La famille des protéines MTA (Metastasis Tumor Antigen) compte trois membres MTA1, 2 et 3 qui diffèrent au niveau de leur extrémité C-terminale, une région désorganisée. La région N-terminale est impliquée dans l’interaction avec le complexe corépresseur NuRD. NuRD est recruté par des facteurs de transcription au niveau de leurs gènes cibles pour réprimer la transcription. Les protéines HIC1 et BCL11 recrutent le complexe NuRD via les protéines MTA afin de réprimer leurs gènes cibles.Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux modalités d’interactions entre les protéines HIC1 et BCL11 interagissant toutes deux avec l’extrémité C-terminale des protéines MTA. Dans ce cadre, nous avons montré que l’interaction HIC1-BCL11 ne semble pas jouer un rôle direct dans la régulation synergique de gènes cibles communs. Ensuite, nous avons montré que les protéines BCL11 interagissent avec les trois protéines MTA via leur motif N-terminal conservé MSRRKQ pour recruter différents complexes NuRD. De plus, la phosphorylation de la Sérine 2 de BCL11B médiée par PKC (Protein Kinase C) lors de l’activation des lymphocytes T CD4+, régule son activité de facteur de transcription. De plus, nous avons identifié CXCL12/SDF1 comme nouveau gène cible de HIC1 dans les lymphocytes T CD4+. Cette chimiokine est le ligand commun aux récepteurs CXCR4 et CXCR7 impliqués dans la migration et le « homing » des cellules de l’immunité. Enfin, nous avons également identifié deux nouveaux gènes cibles de HIC1 : ApoER2 et VLDLR codant tous deux des récepteurs à la Reelin. Cette voie de signalisation est impliquée dans la migration des précurseurs neuronaux lors du développement du cervelet. / MTA (Metastasis Tumor Antigen) proteins family is composed of three members: MTA1, 2 and 3 which differ in their C-terminus, a disorganized domain. The N-terminal region is involved in the interaction with the NuRD corepressor complex. NuRD is recruited by transcription factors at their target genes to repress transcription. HIC1 and BCL11 proteins recruit NuRD through interaction with MTA proteins to repress their target genes. In the first part of my work, we have deciphered the mechanisms of interactions between HIC1 and BCL11 proteins which both also interacted with MTA proteins. In this context, we showed that HIC1-BCL11 interaction does not allow the direct synergistic repression of common target genes. In the second part of my work, we showed that BCL11 proteins interact with the three MTA members via their conserved MSRRKQ motif to recruit NuRD complexes. Furthermore, we identified the PKC (Protein Kinase C)-mediated phosphorylation of BCL11B Serine 2 which regulates its transcription factor’s activity during activation of human CD4+ T lymphocytes. In fact, the phosphorylation of BCL11B Serine 2 allows the switch from a transcriptional repressor to an activator during TCR activation of human CD4+ T cells. In parallel to this work, we identified SDF1 as a new direct target gene of HIC1 in these cells. The SDF1 chemokine is the common ligand for chemokine receptors CXCR4 and CXCR7 involved in the migration and in the homing of immune cells. In addition, we also identified two other new direct target genes of HIC1: ApoER2 and VLDLR encoding both receptors for Reelin. This signaling pathway is involved in the migration of neuronal precursors during cerebellar development.

Τα τελευταία χρόνια, πολλά εργαστήρια έχουν επικεντρώσει το ενδιαφέρον τους στο 5S rRNA, το μικρότερο RNA συστατικό του ριβοσώματος. Ο ακριβής ρόλος του 5S rRNA στο ριβόσωμα, την πρωτεϊνική βιοσυνθετική μηχανή, δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Αποτελέσματα δομικών μελετών τοποθετούν το 5S rRNA στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Ευρήματα που αφορούν σχέσεις δομής και λειτουργίας οδηγούν στην υπόθεση, ότι σταθεροποιεί τη δομή του ριβοσώματος και λειτουργεί ως φυσικός μεταδότης πληροφοριών μεταξύ λειτουργικών κέντρων. Από την άλλη πλευρά, το ιοντικό περιβάλλον επηρεάζει άμεσα τη ριβοσωματική λειτουργία. Μονοσθενή και δισθενή κατιόντα, καθώς και πολυκατιόντα, όπως οι πολυαμίνες, παρεμβαίνουν στη ριβοσωματική διαμόρφωση και συνεπώς εμπλέκονται άμεσα στη λειτουργία του ριβοσώματος. Προκαρτατικές μελέτες στο εργαστήριό μας έχουν δείξει ότι οι πολυαμίνες, και συγκεκριμένα η σπερμίνη, σταθεροποιούν την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του 5S rRNA, οδηγώντας σε μια πιο συνεκτική διαμόρφωση του μορίου. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της διαμόρφωσης του 5S rRNA στην πρωτεϊνική σύνθεση του εντεροβακτηρίου E.coli. Παράλληλος στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης των πολυαμινών στη δομή και λειτουργία τόσο του 5S rRNA, όσο και ολοκλήρου του ριβοσωματικού συμπλόκου. Η πρόσδεση των πολυαμινών στο 5S rRNA μελετήθηκε με τη μέθοδο της φωτοσήμανσης συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως μοριακό ανιχνευτή ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την ΑΒΑ-σπερμίνη. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της πρόσδεσης και προσδιορίστηκαν οι θέσεις δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA, είτε αυτό ήταν ελεύθερο, είτε ενσωματωμένο σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες ή 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα από E.coli. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι σε ελεύθερο 5S rRNA, η σπερμίνη προσδένεται κυρίως σε νουκλεοτίδια των ελίκων III και V και στις θηλιές Α, C, D και E. Ενσωμάτωση του 5S rRNA σε 50S υπομονάδες ή 70S poly(U)-προγραμματισμένα ριβοσώματα, είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της επιδεκτικότητας των νουκλεοτιδίων του στην ΑΒΑ-σπερμίνη. Ακολούθησε διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης του φωτοαναλόγου στη δομή του 5S rRNA. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα χημικής τροποποίησης, τα οποία αποκάλυψαν ότι ανεξάρτητα από το αν το 5S rRNA είναι ελεύθερο ή συναρμολογημένο σε 50S υπομονάδες ή σε 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα, η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνης προκαλεί σημαντικές αλλαγές στη διαμόρφωση του μορίου. Η θηλιά Α υιοθετεί μια πιο χαλαρή δομή, ενώ οι θηλιές C, D και E και η έλικα III μια πιο συνεκτική δομή. Με την διαπίστωση των αλλαγών της διαμόρφωσης του 5S rRNA λόγω της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης, κρίθηκε ενδιαφέρον να μελετηθεί αν αυτές οι διαμορφωτικές αλλαγές επηρεάζουν θεμελιώδεις λειτουργίες του ριβοσώματος. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα του να συναρμολογείται σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνη στο 5S rRNA, δεν καταργεί την διαδικασία συναρμολόγησης των 50S υπομονάδων, παρεμποδίζει όμως τις απαιτούμενες δομικές αλλαγές με το να σταθεροποιεί μια πιο συνεκτική δομή του 5S rRNA, θερμοδυναμικά λιγότερο ευνοϊκή για την πορεία. Παρά το γεγονός ότι η πρόσδεση της σπερμίνης στο 5S rRNA επιφέρει στο μόριο δομικές αλλαγές που εμποδίζουν την συναρμολόγηση του σε 50S υπομονάδες, όταν αυτές σχηματιστούν, αποκτούν δομή τέτοια που επιτρέπει την αλληλεπίδρασή τους με τις 30S υπομονάδες. Ωστόσο, η παρουσία του 5S rRNA φαίνεται να είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό ενεργών 50S υπομονάδων, αφού η απουσία του 5S rRNA δεν επιτρέπει ούτε το σχηματισμό ακέραιων υπομονάδων, ούτε την σύζευξη των υπομονάδων προς ακέραια ριβοσωματικά σύμπλοκα. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rRNA, αρχικά στην ικανότητα των ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα και στη συνέχεια, στην καταλυτική δράση αυτών. Φωτοσήμανση του 5S rRNA με ΑΒΑ-σπερμίνη προκάλεσε μικρή, αλλά σαφή ενεργοποίηση της πρόσδεσης υποστρώματος στην Ρ-θέση, σε αντίθεση με την πρόσδεση στην Α-θέση, η οποία δε φαίνεται να επηρεάζεται. Σαφής ήταν, επίσης, η επίδραση στην ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης: Παρατηρήθηκε αύξηση μέχρι και 30% στη δραστικότητα της ΡΤασης. Ιδιαίτερης σημασίας είναι το εύρημα, ότι ριβοσώματα ελλιπή σε 5S διατηρούν ~10% της δράσης της ΡΤασης, γεγονός που οδηγεί στη υπόθεση ότι το 5S rRNA δεν είναι απολύτως απαραίτητο για τη κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού. Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην μετατόπιση υποστρωμάτων, αρχικά στην αυθόρμητη (μη ενζυμική) και στη συνέχεια στην EF-G-καταλυόμενη μετατόπιση. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την υπόθεση, ότι η μετατόπιση υποστρωμάτων είναι έμφυτη ιδιότητα του ριβοσώματος. Παράλληλα, κατέδειξαν ότι η πρόσδεση σπερμίνης στο 5S rRNA διεγείρει την μη ενζυμική μετατόπιση, πιθανόν μέσω αλλαγών στην αναδίπλωση του rRNA, οι οποίες μεταδίδονται στα ριβοσωματικά κέντρα που είναι υπεύθυνα για αυτή τη λειτουργία. Περαιτέρω, η παρουσία σπερμίνης στο 5S rRNA, μείωσε τις απαιτήσεις για EF-G. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγηθεί είτε με μια πιθανή ευεργετική δράση της σπερμίνης στην δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, είτε με την επίδρασή της στο στάδιο της υδρόλυσης του GTP. Για να διευκρινίσουμε ποια από τις δυο εκδοχές ευσταθεί, μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G και στη συνέχεια στην ικανότητα τους να ενεργοποιούν την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση. Βρέθηκε ότι, η παρουσία σπερμίνης στο μόριο του 5S rRNA, ευνοεί τη δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα. ¨Όσο αφορά την ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης δεν επηρεάζεται από την παρουσία σπερμίνης, αποτέλεσμα που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rRNA δεν επηρεάζει την GTP υδρόλυση. Απουσία του 5S rRNA, τα ριβοσώματα διατηρούν κάποια δραστικότητα GTPασης, αλλά δεν είναι ικανά να δεσμεύουν αποτελεσματικά τον EF-G, ακόμη και παρουσία σπερμίνης. Λαμβάνοντας υπόψη, ότι η θέση δέσμευσης του EF-G στο ριβόσωμα βρίσκεται στα domain II και VI του 23S rRNA και ότι απευθείας επαφές του 5S rRNA με αυτές τις περιοχές ή με τον EF-G δεν έχουν βρεθεί, οδηγούμαστε στην υπόθεση ότι, το 5S rRNA, μέσω αλλοστερικών σημάτων, επηρεάζει την EF-G-GTP δέσμευση στο ριβόσωμα, όχι όμως και την GTP υδρόλυση. Για να επιβεβαιώσουμε τα παραπάνω, μελετήθηκε η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rRNA, στη διαμορφωτική κατάσταση θεμελιωδών λειτουργικών κέντρων του ριβοσώματος. Η μελέτη εστιάστηκε στην ικανότητα του 5S rRNA να επηρεάζει τα κέντρα πρόσδεσης του EF-G στο ριβόσωμα, καθώς και τις θέσεις Α- και Ρ- του ριβοσωμικού συμπλόκου. Διαπιστώθηκε ότι η αλληλεπίδραση ελεύθερης σπερμίνης με το ριβόσωμα ενισχύει το αποτύπωμα (footprinting) χημικής προστασίας νουκλεοτιδίων υπευθύνων για την πρόσδεση του ΕF-G και τη συγκρότηση της Ρ-θέσης, όχι όμως και της Α-θέσης. Παρόμοια, αλλά μικρότερου βαθμού, ήταν και η επίδραση της προσδενομένης επιλεκτικά ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA. Συμπερασματικά, το 5S rRNA περιέχει θέσεις εξειδικευμένης πρόσδεσης πολυαμινών, οι οποίες επηρεάζουν την τριτοταγή του διαμόρφωση. Η δέσμευση της σπερμίνης στο 5S rRNA φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά την ικανότητα της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας να δεσμεύει υπόστρωμα, βελτιώνει όμως την καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος και την ικανότητα του να μετατοπίζει τα υποστρώματα. Οι πολυαμίνες ενεργοποιούν την δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, αλλά ελάχιστα επηρεάζουν την υδρόλυση του GTP από τον EF-G. Εν κατακλείδι, το 5S rRNA φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγωγή σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου και της περιοχής πρόσδεσης EFG. / In recent years, many research groups have focused their interest on 5S rRNA, the smallest RNA component of the ribosome that is preserved in almost all organisms. Its precise role in the ribosome, the protein “biosynthetic machine”, has not been fully clarified. The results of structural studies place 5S rRNA in the large ribosomal subunit. Findings concerning relations between structure and function lead to the assumption that 5S rRNA stabilises the structure of the ribosome and acts as natural transmitter of information between functional centres. On the other hand, the ionic environment directly affects ribosome function. Monovalent and divalent ions as well as polycations, such as polyamines, influence the ribosomal conformation, and therefore are involved in the function of the ribosome. Preliminary studies in our laboratory have shown that polyamines, namely spermine, stabilize the secondary and tertiary structure of 5S rRNA, leading to a more cohesive configuration of the molecule. The aim of this thesis was to investigate the role of 5S rRNA configuration in protein synthesis of the enterobacterium E.coli. At the same time, the biological activity of polyamines in the structure and functioning of both 5S rRNA and the whole ribosomal complex was studied. Polyamine binding to 5S rRNA was investigated by photoaffinity labeling, using a photoreactive analogue of spermine, ABA-spermine, as a molecular probe. Kinetic study was performed and the number of cross-linking sites of ABA-spermine in free 5S rRNA, or 5S rRNA incorporated into 50S subunits or 70S ribosomal complexes from E.coli ribosomes was determined. The results revealed that in free 5S rRNA spermine binds mainly to nucleotides of helices III and V and loops A, C, D and E. Integration of 5S rRNA into 50S subunits or 70S poly (U) – programmed ribosomes results in a great reduction of the susceptibility of 5S rRNA to ABA-spermine. The impact of the ABA-spermine photo-incorporation into the 5S rRNA molecule was then investigated. Chemical modification experiments revealed that, regardless of whether 5S rRNA is free or assembled in 50S subunits or 70S ribosomal complexes, binding of ABA-spermine causes significant changes in the conformation of the molecule. Loop A adopts a “looser” structure, while loops C, D, E and helices III and V achieve a more compact folding. With the discovery of changes in the configuration of 5S rRNA, due to ABA-spermine’s binding, it was interesting to study whether these conformational changes influence fundamental functions of the ribosome. Initially, the effect of changing the configuration of 5S rRNA on 50S subunit and 70S ribosomal complex assembly was investigated. The results showed that binding of ABA-spermine to 5S rRNA does not eliminate the process of 50S subunit assembly, but impedes the necessary structural changes by stabilising a more coherent structure of 5S rRNA, thermodynamically less favourable for the process. Despite the fact that binding of ABA-spermine to 5S rRNA results in structural changes that reduce the assembly of 50S subunits, when the later are formed they acquire such a structure that allows their interaction with 30S subunits. Nevertheless, the presence of 5S rRNA seems to be necessary for the formation of active 50S subunits, since 5S RNA-depleted ribosomal subunits do not associate with 30S subunits to functional 70S ribosomes. Next, the effect of photolabeling 5S rRNA was studied, initially on the ability of ribosomes to bind substrate, and then on their catalytic activity. Photolabeling of 5S rRNA with ABA-spermine caused a small but obvious activation in AcPhe-tRNA binding to the P-site. In contrast, binding to the A-site did not appear to be affected. Of great importance was the effect on the activity of peptidyl-transferase; in the presence of spermine, an increase of up to 30% on the activity of PTase was observed. Interestedly, ribosomes that lack 5S rRNA maintained ~ 10% of PTase activity, which leads to the assumption that 5S rRNA is not absolutely necessary for the formation of peptide bonds. The study of the effect of 5S rRNA conformational changes on ribosome's ability to translocate substrates followed. Spontaneous (non-enzymatic) translocation was studied first, and then, EF-G-catalyzed translocation. The results confirmed the assumption that translocation of substrates is an inherent property of the ribosome itself, even though extremely slow. At the same time, it was shown that binding of spermine to 5S rRNA, stimulates non-enzymatic translocation, possibly through changes in the folding of ribosomal RNA, that are beneficial in translocating tRNAs. Further, the presence of spermine in 5S rRNA reduced the requirements for EF-G. This result can be explained either by a possible beneficial effect of spermine to the binding of EF-G to the ribosome, either through its impact in the process of hydrolysis of GTP. To clarify which of the two versions is accurate, we studied the effect of 5S rRNA conformational changes on the ribosomal ability to bind EF-G, and then on their ability to trigger EF-G-dependent GTP hydrolysis. It was found that the presence of spermine in 5S rRNA promotes EF-G binding to ribosomes. In contrast, the results of the study showed that the initial rate of GTP hydrolysis was not influenced by the presence of spermine. Ribosomes depleted of 5S rRNA retained some GTP activity, but were unable to effectively bind EF-G even in the presence of spermine. Taking into account that EF-G binds in domain II and VI of 23S rRNA, but direct contacts of 5S rRNA with these areas or with EF-G have not been found, we are led to the conclusion that 5S rRNA affects EF-G-GTP binding to ribosomes, through allosteric signals, without affecting the EF-G-mediated GTP hydrolysis. To confirm the above, we studied the effect of the ionic environment and the changes in the tertiary structure of 5S rRNA on the conformational state of fundamental functional centres in the ribosome. Specifically, the study was focused on the ability of free spermine or photolabeling 5S rRNA with ABA-spermine to affect the SRL and GAC regions of the ribosome as well as the A-and P-sites. It was found that interaction of free spermine with ribosomes intensifies the footprint of EF-G within the ribosome and induces the AcPhe-tRNA binding to the P-site, but not to the A-site. Similar, but of lower degree, was the effect 5S rRNA labelling by ABA-spermine. In summary, a comprehensive view of the 5S rRNA nucleotide residues involved in spermine binding is gained by the present study. The results further suggest that binding of spermine to 5S rRNA causes conformational changes in certain regions of the molecule. These changes, although not of the extreme amplitude, enabled us to investigate the functional role of 5S rRNA. In light of this role, it seems that PTase center and EF-G binding center are able to coordinate their functions by transmission of allosteric signals through 5S rRNA.

Ο μυξομύκητας Dictyostelium discoideum είναι εξελικτικά κατώτερος ευκαρυωτικός οργανισμός και η RNase P από αυτόν είναι ένα εξαιρετικά ενδιαφέρον ένζυμο, δεδομένου του ότι, το ένζυμο αυτό προσφέρεται για σύγκριση, τόσο με ένζυμα RNase P ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, όσο και με τα καλύτερα χαρακτηρισμένα βακτηριακά ολοένζυμα. Η RNase P του D. discoideum έχει βρεθεί ότι είναι και αυτή ένα ριβονουκλεοπρωτεΐνικό σύμπλοκο, που αποτελείται από μία RNA υπομονάδα και από οχτώ πρωτεϊνικές υπομονάδες. Στην εργασία αυτή έγινε προσπάθεια να κλωνοποιηθεί και να χαρακτηριστεί μια επιπλέον πρωτεΐνική υπομονάδα, η DPop5, πέραν των τεσσάρων που έχουν ήδη κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί από το εργαστήριο του κ. Δραΐνα (DRpp20, DRpp30, DRpp40, DRpp29), έτσι ώστε να δοθεί επιπλέον πληροφορία για την ολοκλήρωση της αρχιτεκτονικής του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση του γονιδίου και υπερέκφραση αυτής μέσω ενός συστήματος έκφρασης, το οποίο βασίζεται στην παραγωγή χιμαιρικών πρωτεϊνών, αποτελούμενων από την πρωτεΐνη-στόχο και τη βακτηριακή συνοδό πρωτεΐνη, HSP70 ή DnaK. Στη συνέχεια, αφού ακολούθησε καθαρισμός της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της και η παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτής. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της καθώς και η μοντελοποίηση αυτής in silico έδειξαν ότι η πρωτεΐνη αυτή είναι αρνητικά φορτισμένη (pI 5.19) και ότι έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με RNA μόρια, μέσω ενός χαρακτηριστικού μοτίβου πρόσδεσης σ’ αυτά. Περαιτέρω πειραματικές διαδικασίες βρίσκονται σε εξέλιξη έτσι ώστε να αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος της στο ολοένζυμο. / Cloning and characterization of DPop5 protein subunit from Dictyostelium discoideum ribonucleoprotein complex RNase P.

Η La πρωτεΐνη περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο ως αυτοαντιγόνο το οποίο αναγνωρίζεται από αντισώματα που είναι παρόντα στον ορό ασθενών που πάσχουν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus) και σύνδρομο Sjögren. Είναι γνωστό σήμερα ότι συμμετέχει ενεργά στη βιογένεση μικρών μορίων RNA, συμπεριλαμβανομένου της ιδιότητάς της να συνδέεται και να προστατεύει την 3’ ακόλουθη αλληλουχία των πρόδρομων tRNA μεταγράφων. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι in vivo διευκολύνει την απομάκρυνση της 5’ οδηγού αλληλουχίας από την RNase P. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε μοριακή κλωνοποίηση της La πρωτεΐνης του D. discoideum (354aa, 40,3-kDa) και υπερέκφρασή της. Η ανασυνδυασμένη La-His6 απομονώθηκε σε δύο στάδια καθαρισμού και εξετάστηκε ως προς την ικανότητα δέσμευσής της σε μόρια tRNA με ανάλυση EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay). Τα αποτελέσματα με τη δοκιμή του ομόλογου pre-tRNASer που φέρει 3’ ακόλουθη αλληλουχία ως προσδέτη σε σχέση με ένα pre- tRNASer στο οποίο απουσιάζει η αντίστοιχη αλληλουχία, έδειξε ότι η La πρωτεΐνη έχει προτίμηση για αυτούσια πρόδρομα tRNA. In silico ανάλυση της πρωτεΐνης, έδειξε ότι περιλαμβάνει μοτίβα χαρακτηριστικά για RNA πρόσδεση με υψηλή συντήρηση στο Ν-τελικό της άκρο. Η προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης La αναστέλλει σε ένα ποσοστό 10% την ωρίμανση του tRNA από την ομόλογη RNase P. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκαν in vitro δοκιμές για τη μελέτη της ικανότητας της La να βοηθά στη σωστή αναδίπλωση και άλλων πρόδρομων μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα ωρίμανσης παρουσία της La και της RNA υπομονάδας της RNase P. Κάτω από ποικίλες συνθήκες δοκιμής η παρουσία της La δεν ευνόησε την ενεργότητα του ριβοενζύμου. Τέλος, φωσφορυλίωση της La πρωτεΐνης σε συγκεκριμένα αμινοξέα δεν έδειξε ενίσχυση της συγγένειας για το υπόστρωμα. Η La του D. discoideum, μπορεί να συνδέεται με αρκετά μεγάλη συγγένεια με το ομόλογό της υπόστρωμα (Kd = 4±1nM, συγκρίσιμη με αντίστοιχες τιμές ομόλογων πρωτεϊνών) χωρίς την απαίτηση του μοτίβου 3’UUU-OH, το οποίο φαίνεται να είναι απαραίτητο για La πρωτεΐνες από άλλους οργανισμούς (H. sapiens, S. pombe, S. cerevisiae, T. brucei). Το γεγονός αυτό εγείρει πολλά ερωτήματα για την εξελικτική προέλευση αυτής της πρωτεΐνης και για την εξακρίβωση του ρόλου της ως αυτοαντιγόνου στα νοσήματα που αναφέρθηκαν. Βιοχημικές και δομικές μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να απαντήσουν σε αυτά τα ερωτήματα. / The La protein was first described in humans as an autoantigen recognized by antibodies present in serum of patients suffering from systemic lupus erythematosus and Sjögren syndrome. It is known that it participates actively in the biogenesis of small RNA molecules, including the binding and protection of the 3' trailer sequence of the precursor tRNA. Furthermore, it has been suggested that it facilitates the RNase P to remove the 5' leader sequence in vivo. In this study, molecular cloning and overexpression of the La protein D. discoideum (354aa, 40,3-kDa) were realized. Recombinant La-His6 was purified in two stages and was assayed regarding its capacity to bind tRNA using EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay). The results testing the homologous pre- tRNASer bearing a 3' trailer sequence as a ligand compared to a pre- tRNASer which lacks the corresponding sequence, showed that the La protein has a preference for intact precursor tRNA. In silico analysis of the protein domain showed that it includes highly conserved motifs characteristic for RNA binding at the N-terminal site. The addition of increasing concentrations of recombinant La protein inhibits the maturation of tRNA by homologous RNase P at a 10% rate. Additionally, in vitro assays were carried out to study the ability of La to assist the proper folding of additional precursor transcripts of RNA polymerase III. Therefore the ability of maturation in presence of La and the RNA subunit of RNase P was assayed. Under various test conditions, the presence of La did not favor any riboenzyme activity. Finally, phosphorylation of La protein in specific amino acids showed no enhancing affinity to the substrate. The La protein from D. discoideum, can bind with quite a high affinity to its homologous substrate (Kd = 4 ± 1nM, comparable to corresponding values of homologous proteins) without the presence of the 3'UUU-OH motif, which appears to be necessary for La proteins from other organisms (H. sapiens, S. pombe, S. cerevisiae, T. brucei). This raises many questions about the evolutionary origin of this protein and the identification of its role as an autoantigen in many autoimmune diseases. Biochemical and structural studies are underway to answer these questions.

Οι COUP-TFs είναι πυρηνικοί μεταγραφικοί παράγοντες, οι οποίοι υπάγονται στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Τα μέλη της οικογένειας COUP-TF γενικά θεωρούνται καταστολείς της μεταγραφής και πολυάριθμοι μηχανισμοί έχουν προταθεί να υποστηρίζουν αυτή τους τη δράση. Με σκοπό να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός καταστολής των μελών της οικογένειας των COUP-TFs, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος yeast two-hybrid για να αναγνωριστούν πρωτεΐνες που εκφράζονται επίσης στον εγκέφαλο και ταυτόχρονα αλληλεπιδρούν άμεσα με μέλη της συγκεκριμένης οικογένειας. Η πρωτεΐνη CTIP1, ένα μέλος της καινούργιας οικογένειας των C2H2 πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου, που απομονώθηκε σαν μία πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά άμεσα με τον ARP1 και πιθανόν να εμπλέκεται στη μεταγραφική καταστολή που διαμεσολαβείται από τον ARP1, η οποία είναι ανεξάρτητη από την ευαίσθητη στην τριχοστατίνη Α αποακετυλίωση των ιστονών. Τόσο η CTIP1 όσο και η CTIP2 εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο μια περιοχή για την οποία είναι γνωστό ότι εκφράζονται τα μέλη της οικογένειας των COUP-TFs, υπονοώντας ότι αυτή η καινούρια οικογένεια των πρωτεϊνών C2H2 δακτύλου ψευδαργύρου πιθανόν να εμπλέκεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι των COUP-TFs. Στο πρώτο μέρος της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής, ο στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης COUP-TF Interactive Protein (CTIP) στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια του αχινού Paracentrotus lividus με τη μέθοδο του ανοσοφθoρισμού και να συγκρίνουμε το πρότυπο αυτό με το πρότυπο έκφρασης του COUP-TF και ταυτόχρονα να ελέγξουμε αν οι δύο αυτοί μεταγραφικοί παράγοντες αλληλεπιδρούν μέσω πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης. Ταυτόχρονα σημαντική ήταν και η προσπάθεια να μελετηθεί και η κατανομή των δύο ισομορφών του COUP-TF στα Μετάζωα. Το γονίδιο του COUP-TF αποτελείται, σε όλους τους μέχρι σήμερα μελετημένους οργανισμούς, από τρία εξώνια και δύο εσώνια που διακόπτουν την κωδική περιοχή του γονιδίου σε συντηρημένες θέσεις. Ωστόσο, έχει βρεθεί ότι ο αχινός Paracentrotus lividus διαφοροποιείται από αυτό το μοντέλο καθώς το γονίδιο αποτελείται από τέσσερα εξώνια (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας). Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι το επιπλέον εξώνιο βρίσκεται μεταξύ του πρώτου και του δεύτερου εξωνίου και έχει μέγεθος 63nt. Στο πρωτογενές μετάγραφο του COUP-TF συμβαίνει εναλλακτικό μάτισμα που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δύο m RNAs που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες, οι οποίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επιπρόσθετων αμινοξέων στην καρβόξυτελική περιοχή (CTE) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Αν και πολλά δεν είναι γνωστά σχετικά με την ενδοκυτταρική τοποθέτηση κυρίως της μεγάλης ισομορφής, πειράματα EMSA ωστόσο εδειξαν οι δύο αυτές πρωτεΐνες διαφέρουν ως προς την ικανότητα πρόσδεσής τους στο DNA, με τη μεγάλη υπομονάδα του COUP να στερείται της ικανότητας να προσδένεται σε COUP στοιχείο απόκρισης. Σε μια προσπάθεια να μελετηθεί διεξοδικότερα το φαινόμενο του εναλλακτικού ματίσματος και συγκεκριμένα να διαπιστωθεί αν πρόκειται για ένα φαινόμενο συντηρημένο στα εχινοειδή, αποκλειστικό ή όχι αυτών, το συμπέρασμα που προέκυψε είναι ότι το εναλλακτικό μάτισμα είναι συντηρημένο και εμφανίζεται σταθερά στα είδη των αχινών που μελετήθηκαν (Paracentrotus lividus, Spaerechinus granularis, Strongylocentrotus purpuratus). Το εναλλακτικό μάτισμα λαμβάνει χώρα σε όλα τα στάδια από τα αγονιμοποίητα ωάρια εως τον πλουτέα και σε όλους τους ιστούς που o COUP-TF εκφράζεται (κοιλωματικά κύτταρα, μύες, έντερο). Για να μελετήσουμε την εξάπλωση του εναλλακτικού ματίσματος στα Μετάζωα, επιλέχθηκαν αντιπρόσωποι απ΄ όλες τις ομοταξίες του φύλου των Εχινόδερμων (Strongylocentrotus purpuratus, Amphiura filiformis, Patiria miniata, Marthasteria glacialis, Holothuria polii, Oxycomanthus japonicas), του φύλου των Ημιχορδωτών (Sakoglossus kowalevski), του φύλου των Χαιτόγναθων (Sagita minima), του υπόφυλου των Ουροχορδωτών (Ciona intestinalis) και του φύλου Xenoturbella (Xenoturbella bocki) για την απομόνωση ολικού RNA από καθέναν από αυτούς τους οργανισμούς. Αυτό το υλικό αποτέλεσε το υπόστρωμα για την πραγματοποίηση μιας σειράς πειραμάτων RT-PCR και Nested PCR με τη χρήση ειδικά σχεδιασμένων εκκινητών (degenerate primers). Η κλωνοποίηση των προιόντων σε κατάλληλο φορέα συνέβαλλε στην αλληλούχηση των κατάλληλων κλώνων. Παράλληλα, με το πρόγραμμα BLAST ψάξαμε για ομολογία της μικρής ισομορφής της πρωτεΐνης του COUP-TF του Paracentrotus lividus με άλλες πρωτεΐνες άλλων οργανισμών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν τόσο μέσα από τη νουκλεοτιδική αλληλούχηση όσο και μέσω της ηλεκτρονικής διερεύνησης συνηγορούσαν υπέρ της παρουσίας του εναλλακτικού ματίσματος ως ενός φαινομένου καθολικού που αφορά ευρύτερες (αν όχι όλες) ομάδες των Μεταζώων. / --

Bacterial elongation factor P (EF-P) is a poorly understood soluble protein that has been shown to enhance the first step of peptide bond formation through an interaction with the ribosome and initiator tRNA. The crystal structure of EF‐P shows that EF‐P mimics the tRNA shape. Orthologous proteins have been found in both archaeal and eukaryotic systems, known as aIF5A and eIF5A, respectively. eIF5A, which was recently shown to increase translation elongation rates, is post-translationally modified at a highly conserved lysine residue (K50) through the addition of the rare amino acid hypusine. A similar pathway was recently elucidated for EF-P, in which EF-P is post-translationally modified by the enzymes YjeA and YjeK at lysine 34, corresponding to a homologous site of hypusylation in a/eIF5A. As a paralog of class II LysRS, YjeA catalyzes the addition of lysine onto EF-P, but is incapable of modifying tRNA. YjeK is a 2,3-(β)-lysine aminomutase and is responsible for converting lysine to β-lysine, which YjeA was recently shown to recognize as a preferred substrate for EF-P modification. However, fully modified EF-P requires a third enzyme, YfcM, which acts as a hydroxylase and hydroxylates the C4 or C5 position of K34 of EF-P, but not the added β-lysine. Based on a complete description of the EF-P modification and pathway, in this project we focused on further studies to address the mechanism of action of EF-P and especially to investigate how the different stages of EF-P’s modifications can affect E. coli cells. Using E. coli Keio knockout collection (Δefp, ΔyjeK, ΔyjeA, ΔyfcM) and E. coli Keio parental strain (wild-type) as reference, we checked the effect of the deletion strains on the cells under different environmental stress conditions (varying growth temperatures and nutrition conditions, susceptibility to antibiotics), showing that Δefp strain has growth defects and that E. coli efp mutants show sensitivity to non-ribosomal inhibitors, such as ampicillin and rifampicin, suggesting a possible secondary role of EF-P related to the cell envelope. Moreover, we tested the ability of deletion strains to restore viability in the presence of the appropriate plasmid and showed that EF-P is important for cell viability under certain conditions in E. coli. As reported previously, YjeA and YjeK are important in bacteria virulence. In addition, EF‐P is recognized as one of the proteins important for bacteria motility in Bacillus subtilis. However, motility and virulence are often linked together. Here, we tested deletion strains for their ability to produce flagella. Further, using external fluorescence staining and confocal microscopy we revealed differences in morphology of the E. coli deletion strains, and we performed Histidine tag protein purification with Ni-NTA agarose beads and gel filtration, in order to purify YfcM, an uncharacterized protein, and set initial screens for crystallization. Finally, our future goal is to clone the following polycistronic construct, “- yjeK - yjeA - yfcM - his-efp -“, overexpress and crystallize it, so as to see the crystal structure of the whole modification pathway of EF-P and study better the function of EF-P in translation extracts from different mutants / Ο βακτηριακός παράγοντας επιμήκυνσης EF-P, είναι μια διαλυτή πρωτεΐνη που βοηθά στο σχηματισμό του πρώτου πεπτιδικού δεσμού, αλληλεπιδρώντας με το ριβόσωμα και το εναρκτήριο tRNA. Η κρυσταλλική δομή του EF-P δείχνει ότι μιμείται στη μορφή το tRNA. Ορθόλογες πρωτεΐνες έχουν βρεθεί και στα αρχαία και τα ευκαρυωτικά κύτταρα, γνωστές ως aIF5A και eIF5A, αντίστοιχα. Ο eIF5A, για τον οποίο αποδείχθηκε πρόσφατα ότι συμμετέχει και στο στάδιο της επιμήκυνσης της μετάφρασης, υφίσταται μια μοναδική μετα-μεταφραστική τροποποίηση στη λυσίνη 50 (Κ50), μέσω της προσθήκης σε αυτή ενός σπάνιου αμινοξέος, της υπουσίνης (hypusine). Μια παρόμοια τροποποίηση αποδείχθηκε ότι υφίσταται ωστόσο και ο EF-P της Escherichia coli (E. coli), ο οποίος τροποποιείται μετα-μεταφραστικά στη λυσίνη 34 (Κ34) με τη βοήθεια των ενζύμων YjeA και YjeK. Το YjeA αποτελεί παράλογο της δεύτερης κλάσης των tRNA συνθετασών της λυσίνης (LysRSs: Lysyl-tRNA synthetases), και καταλύει την προσθήκη της λυσίνης επάνω στον EF-P. Το YjeK είναι μια 2,3 αμινομουτάση της λυσινης (LAM: Lysine-2-3-aminomutase) και είναι αρμόδια για τη μετατροπή της α-λυσίνης σε β-λυσίνη. Εντούτοις, πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι ο πλήρως τροποποιημένος EF-P απαιτεί ένα επιπλέον ένζυμο, το YfcM, το οποίο ενεργεί ως υδροξυλάση και υδροξυλιώνει τον C4 ή C5 άνθρακα της K34 του EF-P. Στη συγκεκριμένη μελέτη εστιάσαμε στην εξέταση του μηχανισμού δράσης του EF-P και ειδικότερα στις επιπτώσεις που μπορεί να έχουν τα διαφορετικά στάδια των τροποποιήσεών του σε κύτταρα E. coli. Χρησιμοποιώντας τα knockout E. coli στελέχη της Keio (Δefp, ΔyjeK, ΔyjeA, ΔyfcM), ελέγξαμε την επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών συνθηκών στα στελέχη (διαφορετικές θερμοκρασίες, συνθήκες διατροφής, ευαισθησία σε αντιβιοτικά), δείχνοντας ότι το Δefp στέλεχος έχει μειωμένη αύξηση και ότι τα μεταλλαγμένα στελέχη παρουσιάζουν ευαισθησία σε μη-ριβοσωματικούς αναστολείς, όπως για παράδειγμα την αμπικιλίνη και τη ριφαμπικίνη. Επιπλέον, εξετάσαμε τη δυνατότητα των μεταλλαγμένων στελεχών να ανακάμπτουν στην ανάπτυξή τους παρουσία του κατάλληλου πλασμιδίου και είδαμε ότι ο EFP είναι σημαντικός για την in vivo ανάπτυξη της E. coli σε στρεσσογόνες καταστάσεις. Όπως αναφέρθηκε πρόσφατα, οι YjeA, YjeK και EF-P πρωτεΐνες συμβάλουν στη μείωσης της τοξικότητας στη Salmonella. Επιπλέον, έχει δειχθεί πως ο EF-P είναι μια από τις πρωτεΐνες, που παίζουν σημαντικό ρόλο στην κινητικότητα των βακτηρίων στο Bacillus subtilis. Ωστόσο, έρευνα των Josenhans και Suerbaum το 2002, έδειξε πως η κινιτηκότητα και η τοξικότητα συχνά συνδέονται μεταξύ τους. Έτσι εξετάσαμε, τα μεταλλαγμένα στελέχη για την ικανότητά τους να κινούνται, δημιουργώντας μαστίγια, σε semi-solid θρεπτικό υλικό. Περαιτέρω έρευνες χρησιμοποιώντας external fluorescence staining και confocal microscopy, αποκαλύψε διαφορές στη μορφολογία των μεταλλαγμένων στελεχών της E. coli. Επίσης, με στόχο τη μελέτη της πρωτεΐνης YfcM, η λειτουργία της οποίας δεν είναι ακόμη γνωστή, απομονώσαμε και καθαρίσαμε την YfcM, με Νi-NTA agarose beads και gel filtration για τη μελλοντική κρυσταλοποίησή της,. Τέλος, μελλοντικός στόχος μας είναι η κλωνοποίηση του ακόλουθου πολυκιστρονικού γονιδίου “- yjeK - yjeA - yfcM - Ηis-efp - “, με σκοπό την υπερέκφραση και την κρυσταλλοποίησή του, ώστε να λάβουμε μια εικόνα του πως μοιάζει ολοκληρωμένο το μονοπάτι της τροποποίησης του EF-P, και επιπλέον, να μελετήσουμε καλύτερα τη λειτουργία του EF-P σε εκχυλίσματα της μετάφρασης από διαφορετικές μεταλλάξεις..

Ο α2 –αδρενεργικός υποδοχέας διακρίνεται σε 3 γνωστούς υποτύπους (α2Α, α2Β, α2C) και μετά αλληλεπίδραση με G-πρωτεΐνες (GPCRs), διαμεσολαβεί μέρος των δράσεων των ορμονών- νευρομεταβιβαστών, επινεφρίνη και νορεπινεφρίνη σε πολλά όργανα, συμπεριλαμβανομένου και του νευρικού συστήματος. Πρότυπο μελέτης του νευρικού συστήματος in vitro, αποτελεί η κυτταρική σειρά PC12, που περιλαμβάνει κύτταρα από φαιοχρωμοκύττωμα αρουραίου, τα οποία υπό την επίδραση του Nerve Growth Factor (NGF) διαφοροποιούνται σε συμπαθητικούς νευρώνες. Μετά από διαμόλυνση, αυτά τα κύτταρα εκφράζουν τους υποτύπους των α2-αδρενεργικών υποδοχέων και βάσει δεδομένων από προηγούμενη εμπειρία του εργαστηρίου μας, μπορούν μετά από ενεργοποίηση με επινεφρίνη να οδηγήσουν στην ενεργοποίηση ενός καταρράκτη μεταγωγής σήματος, που περιλαμβάνει τις κινάσες Akt και ERK1/2. Δεδομένου ότι τα μόρια αυτά συμβάλλουν στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα CREB (cAMP response element binding protein) θελήσαμε στην παρούσα εργασία να διερευνήσουμε κατά πόσο η ενεργοποίηση των α2-αδρενεργικών υποδοχέων προκαλεί την CREB φωσφορυλίωση. Βάσει προηγούμενων αποτελεσμάτων, που αποδείκνυαν την απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος και διαφόρων μεταβολιτών του μετά από ενεργοποίηση των α2 –αδρενεργικών υποτύπων, μελετήσαμε εάν αυτή η απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος, μπορούσε να προκαλέσει ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης του CREB και μέσω ποιών μεταβολικών μονοπατιών μπορεί αυτό να πραγματοποιηθεί. Επιπλέον μελετήσαμε εάν αυτή η ενεργοποίηση του CREB ήταν παρούσα και στους 3 υποτύπους και εάν παρουσίαζε υποτυποειδικότητα. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνική Western Blotting , σε εκχυλίσματα PC12 κυττάρων, κατάλληλα επεξεργασμένων με επινεφρίνη, παρουσία διαφόρων αναστολέων των μεταβολικών μονοπατιών του αραχιδονικού οξέος. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επινεφρίνη επάγει τη φωσφορυλίωση του CREB και στους 3 υποτύπους των α2-αδρενεργικών υποδοχέων σε PC12 κύτταρα. Επίσης η απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος και η επακόλουθη φωσφορυλίωση του CREB διαμεσολαβείται από την PLC (φωσφολιπάση C) και την εποξυγενάση του κυτοχρώματος P450, αφού έχουμε αναστολή από τους ειδικούς αναστολείς U73122 και κετοκοναζόλη αντίστοιχα. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης ήταν ίδια στους α2A- και α2C-υποτύπους και σημαντικά μεγαλύτερα από τον α2Β-υπότυπο, αποδεικνύοντας ότι παρουσιάζεται σημαντική υποτυποειδικότητα. / α2-adrenergic receptor is divided into 3 known subtypes (α2A, α2Β, α2C) and after interaction with G-proteins (GPCRs) mediates part of actions of hormones-neurotransmitters, epinephrine and nor epinephrine in many organs, including Central Nervous System. Cell line PC12, which origins from cells of rats’ pheochromocytoma , consist a study model of nervous system in vitro and under the influence of Nerve Growth Factor (NGF) is differentiated into sympathetic neurons. After transfection, these cells express the subtypes of α2-adrenergic receptors and based on data from previous experience, after activation with epinephrine, they activate a cascade of signal transduction , which includes kinases Akt and ERK1/2. Based on the fact that these molecules contribute to the activation of transcription factor CREB (cAMP response element binding protein) we study whether the activation of α2-adrenergic receptors can cause direct CREB phosphorylation. Based on previous results, which prove release of arachidonic acid and its metabolites after activation of α2-adrenergic subtypes, we study if the release of arachidonic acid could cause activation, through phosphorylation, of CREB and via which metabolic pathways this happens. Furthermore, we studied if the activation was present in all 3 subtypes and if it presented sub-specificity. We performed the Western Blotting technique in PC12 cells properly pro-incubated with epinephrine and addition of enzymic inhibitors of arachidonic acid metabolism. Our results figure that epinephrine induce CREB phosphorylation in all 3 subtypes of α2-adrenergic receptors in PC12 cells. The release of arachidonic acid and the following phosphorylation of CREB is mediated from phospholipase C (PLC) and cytochrome P450-dependent epoxygenase, as proved by inhibition with the specific inhibitors U73122 and ketokonazole, respectively. The levels of CREB phosphorylation were comparable between α2Α - and α2C- subtypes and higher than the α2Β- subtype, proving that this is an action which presents sub-specificity.

L’ARN génomique du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est multifonctionnel et suit au moins deux destins. Soit il est traduit par la machinerie traductionnelle de l’hôte donnant naissance aux polyprotéines Gag et Gag-pol, soit il se dimérise et est encapsidé dans les virions en tant que génome viral. Les travaux du laboratoire visent à identifier les mécanismes moléculaires de la traduction de l’ARN génomique et de sa dimérisation, ainsi que les déterminants gouvernant la balance entre ces deux phénomènes. La traduction de l’ARN génomique viral peut être initiée de trois façons. Selon le mécanisme canonique nécessitant la présence d’une coiffe à l’extrémité 5’ de l’ARN, et grâce à deux sites d’initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Un IRES a été mis en évidence dans la 5’ UTR, dont l’activité est stimulée lors en phase G2/M du cycle cellulaire uniquement. Un second IRES a été découvert dans la région codante de gag. Il est capable de lier directement la petite sous-unité ribosome et le facteur d’initiation eIF3, et permet l’initiation à partir de deux codons AUG situés dans la même phase de lecture, conduisant à la synthèse d’une isoforme additionnelle de Gag. Mon projet de thèse a consisté en l’étude de l’influence de la structure secondaire sur la traduction et la dimérisation. Dans un premier temps, j’ai mis en place au laboratoire une nouvelle technique de sondage de structure, appelée « SHAPE », développée par le laboratoire de K. Weeks. Le SHAPE nous permet désormais de sonder rapidement la structure secondaire de nombreux ARN, et notamment de tester en routine l’effet de mutations sur la structure secondaire. Cette technique a permis d’étudier la structure secondaire de la 5’ UTR dans différentes conditions. Nous avons ainsi identifié une signature de la conformation monomère de la 5 UTR, et découvert un nouvel élément impliqué dans la dimérisation in vitro. Par ailleurs, nous avons montré que des extraits de cellules Hela synchronisées en phase G2/M du cycle cellulaire stimulent l’activité de l’IRES de la 5’ UTR et modifient le profil de réactivité de cette région, traduisant probablement une réorganisation structurale induite par le recrutement de protéines cellulaires. Une autre partie de mon projet de thèse a concerné l’étude de l’IRES de la région codante de gag, Des délétions progressives de l’IRES, à partir des extrémités 5’ et 3’ ont mis en évidence l’existence de deux sites de liaison distincts au ribosome, localisés à proximité de chacun des deux codons d’initiation. La délétion de chaque site a permis de confirmer le rôle de la liaison directe au ribosome dans la traduction de gag. L’ensemble de ces éléments nous permet de proposer un modèle moléculaire conduisant à la formation des complexes d’initiation sur chaque codon AUG. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu’une interaction longue-distance entre la boucle PolyA et la région codante de gag régule de la traduction de l’ARN génomique. Un tel mécanisme pourrait permettre de réguler l’efficacité de traduction du gène gag, voire du ratio entre les deux isoformes au cours du cycle réplicatif. / Primate lentiviruses genomic RNA can serve both as an mRNA that encodes for Gag and Gag-Pol polyproteins and as a propagated genome. We previously reported the presence of an IRES activity embedded within Gag coding region itself that drives the production of several isoforms of the Gag polyprotein and that is conserved in HIV-1, HIV-2 and SIVmac. In addition, in vitro reconstitution experiments revealed that the initial step of initiation complex formation is the recruitment of the 40S ribosomal subunit and eIF3. The structural and functional conservation amongst lentiviruses indicates that those properties are important for the virus cycle. In order to define the RNA structural determinants responsible for the formation of IRES/eIF3/40S ternary complex, we have been following functional and biochemical approaches in parallel. Our results indicate that 2 distinct binding sites for the ribosome are present close to the 2 AUG codons used as initiation site for the translation. Further biochemical analyses have shown that 2 ribosomes can be recruited by the same RNA molecule. In order to determine the functional role of the IRES activity on gag translation, we assayed in vitro the translation efficiency of mutants unable to recruit the ribosome. In parallel, we have been following a drug screening strategy to identify small molecules that would inhibit the ribosome recruitment. This approach could pave the way to the definition of the IRESgag as a new therapeutic target, and to the identification of new drugs.

Το ριβόσωμα παρέχει την πλατφόρμα πάνω στη οποία το mRNA αναγνωρίζεται και αποκωδικοποιείται από τα μεταφορικά RNAs. Δρα καταλυτικά ως ριβοένζυμο και συνθέτει την αντίστοιχη αλληλουχία αμινοξέων. Σημαντικά λειτουργικό κομμάτι του ριβοσώματος αποτελεί το τούνελ εξόδου, το οποίο βρίσκεται στη μεγάλη υπομονάδα του ριβοσώματος και αποτελεί το κανάλι, μέσω του οποίου οι νεοσυντιθέμενες πεπτιδικές αλυσίδες εξέρχονται στο κυτταροδιάλυμα. Νεότερες ερμηνείες προσδίδουν στο τούνελ εξόδου έναν πιο ενεργό ρόλο, καταδεικνύοντας τη σπουδαιότητά του όχι μόνο ως διάδρομος εξόδου της πεπτιδικής αλυσίδας, αλλά και ως λειτουργική περιοχή του ριβοσώματος με σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Το δίκτυο επικοινωνίας μεταξύ τούνελ και πεπτιδυλοτρανσφεράσης δεν έχει ακόμα χαρτογραφηθεί και μελετηθεί πλήρως, υπάρχουν όμως μέχρι στιγμής πολυπληθείς αναφορές που επιβεβαιώνουν ότι μέρος του αποτελούν κυρίως βάσεις του 23S rRNA, συστατικά του τοιχώματος της εισόδου στο τούνελ, και βάσεις ευρισκόμενες στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, συντηρημένες εξελεικτικά, γνωστές από την αλληλεπιδρασή τους με αναστολείς της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και κυρίως με αναστολείς της οικογένειας των μακρολιδίων. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε την αλληλεπίδραση των χαρακτηριστικών αυτών βάσεων που συγκροτούν το δίκτυο επικοινωνίας μεταξύ του τούνελ εξόδου και της πεπτιδυλοτρανσφεράσης με τη βοήθεια νέων μακρολιδίων τρίτης γενιάς, των κετολιδίων, που φέρουν επί πλέον και άτομα φθορίου, παρέχοντας έτσι στο μόριο μεγαλύτερη συγγένεια για φορτισμένες ομάδες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, αποτελούν εξαιρετικά υποσχόμενους αντιμικροβιακούς θεραπευτικούς παράγοντες, και αναστέλλουν ισχυρά την μετάφραση. Παράλληλα καταλαμβάνουν αμοιβαία αποκλειόμενες θέσεις στο ριβόσωμα, στην είσοδο του τούνελ, αλληλεπιδρώντας με τις βάσεις Α2058, Α2059, Α2062 και Α752. Επειδή όλες οι παραπάνω βάσεις αποτελούν μέρος του δικτύου επικοινωνίας τούνελ-πεπτιδυλοτρανσφεράσης, θα μπορούσαμε να συμπληρώσουμε τον ήδη υπάρχοντα μηχανισμό δράσης των μακρολιδίων (drop-off, λόγω αύξησης της koff) με την επικοινωνία του τούνελ με την πεπτιδυλοτρανσφεράση, ώστε να απενεργοποιηθεί η τελευταία με τελική κατάληξη τη διακοπή της πρωτεϊνικής σύνθεσης και την επαγωγή του drop-off. Για την περαιτέρω μελέτη της αλληλεπίδρασης του τούνελ με την νεοσυντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα, σχεδιάσθηκαν νέα πεπτιδυλο παράγωγα της χλωραμφανικόλης, τα οποία προσομοιάζουν πεπτιδυλο-tRNAs προσδεδεμένα στην Α-θέση του ριβοσώματος, με την ολιγοπεπτιδική αλληλουχία να εκτείνεται βαθύτερα στο τούνελ, υιοθετώντας μία ανοικτή διαμόρφωση. Όπως διαπιστώσαμε με συναγωνιστικές μελέτες με ραδιενεργό ερυθρομυκίνη, τα συγκεκριμένα ανάλογα καταλαμβάνουν την Α-θέση στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, ενώ η συγγένεια του κάθε αναλόγου ως αναστολέα της λειτουργίας του ριβοσώματος, είναι απόλυτα ιδιοσυγκρατική, καθώς εξαρτάται από την αλληλουχία των αμινοξέων που συγκροτούν το πεπτίδιο. Μελετώντας το αποτύπωμα των ενώσεων αυτών στο ριβόσωμα, διαπιστώσαμε ότι ενώ η βάση της χλωραμφαινικόλης διατηρεί τη θέση της στη περιοχή Α, το πεπτίδιο εισέρχεται βαθειά στην είσοδο του τούνελ, αλληλεπιδρώντας με την βάση Α752. Συνεπώς τα πεπτιδυλο ανάλογα της χλωραμφαινικόλης, τα οποία συμπεριφέρονται ως ισχυροί αναστολείς της μετάφρασης, αποτελούν κατάλληλα εργαλεία μελέτης της αλληλεπίδρασης μεταξύ της νεοσυντιθέμενης πεπτιδικής αλληλουχίας και στοιχείων του τούνελ εξόδου του ριβοσώματος. / Ribosomes translate the genetic code into proteins in all living cells with extremely high efficiency, owing to their inherent flexibility and to their spectacular architecture. These large ribonucleoprotein particles synthesize proteins in all cells, using messenger RNA as the template, confirming that the ribosome is indeed a ribozyme, and aminoacyl-transfer RNAs as substrates. As the nascent polypeptide chain is being synthesized, it passes through a tunnel within the large ribosomal subunit and emerges at the solvent side where protein folding occurs. New studies indicate that in some cases, the tunnel plays a more active role. Accumulated evidence had definitely concluded that ribosomal tunnel is not only a passive conduit for the nascent chains but a rather functionally important compartment, where specific peptide sequences establish direct interactions with the tunnel, talking back to the ribosome in order to regulate peptide synthesis, leading to translational stalling. In this study, we have investigated functional interactions between distinct locations of the ribosomal tunnel and specific residues of the peptidyltransferase, using new macrolides, known as ketolides, which carry also fluorine attached to the lactone ring either directly or indirectly. According to our results, the new antibiotics exhibited better antimicrobial activity, inhibiting strongly the translational apparatus and could be useful tools in the future for treatment of bacterial infections. Binding studies with radiolabeled erythromycin revealed that these drugs bound competitively with erythromycin at the large ribosomal subunit, with extremely low dissociation constants. In parallel, RNA footprinting indicated that the new ketolides occupy the main macrolide binding site in the ribosome, which is located at the entrance of the exit tunnel adjacent to the peptidyltransferase center. These drugs interact with A2058, A2059 and A2062, as well as their extended heteroaromatic alkyl-aryl side chain penetrates deeper in the tunnel protecting A752 of Helix 35, interacting with basepair A752-U2609. To explore further this interaction, we have synthesized new peptidyl conjugates of chloramphenicol, which resemble nascent peptidyl-tRNA chains bound to the A-site of the ribosome, with their peptide sequence located deeper within tunnel, adopting an extended configuration. According to our data, these compounds did indeed bind to the peptidyl transferase center, competing with radiolabelled- chloramphenicol for binding to the ribosome. The binding of each analog, as well as its inhibitory activity of ribosomal function, is absolutely idiosyncratic, depending on the sequence of amino acid of peptide moiety. Studying the footprinting pattern of these compounds on the ribosome, we confirmed that while the chloramphenicol base maintains its position on the A-site, the peptide moiety penetrates deeper in the entrance of the exit tunnel, interacting with nucleotide A752. Therefore, we believe that these chloramphenicol peptides could be useful tools for probing nascent polypeptide chain interaction with the ribosome.

Cette thèse a pour objectif la caractérisation des gènes rgg de S. thermophilus LMG18311 codant des régulateurs transcriptionnels et l'étude de leur implication dans l'adaptation à l'environnement. Ce travail montre que le gène rgg0182 code un régulateur transcriptionnel activant la transcription de ses gènes adjacents. Par ailleurs, le couple Rgg0182/Shp0182 participerait à un mécanisme de quorum sensing. De plus, la protéine Rgg0182 participe à la tolérance au stress chaud. En outre, les cellules du mutant [delta]rgg0182 présentent un phénotype d'adhésion thermo-induite via des interactions de types hydrophobes. L'analyse par microscopie à force atomique des cellules de la souche LMG18311 et du mutant [delta]rgg0182 révèle la présence de polymères de surface uniquement chez la souche sauvage, suggérant que la protéine Rgg0182 régulerait l'expression de protéines de surface et de la division cellulaire. Une étude protéomique couplée à une analyse transcriptomique ont permis d'identifier plusieurs cibles de Rgg0182 qui participeraient à diverses fonctions biologiques. L'ensemble des données obtenues démontre que la protéine Rgg0182 de S. thermophilus LMG18311 est un régulateur global de l'expression génique. Par ailleurs, la transcription des 7 gènes rgg présents au sein du génome de S. thermophilus LMG18311 est modulée par les conditions environnementales. Les profils de transcription des 7 gènes rgg diffèrent les uns par rapport aux autres, suggérant que chacun d'eux seraient requis dans des conditions de croissances différentes. Ces données posent l'hypothèse que les protéines Rgg participeraient à la régulation fine et complexe de l'expression génique de S. thermophilus / This thesis aims to characterize the rgg genes of S. thermophilus LMG18311 coding transcriptional regulator and their involvement in environmental adaptation. This work shows that rgg0182 gene encodes a transcriptional regulator controlling the transcription of its flanking genes. The Rgg0182/Shp0182 pair could be involved in a quorum sensing mechanism. This work also demonstrates that the Rgg0182 protein is involved in S. thermophilus tolerance to heat stresses. In addition, the mutant delta rgg0182 cells exhibit a thermo-induced adhesion phenotype via hydrophobic interactions. Analyses by atomic force microscopy of LMG18311 cells of the wildtype and its derivative rgg0182 mutant reveal the presence of polymers only on the surface of the wild-type strain, suggesting that the protein Rgg0182 would regulate the expression of surface proteins and proteins of cell division. A proteomic study coupled with transcriptomic analysis led to the identification of several targets of Rgg0182 involving in various biological functions. The data obtained in this work have shown that the S. thermophilus LMG18311 rgg0182 genes encodes a global regulator of gene expression. Furthermore, transcriptional analyses, in different growth conditions, of the 7 rgg genes present in the genome of S. thermophilus LMG18311 showed that they display different expression profiles that are modulated by environmental conditions. This suggests that these genes would be required in distinct growth conditions. These data raise the hypothesis that Rgg proteins participate in the fine and complex regulation of S. thermophilus gene expression