Τα τελευταία χρόνια, πολλά εργαστήρια έχουν επικεντρώσει το ενδιαφέρον τους στο 5S rRNA, το μικρότερο RNA συστατικό του ριβοσώματος. Ο ακριβής ρόλος του 5S rRNA στο ριβόσωμα, την πρωτεϊνική βιοσυνθετική μηχανή, δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Αποτελέσματα δομικών μελετών τοποθετούν το 5S rRNA στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Ευρήματα που αφορούν σχέσεις δομής και λειτουργίας οδηγούν στην υπόθεση, ότι σταθεροποιεί τη δομή του ριβοσώματος και λειτουργεί ως φυσικός μεταδότης πληροφοριών μεταξύ λειτουργικών κέντρων. Από την άλλη πλευρά, το ιοντικό περιβάλλον επηρεάζει άμεσα τη ριβοσωματική λειτουργία. Μονοσθενή και δισθενή κατιόντα, καθώς και πολυκατιόντα, όπως οι πολυαμίνες, παρεμβαίνουν στη ριβοσωματική διαμόρφωση και συνεπώς εμπλέκονται άμεσα στη λειτουργία του ριβοσώματος. Προκαρτατικές μελέτες στο εργαστήριό μας έχουν δείξει ότι οι πολυαμίνες, και συγκεκριμένα η σπερμίνη, σταθεροποιούν την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του 5S rRNA, οδηγώντας σε μια πιο συνεκτική διαμόρφωση του μορίου. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της διαμόρφωσης του 5S rRNA στην πρωτεϊνική σύνθεση του εντεροβακτηρίου E.coli. Παράλληλος στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης των πολυαμινών στη δομή και λειτουργία τόσο του 5S rRNA, όσο και ολοκλήρου του ριβοσωματικού συμπλόκου. Η πρόσδεση των πολυαμινών στο 5S rRNA μελετήθηκε με τη μέθοδο της φωτοσήμανσης συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως μοριακό ανιχνευτή ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την ΑΒΑ-σπερμίνη. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της πρόσδεσης και προσδιορίστηκαν οι θέσεις δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA, είτε αυτό ήταν ελεύθερο, είτε ενσωματωμένο σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες ή 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα από E.coli. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι σε ελεύθερο 5S rRNA, η σπερμίνη προσδένεται κυρίως σε νουκλεοτίδια των ελίκων III και V και στις θηλιές Α, C, D και E. Ενσωμάτωση του 5S rRNA σε 50S υπομονάδες ή 70S poly(U)-προγραμματισμένα ριβοσώματα, είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της επιδεκτικότητας των νουκλεοτιδίων του στην ΑΒΑ-σπερμίνη. Ακολούθησε διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης του φωτοαναλόγου στη δομή του 5S rRNA. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα χημικής τροποποίησης, τα οποία αποκάλυψαν ότι ανεξάρτητα από το αν το 5S rRNA είναι ελεύθερο ή συναρμολογημένο σε 50S υπομονάδες ή σε 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα, η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνης προκαλεί σημαντικές αλλαγές στη διαμόρφωση του μορίου. Η θηλιά Α υιοθετεί μια πιο χαλαρή δομή, ενώ οι θηλιές C, D και E και η έλικα III μια πιο συνεκτική δομή. Με την διαπίστωση των αλλαγών της διαμόρφωσης του 5S rRNA λόγω της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης, κρίθηκε ενδιαφέρον να μελετηθεί αν αυτές οι διαμορφωτικές αλλαγές επηρεάζουν θεμελιώδεις λειτουργίες του ριβοσώματος. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα του να συναρμολογείται σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνη στο 5S rRNA, δεν καταργεί την διαδικασία συναρμολόγησης των 50S υπομονάδων, παρεμποδίζει όμως τις απαιτούμενες δομικές αλλαγές με το να σταθεροποιεί μια πιο συνεκτική δομή του 5S rRNA, θερμοδυναμικά λιγότερο ευνοϊκή για την πορεία. Παρά το γεγονός ότι η πρόσδεση της σπερμίνης στο 5S rRNA επιφέρει στο μόριο δομικές αλλαγές που εμποδίζουν την συναρμολόγηση του σε 50S υπομονάδες, όταν αυτές σχηματιστούν, αποκτούν δομή τέτοια που επιτρέπει την αλληλεπίδρασή τους με τις 30S υπομονάδες. Ωστόσο, η παρουσία του 5S rRNA φαίνεται να είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό ενεργών 50S υπομονάδων, αφού η απουσία του 5S rRNA δεν επιτρέπει ούτε το σχηματισμό ακέραιων υπομονάδων, ούτε την σύζευξη των υπομονάδων προς ακέραια ριβοσωματικά σύμπλοκα. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rRNA, αρχικά στην ικανότητα των ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα και στη συνέχεια, στην καταλυτική δράση αυτών. Φωτοσήμανση του 5S rRNA με ΑΒΑ-σπερμίνη προκάλεσε μικρή, αλλά σαφή ενεργοποίηση της πρόσδεσης υποστρώματος στην Ρ-θέση, σε αντίθεση με την πρόσδεση στην Α-θέση, η οποία δε φαίνεται να επηρεάζεται. Σαφής ήταν, επίσης, η επίδραση στην ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης: Παρατηρήθηκε αύξηση μέχρι και 30% στη δραστικότητα της ΡΤασης. Ιδιαίτερης σημασίας είναι το εύρημα, ότι ριβοσώματα ελλιπή σε 5S διατηρούν ~10% της δράσης της ΡΤασης, γεγονός που οδηγεί στη υπόθεση ότι το 5S rRNA δεν είναι απολύτως απαραίτητο για τη κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού. Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην μετατόπιση υποστρωμάτων, αρχικά στην αυθόρμητη (μη ενζυμική) και στη συνέχεια στην EF-G-καταλυόμενη μετατόπιση. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την υπόθεση, ότι η μετατόπιση υποστρωμάτων είναι έμφυτη ιδιότητα του ριβοσώματος. Παράλληλα, κατέδειξαν ότι η πρόσδεση σπερμίνης στο 5S rRNA διεγείρει την μη ενζυμική μετατόπιση, πιθανόν μέσω αλλαγών στην αναδίπλωση του rRNA, οι οποίες μεταδίδονται στα ριβοσωματικά κέντρα που είναι υπεύθυνα για αυτή τη λειτουργία. Περαιτέρω, η παρουσία σπερμίνης στο 5S rRNA, μείωσε τις απαιτήσεις για EF-G. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγηθεί είτε με μια πιθανή ευεργετική δράση της σπερμίνης στην δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, είτε με την επίδρασή της στο στάδιο της υδρόλυσης του GTP. Για να διευκρινίσουμε ποια από τις δυο εκδοχές ευσταθεί, μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G και στη συνέχεια στην ικανότητα τους να ενεργοποιούν την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση. Βρέθηκε ότι, η παρουσία σπερμίνης στο μόριο του 5S rRNA, ευνοεί τη δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα. ¨Όσο αφορά την ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης δεν επηρεάζεται από την παρουσία σπερμίνης, αποτέλεσμα που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rRNA δεν επηρεάζει την GTP υδρόλυση. Απουσία του 5S rRNA, τα ριβοσώματα διατηρούν κάποια δραστικότητα GTPασης, αλλά δεν είναι ικανά να δεσμεύουν αποτελεσματικά τον EF-G, ακόμη και παρουσία σπερμίνης. Λαμβάνοντας υπόψη, ότι η θέση δέσμευσης του EF-G στο ριβόσωμα βρίσκεται στα domain II και VI του 23S rRNA και ότι απευθείας επαφές του 5S rRNA με αυτές τις περιοχές ή με τον EF-G δεν έχουν βρεθεί, οδηγούμαστε στην υπόθεση ότι, το 5S rRNA, μέσω αλλοστερικών σημάτων, επηρεάζει την EF-G-GTP δέσμευση στο ριβόσωμα, όχι όμως και την GTP υδρόλυση. Για να επιβεβαιώσουμε τα παραπάνω, μελετήθηκε η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rRNA, στη διαμορφωτική κατάσταση θεμελιωδών λειτουργικών κέντρων του ριβοσώματος. Η μελέτη εστιάστηκε στην ικανότητα του 5S rRNA να επηρεάζει τα κέντρα πρόσδεσης του EF-G στο ριβόσωμα, καθώς και τις θέσεις Α- και Ρ- του ριβοσωμικού συμπλόκου. Διαπιστώθηκε ότι η αλληλεπίδραση ελεύθερης σπερμίνης με το ριβόσωμα ενισχύει το αποτύπωμα (footprinting) χημικής προστασίας νουκλεοτιδίων υπευθύνων για την πρόσδεση του ΕF-G και τη συγκρότηση της Ρ-θέσης, όχι όμως και της Α-θέσης. Παρόμοια, αλλά μικρότερου βαθμού, ήταν και η επίδραση της προσδενομένης επιλεκτικά ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA. Συμπερασματικά, το 5S rRNA περιέχει θέσεις εξειδικευμένης πρόσδεσης πολυαμινών, οι οποίες επηρεάζουν την τριτοταγή του διαμόρφωση. Η δέσμευση της σπερμίνης στο 5S rRNA φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά την ικανότητα της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας να δεσμεύει υπόστρωμα, βελτιώνει όμως την καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος και την ικανότητα του να μετατοπίζει τα υποστρώματα. Οι πολυαμίνες ενεργοποιούν την δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, αλλά ελάχιστα επηρεάζουν την υδρόλυση του GTP από τον EF-G. Εν κατακλείδι, το 5S rRNA φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγωγή σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου και της περιοχής πρόσδεσης EFG. / In recent years, many research groups have focused their interest on 5S rRNA, the smallest RNA component of the ribosome that is preserved in almost all organisms. Its precise role in the ribosome, the protein “biosynthetic machine”, has not been fully clarified. The results of structural studies place 5S rRNA in the large ribosomal subunit. Findings concerning relations between structure and function lead to the assumption that 5S rRNA stabilises the structure of the ribosome and acts as natural transmitter of information between functional centres. On the other hand, the ionic environment directly affects ribosome function. Monovalent and divalent ions as well as polycations, such as polyamines, influence the ribosomal conformation, and therefore are involved in the function of the ribosome. Preliminary studies in our laboratory have shown that polyamines, namely spermine, stabilize the secondary and tertiary structure of 5S rRNA, leading to a more cohesive configuration of the molecule. The aim of this thesis was to investigate the role of 5S rRNA configuration in protein synthesis of the enterobacterium E.coli. At the same time, the biological activity of polyamines in the structure and functioning of both 5S rRNA and the whole ribosomal complex was studied. Polyamine binding to 5S rRNA was investigated by photoaffinity labeling, using a photoreactive analogue of spermine, ABA-spermine, as a molecular probe. Kinetic study was performed and the number of cross-linking sites of ABA-spermine in free 5S rRNA, or 5S rRNA incorporated into 50S subunits or 70S ribosomal complexes from E.coli ribosomes was determined. The results revealed that in free 5S rRNA spermine binds mainly to nucleotides of helices III and V and loops A, C, D and E. Integration of 5S rRNA into 50S subunits or 70S poly (U) – programmed ribosomes results in a great reduction of the susceptibility of 5S rRNA to ABA-spermine. The impact of the ABA-spermine photo-incorporation into the 5S rRNA molecule was then investigated. Chemical modification experiments revealed that, regardless of whether 5S rRNA is free or assembled in 50S subunits or 70S ribosomal complexes, binding of ABA-spermine causes significant changes in the conformation of the molecule. Loop A adopts a “looser” structure, while loops C, D, E and helices III and V achieve a more compact folding. With the discovery of changes in the configuration of 5S rRNA, due to ABA-spermine’s binding, it was interesting to study whether these conformational changes influence fundamental functions of the ribosome. Initially, the effect of changing the configuration of 5S rRNA on 50S subunit and 70S ribosomal complex assembly was investigated. The results showed that binding of ABA-spermine to 5S rRNA does not eliminate the process of 50S subunit assembly, but impedes the necessary structural changes by stabilising a more coherent structure of 5S rRNA, thermodynamically less favourable for the process. Despite the fact that binding of ABA-spermine to 5S rRNA results in structural changes that reduce the assembly of 50S subunits, when the later are formed they acquire such a structure that allows their interaction with 30S subunits. Nevertheless, the presence of 5S rRNA seems to be necessary for the formation of active 50S subunits, since 5S RNA-depleted ribosomal subunits do not associate with 30S subunits to functional 70S ribosomes. Next, the effect of photolabeling 5S rRNA was studied, initially on the ability of ribosomes to bind substrate, and then on their catalytic activity. Photolabeling of 5S rRNA with ABA-spermine caused a small but obvious activation in AcPhe-tRNA binding to the P-site. In contrast, binding to the A-site did not appear to be affected. Of great importance was the effect on the activity of peptidyl-transferase; in the presence of spermine, an increase of up to 30% on the activity of PTase was observed. Interestedly, ribosomes that lack 5S rRNA maintained ~ 10% of PTase activity, which leads to the assumption that 5S rRNA is not absolutely necessary for the formation of peptide bonds. The study of the effect of 5S rRNA conformational changes on ribosome's ability to translocate substrates followed. Spontaneous (non-enzymatic) translocation was studied first, and then, EF-G-catalyzed translocation. The results confirmed the assumption that translocation of substrates is an inherent property of the ribosome itself, even though extremely slow. At the same time, it was shown that binding of spermine to 5S rRNA, stimulates non-enzymatic translocation, possibly through changes in the folding of ribosomal RNA, that are beneficial in translocating tRNAs. Further, the presence of spermine in 5S rRNA reduced the requirements for EF-G. This result can be explained either by a possible beneficial effect of spermine to the binding of EF-G to the ribosome, either through its impact in the process of hydrolysis of GTP. To clarify which of the two versions is accurate, we studied the effect of 5S rRNA conformational changes on the ribosomal ability to bind EF-G, and then on their ability to trigger EF-G-dependent GTP hydrolysis. It was found that the presence of spermine in 5S rRNA promotes EF-G binding to ribosomes. In contrast, the results of the study showed that the initial rate of GTP hydrolysis was not influenced by the presence of spermine. Ribosomes depleted of 5S rRNA retained some GTP activity, but were unable to effectively bind EF-G even in the presence of spermine. Taking into account that EF-G binds in domain II and VI of 23S rRNA, but direct contacts of 5S rRNA with these areas or with EF-G have not been found, we are led to the conclusion that 5S rRNA affects EF-G-GTP binding to ribosomes, through allosteric signals, without affecting the EF-G-mediated GTP hydrolysis. To confirm the above, we studied the effect of the ionic environment and the changes in the tertiary structure of 5S rRNA on the conformational state of fundamental functional centres in the ribosome. Specifically, the study was focused on the ability of free spermine or photolabeling 5S rRNA with ABA-spermine to affect the SRL and GAC regions of the ribosome as well as the A-and P-sites. It was found that interaction of free spermine with ribosomes intensifies the footprint of EF-G within the ribosome and induces the AcPhe-tRNA binding to the P-site, but not to the A-site. Similar, but of lower degree, was the effect 5S rRNA labelling by ABA-spermine. In summary, a comprehensive view of the 5S rRNA nucleotide residues involved in spermine binding is gained by the present study. The results further suggest that binding of spermine to 5S rRNA causes conformational changes in certain regions of the molecule. These changes, although not of the extreme amplitude, enabled us to investigate the functional role of 5S rRNA. In light of this role, it seems that PTase center and EF-G binding center are able to coordinate their functions by transmission of allosteric signals through 5S rRNA.

L’ARNr 5S est une petite molécule d'ARN codée par le noyau, qui est partiellement adressée dans les mitochondries dans les cellules humaines. Bien que le mécanisme d'importation a été étudié, la fonction de ce phénomène est mal comprise. Les données publiées suggèrent que l’ARNr 5S importé pourrait participer à la synthèse des protéines mitochondriales, éventuellement être associé aux mitoribosomes. Cependant, les études structurelles ne supportent pas ces observations. Pour comprendre le rôle de l’ARNr 5S dans les mitochondries humaines, nous avons exploité plusieurs approches. Nous avons montré que seule une petite fraction de l’ARNr 5S pourrait être associé à mitoribosomes humaines, insuffisante pour former un complexe stoechiométrique 1:1. Nous avons appliqué l’approche de chromatographie d'affinité à l’ARN MS2 pour identifier les partenaires protéiques de l’ARNr 5S importé. Les résultats suggèrent que l’ARNr 5S pourrait être associé à des protéines ribosomales et des facteurs mitochondriaux d'assemblage du ribosome mitochondrial. Cela nous a permis de formuler une hypothèse sur la participation de l'ARNr 5S dans la biogenèse mitoribosomale. Ces données ont été partiellement validées par des expériences de co-immunoprécipitation, bien que plusieurs expériences sont encore nécessaires pour valider la participation ARNr 5S dans cette voie. / 5S rRNA is a small nuclear-encoded RNA molecule, which is partially imported into mitochondria from cytoplasm in human cells. Although the import mechanism was studied in details, the functional significance of this phenomenon is poorly understood. Published data suggest that imported 5S rRNA might participate in mitochondrial protein synthesis, possibly associating with mitoribosomes. However, structural studies do not support these observations. We have exploited several approaches to figure out the function of 5S rRNA in human mitochondria. Our studies showed that only a minor part of 5S rRNA pool could be associated with human mitoribosomes, insufficient to form stoichiometric 1:1 complex. We applied MS2 affinity chromatography approach to identify protein partners of 5S rRNA in human mitochondria. The results suggested that 5S rRNA could associate with mitochondrial ribosomal proteins and mitochondrial ribosome assembly factors. This allowed us to formulate a hypothesis about possible participation of 5S rRNA in mitoribosome biogenesis. The data were partially validated by co-immunoprecipitation experiments, although subsequent studies are required to validate 5S rRNA involvement in this pathway.

La biogenèse des ribosomes est un processus complexe qui implique la production et l'assemblage de 4 ARN et d'environ 80 protéines. Chez l'Homme, la production des deux sous-unités ribosomiques débute dans le nucléole par la synthèse par l'ARN polymérase I d'un long transcrit contenant les séquences des ARN ribosomiques 5.8S, 18S et 25S, qui s'associe de manière co-transcriptionnelle à des protéines ribosomiques et à des facteurs d'assemblage. Le quatrième ARN ribosomique, l'ARNr 5S est transcrit séparément par l'ARN polymérase III, et s'associe avec les protéines ribosomiques Rpl5 et Rpl11 en dehors du ribosome. Ce sous-complexe, appelé particule 5S, est ensuite intégré au sein de la grande sous-unité. La particule 5S est également impliquée dans le contrôle de la prolifération cellulaire. En effet, en cas de dé-régulation de la biogenèse du ribosome, la particule 5S s'accumule dans le nucléoplasme et interagit directement avec l'ubiquitine-ligase MDM2, provoquant la stabilisation du suppresseur de tumeur p53. L'objectif principal de ma thèse est d'étudier le rôle des facteurs d'assemblage Rpf2 et Rrs1 dans la biogenèse du ribosome. Ces protéines assurent deux fonctions distinctes : elles sont requises pour l'association de la particule 5S avec la sous-unité pré-60S, et stimulent la transcription des ARNr par l'ARN polymérase I. Elles sont donc impliquées dans deux événements fondamentaux qui conditionnent les capacités de prolifération cellulaire. La combinaison d'études structurales par cristallographie aux rayons X, et d'études d'interactions protéine-ARN in vitro et in vivo, m'ont permis de mieux appréhender le rôle du complexe Rpf2/Rrs1 dans l'intégration de la particule 5S et dans la maturation de la grande sous-unité. J'ai également étudié le rôle du complexe Rpf2/Rrs1 dans la régulation de la transcription des ARNr, en caractérisant ses interactions avec la polymérase I. / Ribosome Biogenesis is a complex process that requires the production and the correct assembly of the 4 rRNA with more than 80 proteins. Ribosome biogenesis starts by the transcription of a pre-RNA precursor in the nucleolus. Three of the four ribosomal RNAs, the 5.8S, 18S, and 25S rRNAs, are cotranscribed as a single 35S precursor by polymerase I. This precursor is cotranscriptionally modified, folded, cleaved, and assembled with both ribosomal proteins and non-ribosomal factors to generate the mature ribosomes. The fourth rRNA, the 5S rRNA, is transcribed by RNA polymerase III and is assembled into the 5S particle, containing ribosomal proteins Rpl5 and Rpl11, prior to its incorporation into preribosomes. In mammals, the 5S RNP is also a central regulator of the homeostasis of the tumor suppressor p53 The main objective of my thesis was to understand the precise roles of the two assembly factors Rpf2 and Rrs1 in ribosome biogenesis. These proteins have two distinctive functions : Rpf2 and Rrs1 are required for the 5S particle incorporation into the large subunit, and stimulate the rRNA transciption by polymerase I. Using a combination of structural studies by X-Ray crystallography and biochemical approaches as in vitro and in vivo methods to study proteins-RNA interactions, I was able to uncover the function of the Rpf2/Rrs1 dimer in the maturation of the large subunit through the recruitment of the 5S particle. I also studied the function of Rpf2 and Rrs1 in the rRNA transcription regulation, by characterizing physical connection with polymerase I subunits.

Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Στα βακτήρια, η μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα αποτελείται από δύο είδη RNA, το 23S και το 5S rRNA, καθώς και 33 πρωτεΐνες. Ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού και η απελευθέρωση της πεπτιδικής αλυσίδας επιτελούνται στη μεγάλη υπομονάδα, όπου εδράζεται το καταλυτικό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTase). Εκτός αυτού, η μεγάλη υπομονάδα περιλαμβάνει το κέντρο προσδέσεως των μεταφραστικών παραγόντων, το οποίο πυροδοτεί τη GTPase δραστηριότητα των G-πρωτεϊνικών παραγόντων, που εμπλέκονται στη μετατόπιση των υποστρωμάτων και άλλες ριβοσωματικές λειτουργίες. Έχει υποτεθεί ότι το 5S rRNA παίζει ουσιώδη ρόλο στη συγκρότηση του κέντρου της PTase και στη μετάδοση σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου και των ριβοσωματικών συστατικών που διεκπεραιώνουν τη μετατόπιση των υποστρωμάτων. Το ιοντικό περιβάλλον φαίνεται να επηρεάζει καθοριστικά τη διαμόρφωση του 5S rRNA. Για παράδειγμα, έχει βρεθεί ότι οι πολυαμίνες δεσμεύονται εκλεκτικά στο 5S rRNA και επηρεάζουν τη δραστικότητα του έναντι του διμεθυλο-θεϊκού, ενός αντιδραστηρίου-ιχνηθέτη της τριτοταγούς δομής του RNA. Αρχικά ελέγξαμε αν υπάρχουν εξειδικευμένες θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών στο 5S rRNA. Στη συνέχεια, με σκοπό να ελέγξουμε αν η πρόσδεση των πολυαμινών επηρεάζει τη λειτουργία του 5S rRNA, 70S ριβοσώματα προγραμματισμένα με πολύ-ουριδυλικό σχηματίσθηκαν από 50S υπομονάδες, ολικά ή εκλεκτικά φωτοσημασμένες με ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης και από 30S ακατέργαστες υπομονάδες. Αυτά τα ριβοσώματα είχαν την ικανότητα να δεσμεύουν AcPhe-tRNA ελαφρώς ισχυρότερα, σε σύγκριση με ριβοσώματα συγκροτημένα από φυσικά συστατικά, μη περιέχοντα πολυαμίνες. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η πρόσδεση πολυαμινών στο 5S rRNA επηρεάζει, σε μικρό βαθμό, τη λειτουργία του παράγοντα επιμήκυνσης EF-Tu. Συζευγμένα, όμως, τα εν λόγω ριβοσώματα με tRNAPhe στην Ε-θέση και AcPhe-tRNAστην Ρ-θέση, επέδειξαν ισχυρότερη καταλυτική δραστικότητα και αυξημένη ικανότητα για μετατόπιση των υποστρωμάτων. Τα αποτελέσματα αυτά εισηγούνται σημαντική εμπλοκή των πολυαμινών στο λειτουργικό ρόλο του 5S rRNA κατά την κατάλυση και μετατόπιση των υποστρωμάτων. / In bacteria, the large ribosomal subunit comprises two RNA species, 23S and 5S rRNA, and 33 proteins. Peptide bond formation and peptide release are catalyzed by the large subunit, where the peptidyltransferase (PTase) center is located. In addition to this center, which triggers the GTPase activities of G-protein factors involved in translocation and other ribosomal functions. It has been hypothesized that 5S rRNA plays essential role in assembling the PTase center and mediating signal transmissions between this center and the translocation machinery. Furthermore, the ionic environment seems to affect the conformation of 5S rRNA. For instance, polyamines have been found to bind specifically to 5S rRNA and influence the 5S rRNA reactivity towards dimethyl-sulfate (DMS), a chemical probe of RNA tertiary structure. Initially we examined whether there are specific sites for binding of polyamines. To test whether the binding of polyamines influence the function of 5S rRNA poly(U)-programmed 70S ribosomes were reconstituted from 50S subunits, totally or specifically photolabelled in their 5S rRNA with a photoreactive analogue of spermine, and native 30S subunits. These ribosomes were found to enzymatically bind AcPhe-tRNA better than ribosomes reconstituted from native components. This means, that furnishing 5S rRNA with spermine slightly influences the elongation factor EF-Tu function. However, equipped with tRNAPhe at the A-site and AcPhe-tRNA at the P-site, these ribosomes exhibited higher catalytic activity and enhanced tRNA translocation efficiency. These results suggest an essential impact of polyamines on the functional role of 5S rRNA in catalysis and translocation of translation substrates.

The import of yeast tRNALys (tRK1) into human mitochondria in the presence of cytosolic extract suggests that human cell possesses machinery for tRK1 import. Here, we show that precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase (preKARS2) interact with tRK1 and its derivatives containing tRK1 import determinants, and facilitates their import into isolated mitochondria and in vivo, when preKARS2 was overexpressed or downregulated. tRK1 import efficiency increased upon addition of glycolytic enzyme enolase, previously found as an actor of RNA import in yeast. We found that tRK1 and its derivatives translocate into mitochondrial matrix in polynucleotide phosphorylase (PNPase) dependent manner. Furthermore, a point mutation preventing trimerization of PNPase affect import of 5S rRNA and MRP RNA into mitochondria and subsequently mitochondrial translation. Overexpression of the wild-type PNPase induced an increase of 5S rRNA import into mitochondria and rescued translation.

L'importation de ARNtLys CUU (tRK1) de levure dans les mitochondries humaines indique que la cellule humaine possède la machinerie pour importation d'ARNt. Dans la présente étude, nous montrons que le précurseur de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale peut interagir avec tRK1 et ses dérivés contenant les déterminants d'import mitochondrial, et facilite leur internalisation par les mitochondries humaines. L'efficacité de l'importation augmentait à l'addition de l'énolase, d'enzyme glycolytique fonctionnant comme ARN chaperon. La translocation de tRK1 et de ses dérivés dans la matrice mitochondriale dépend également d'une autre protéine, la polynucléotide phosphorylase (PNPase). Mutation ponctuelle pathogénique qui prévient la trimérisation de PNPase diminue l'importation des ARNr 5S et ARN MRP dans les mitochondries ceci affectant la traduction mitochondriale. La surexpression de PNPase induit une augmentation des ARN importé et complémente le déficit de traduction mitochondriale. / The import of yeast tRNALys (tRK1) into human mitochondria in the presence of cytosolic extract suggests that human cell possesses machinery for tRK1 import. Here, we show that precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase (preKARS2) interact with tRK1 and its derivatives containing tRK1 import determinants, and facilitates their import into isolated mitochondria and in vivo, when preKARS2 was overexpressed or downregulated. tRK1 import efficiency increased upon addition of glycolytic enzyme enolase, previously found as an actor of RNA import in yeast. We found that tRK1 and its derivatives translocate into mitochondrial matrix in polynucleotide phosphorylase (PNPase) dependent manner. Furthermore, a point mutation preventing trimerization of PNPase affect import of 5S rRNA and MRP RNA into mitochondria and subsequently mitochondrial translation. Overexpression of the wild-type PNPase induced an increase of 5S rRNA import into mitochondria and rescued translation.