin seemed to be essential for the directional migrations of cells during gastulation and the embryonic axis was not formed in the embryos treated with the anti-entactin antibodies.
|
10 |
Διερεύνηση του ρόλου της Geminin στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση αρχέγονων/προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος σε γενετικά τροποποιημένους μύεςΚαραμήτρος, Δημήτριος 30 May 2012 (has links)
Κατά την ανάπτυξη ενός οργανισμού η απόκτηση εξειδικευμένων κυτταρικών λειτουργιών είναι μια προοδευτική διαδικασία η οποία περιλαμβάνει την ασύμμετρη διαίρεση των βλαστικών κυττάρων για την παραγωγή προγονικών κυττάρων τα οποία σταδιακώς εξέρχονται από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποιούνται μέσω της εγκαθίδρυσης του κατάλληλου μεταγραφικού προγράμματος. Προκειμένου να κατανοήσουμε τη ρύθμιση αυτών των γεγονότων μελετήσαμε την Geminin, ένα κεντρικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, στο ανοσοποιητικό σύστημα.
Δημιουργήσαμε ζωικά μοντέλα στα οποία απενεργοποιήσαμε το γονίδιο της Geminin στα λεμφοκύτταρα. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η απενεργοποίηση της Geminin στα λεμφοκύτταρα δεν επηρεάζει σημαντικά τη διαφοροποίηση των προγονικών Τ κυττάρων στο θύμο. Απουσία της Geminin τα προγονικά θυμοκύτταρα δεσμεύονται προς διαφοροποίηση στην Τ κυτταρική σειρά και παράγουν διαφοροποιημένα θυμοκύτταρα. Παρατηρήθηκαν μικρές μειώσεις στον αριθμό των DN1, DN4 και DP κυττάρων. Σε αντίθεση τα αθώα (naïve), ρυθμιστικά (regulatory) και Τ κύτταρα μνήμης (memory T cells), παρουσίασαν σημαντικές μειώσεις απουσία της Geminin. Επιπλέον βρήκαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των περιφερικών Τ κυττάρων ύστερα από την ενεργοποίηση τους μέσω του TCR υποδοχέα παρουσίασε σημαντικές ανωμαλίες ενώ παρατηρήθηκαν και σημαντικές διαταραχές της προόδου του κυτταρικού κύκλου απουσία της Geminin. Οι μεταβολές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση του Cdt1 και σε κυκλίνες των ενεργοποιημένων περιφερικών Τ κυττάρων μπορεί να εμπλέκονται στο μηχανισμό που εξηγεί τις διαταραχές των περιφερικών Τ κυττάρων απουσία της Geminin. Επίσης Τ κύτταρα από τα οποία είχε απενεργοποιηθεί η Geminin δεν είναι ικανά να αποικίσουν τα λεμφοειδή όργανα μυών από τους οποίους απουσιάζουν τα λεμφοκύτταρα, αποτέλεσμα το οποίο δείχνει διαταραχές του ομοιοστατικού πολλαπλασιασμού αυτών των κυττάρων. Συμπερασματικά η Geminin είναι απαραίτητη για την αυστηρή ρύθμιση των επαναλαμβανόμενων κυτταρικών διαιρέσεων των περιφερικών Τ κυττάρων αλλά δεν επηρεάζει σημαντικά την διαφοροποίηση των προγονικών Τ κυττάρων. Επιπλέον τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι υπάρχουν εγγενείς διαφορές στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μεταξύ θυμοκυττάρων και περιφερικών Τ κυττάρων. / During development, acquisition of specialized function is a progressive, gradual process that involves the asymmetric divisions of stem cells to generate progeny that will exit the cell cycle and terminally differentiate through the establishment of an appropriate transcriptional program. In order to understand this process we studied Geminin, a key cell cycle regulator, that has been shown to affect cellular decisions of differentiation. Towards this direction we focused on the immune system and investigated the role of Geminin in self-renewal and differentiation of stem and progenitor cells.
In order to gain insight into the in vivo role of Geminin in progenitor cell division and differentiation, we have deleted Geminin in cells of the lymphoid lineage. The inactivation of Geminin in the lymphoid lineage does not alter progenitor T cell differentiation in the thymus. In the absence of Geminin progenitor T cells commit, differentiate and generate differentiated thymocytes. Minor reduction in the number of DN1, DN4 and DP progenitor T cells were observed. In contrast naïve, regulatory and memory peripheral T cells show a significant reduction in the absence of Geminin. Moreover, proliferation of Geminin deficient peripheral T cells upon TCR activation is severely compromised, accompanied by cell cycle progression defects. The deregulated protein levels of Cdt1 and cyclins in activated peripheral T cells lacking Geminin, may be involved in the mechanism responsible for the observed phenotype of Geminin deficient peripheral T cells. More importantly Geminin deficient T cells fail to repopulate lymphopenic hosts suggesting defects in homeostatic proliferation. In conclusion Geminin is essential to regulate the repeated divisions of peripheral T cells but does not significantly affect progenitor T cell differentiation. In addition our results suggest that there are intrinsic differences in cell cycle regulation of thymocytes and peripheral T cells.
|
Page generated in 0.0275 seconds