Ο μεταγραφικός παράγοντας COUP-TF είναι ένας ορφανός πυρηνικός υποδοχέας, ο οποίος είναι πολύ σημαντικός κατά την εμβρυική ανάπτυξη. Στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε η μελέτη του φυσιολογικού ρόλου του COUP-TFII των θηλαστικών κατά την αναγέννηση του σκελετικού μυός, χρησιμοποιώντας ως μοντέλο διαφοροποίησης τη μυοβλαστική σειρά ποντικού C2C12, που προέρχεται από ενήλικα βλαστικά κύτταρα του ίδιου μυός. Ο mCOUP-TFII εμπλέκεται στη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρδιαγγειακού συστήματος, της μυογένεσης και άλλων αναπτυξιακών διαδικασιών. Έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τη διαφοροποίηση των μυοβλαστών C2C12 σε μυοσωλήνες, κυρίως μέσω καταστολής της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων μυογένεσης MyoD και Myogenin. Επίσης, η έκφρασή του στους μυοβλάστες C2C12 καταστέλλεται με την έναρξη της διαφοροποίησης. Αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, έχουν δείξει ότι μέσω εναλλακτικού ματίσματος στο mRNA του PlCOUP-TF του αχινού προκύπτουν δύο ισομορφές του υποδοχέα που διαφέρουν ως προς ένα εξώνιο 21 αμινοξέων στην DBD. H μικρή ισομορφή είναι λειτουργικός μεταγραφικός παράγοντας και δρα ως ομοδιμερές, ενώ η μεγάλη ισομορφή και τα ετεροδιμερή των δυο ισομορφών εμφανίζουν αδυναμία πρόσδεσης στο DNA. Με αυτόν τον τρόπο, η μεγάλη ισομορφή ρυθμίζει την ποσότητα του λειτουργικού μεταγραφικού παράγοντα, δρώντας ως επικρατής κατασταλτική πρωτεΐνη. Αρχικά, μελετήθηκαν οι ιδιότητες πρόσδεσης του mCOUP-TFII και η δυνατότητα σχηματισμού ετεροδιμερών με τη μεγάλη ισομορφή του PlCOUP-TF (L.I.) μέσω δοκιμής in vitro πρόσδεσης (EMSA), δεδομένης της ικανότητας ετεροδιμερισμού του hCOUP-TFI με την ομόλογη πρωτεΐνη του αχινού. Βρέθηκε ότι ο mCOUP-TFII δύναται να προσδεθεί στο στοιχείο απόκρισης C1R με τη μορφή ομοδιμερών και έχει ικανότητα ετεροδιμερισμού με τη PlCOUP-TF L.I. Τα ομοδιμερή του mCOUP-TFII εμφάνιζαν μειούμενη πρόσδεση στο DNA, όσο αυξανόταν ο λόγος PlCOUP-TF L.I./mCOUP-TFII. Ο απώτερος στόχος της έρευνας ήταν η μελέτη του ρόλου του mCOUP-TFII στη μυϊκή διαφοροποίηση, μέσω της υπερέκφρασης της επικρατούς κατασταλτικής PlCOUP-TF L.I. σε καλλιέργειες κυττάρων C2C12. Η αρχική μας υπόθεση ήταν ότι η PlCOUP-TF L.I. δύναται να δράσει ως επικρατής κατασταλτική ισομορφή του mCOUP-TFII, μέσω σχηματισμού μη λειτουργικού ετεροδιμερούς μαζί του. Σε αυτή την περίπτωση, θα αναμενόταν η PlCOUP-TF L.I. να καταστείλει τη δράση του ενδογενούς mCOUP-TFII των κυττάρων C2C12, με αποτέλεσμα την επαγωγή της διαφοροποίησης των μυοβλαστών. Αντιθέτως, η υπερέκφραση του mCOUP-TFII, θα αναμενόταν να συντελέσει στη διατήρηση της αδιαφοροποίητης κατάστασης των μυοβλαστών. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στις δράσεις των δυο COUP-TFs, ωστόσο, από τα πειράματα αυτά δεν μπορεί να εξαχθεί κάποιο ασφαλές συμπέρασμα αναφορικά με το ρόλο του mCOUP-TFII στη διαφοροποίηση των μυοβλαστών και τη δυνατότητα in vivo αλληλεπίδρασης μεταξύ των δυο υποδοχέων. / The transcription factor COUP-TF is an orphan nuclear receptor, which is very important during embryonic development. In the present dissertation, we attempted to study the physiological role of mammalian COUP-TFII during skeletal muscle regeneration, by use of the myoblast cell line C2C12, which originates from adult stem cells of skeletal muscle, as a model system of cell differentiation. mCOUP-TFII is involved in the regulation of cardiovascular system development, myogenesis and other developmental processes. It has been shown to inhibit the differentiation of C2C12 myoblasts to myotubes, mainly through suppression of the myogenic regulatory factors MyoD and Myogenin gene expression. Moreover, its expression in C2C12 myoblasts is suppressed at the onset of differentiation. Alternative splicing of the sea urchin PlCOUP-TF mRNA results in two isoforms, which differ by a 21 aa insertion in the DBD (unpublished data). The small isoform is a functional transcription factor that acts as a homodimer, while the large isoform and the heterodimers of the two isoforms fail to bind DNA. In this way, the large isoform regulates quantitatively the functional transcription factor, acting as dominant negative protein. Initially, by using in vitro binding assays (EMSA), we studied the binding properties of mCOUP-TFII and the possibility of forming heterodimers with the large isoform of PlCOUP-TF (L.I.), provided that hCOUP-TFI has been reported to be able to heterodimerize with the sea urchin homologue. We found that mCOUP-TFII is capable of binding the C1R response element as a homodimer and of forming heterodimers with PlCOUP-TF L.I. The binding of mCOUP-TFII homodimers has been shown to reduce as the ratio PlCOUP-TF L.I./mCOUP-TFII increases. The ultimate goal of this research, was the study of the role of mCOUP-TFII in muscle differentiation via overexpression of the dominant negative PlCOUP-TF L.I. in C2C12 cell cultures. Our initial assumption was that PlCOUP-TF L.I. is capable of acting as a dominant negative isoform of mCOUP-TFII, by forming non functional heterodimers with it. In this case, PlCOUP-TF L.I. would be expected to suppress the action of endogenous mCOUP-TFII in C2C12 cells. In contrast, overexpression of mCOUP-TFII would be expected to contribute to the maintenance of myoblasts in an undifferentiated state. We did not observe any difference in the actions of the two COUP-TFs, however, we cannot report any result regarding either the role of mCOUP-TFII in myoblast differentiation or the ability of in vivo interaction between these receptors.

Οι μεταγραφικοί παράγοντες COUP-TF (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor) ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων στεροειδών/ θυρεοειδών ορμονών και θεωρούνται “ορφανοί”, αφού μέχρι στιγμής δεν έχει βρεθεί το υπεύθυνο πρόσδεμα για την ενεργοποίηση τους. Πειραματικές διαδικασίες στο εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι στο πρωτογενές μετάγραφο των COUP-TFs συμβαίνει εναλλακτικό μάτισμα που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δύο mRNAs που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες οι οποίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επίπρόσθετων αμινοξέων στην καρβοξυτελική περιοχή (Carboxy Terminal Extension) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Πειράματα EMSA με τη χρήση in vitro μεταφρασμένων πρωτεϊνών, αποκάλυψαν ότι η μεγάλη πρωτεΐνη δεν μπορεί να προσδεθεί σε κανένα COUP-TF στοιχείο απόκρισης. Επίσης παρατηρήθηκε ότι παρουσία της μεγάλης πρωτεΐνης, η ικανότητα της μικρής πρωτεΐνης να προσδένεται στο DNA μειώνεται με ανταγωνιστικό τρόπο, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι το ετεροδιμερές πρωτεϊνικό σύμπλοκο δεν μπορεί να προσδεθεί στο DNA. Σκοπός μας είναι να ερευνήσουμε το ρόλο της ένθεσης των 21 αμινοξέων στην μεγάλη πρωτεΐνη, ως προς την ικανότητα πρόσδεσης της στο DNA. Στον αχινό Paracentrotus lividus, η αμινοξική ένθεση στην καρβοξυτελική περιοχή (CTE) της μεγάλης πρωτεΐνης περιέχει δύο προλίνες. Η υπόθεση μας είναι ότι αυτές οι δύο προλίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην στερεοδιαμόρφωση της πρωτεΐνης, επηρεάζοντας την ικανότητα πρόσδεσης στο DNA. Για να ελέγξουμε την υπόθεση αυτή, προκαλέσαμε σημειακές μεταλλάξεις, μεταλλάσσοντας συγχρόνως τις δύο προλίνες σε αλανίνες αλλά κάθε μία προλίνη σε αλανίνη μεμονωμένα, καθώς επίσης μελετήσαμε και μια σειρά εσωτερικών αμινοξικών ελλειμάτων μέσα στην ένθεση των 21 αμινοξέων στην καρβοξυτελική περιοχή. Το σύνολο των μεταλλάξεων έδειξε ότι οι μεταλλαγμένες μεγάλες πρωτεΐνες δεν προσδένονται στο DNA καθώς επίσης ότι οι μεταλλαγμένες μεγάλες πρωτεΐνες ετεροδιμερίζονται πιο αποτελεσματικά με την μικρή ισομορφή πιθανότατα λόγω επαγόμενης αλλαγής της στερεοδιαμόρφωσης της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Επίσης μελετήσαμε την εξάπλωση του εναλλακτικού ματίσματός στα Δευτεροστόμια, χρησιμοποιώντας ειδικούς εκφυλισμένους εκκινητές σε πειράματα PCR. Εναλλακτικό μάτισμα των μεταγράφων COUP-TF παρατηρήθηκε επίσης στους οργανισμούς Sphaerechinus granularis (Εχινόδερμο) και Saccoglossus kowalevskii (Ημιχορδωτό). / COUP-TFs (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter- Transcription Factors) belong to the superfamily of steroid/thyroid hormone receptors and they are consider orphans since the proper ligand that activates them is not yet found. Experimental procedures in our laboratory have shown that in Echinoderms the alternative splicing of the COUP-TF primary transcript results in two mRNAs which encode two protein variants that differ by a 21 amino acid insertion in the Carboxy Terminal Extension (CTE) of the DNA Binding Domain (DBD). EMSA experiments with the use of in vitro translated proteins revealed that the large protein variant is incapable of binding any COUP-TF response elements. Furthermore, in the presence of the large variant, the small COUP-TF protein ability to bind DNA is diminished in an antagonistic way, suggesting that the heterodimeric protein is also incapable of DNA binding. Our aim is to investigate the role of the 21aa insertion in the large variant regarding the DNA binding affinity. In sea urchins the CTE insertion in the large variant contains two prolines. Our hypothesis is that these two prolines play an important role in the protein‟s conformation which in turn is responsible for the loss of DNA binding. To check this, we created point mutations by mutating both prolines to alanines simultaneously and then each proline to alanine separately. We also analyzed a series of internal amino acid deletions within the 21aa insertion of the CTE. All the mutations proved that the large mutated proteins are incapable of binding DNA and that they heterodimerize more effectively with the small protein variant possibly because of the changed conformation of the large protein variant. We also studied the alternative splicing among Deuterostomes, by using degenerate primers in PCR experiments. We observed that alternative splicing of COUP-TF transcripts occurs in the sea urchin Sphaerechinus granularis and in the hemichordate Saccoglossus kowalevskii.