L’ARNr 5S est une petite molécule d'ARN codée par le noyau, qui est partiellement adressée dans les mitochondries dans les cellules humaines. Bien que le mécanisme d'importation a été étudié, la fonction de ce phénomène est mal comprise. Les données publiées suggèrent que l’ARNr 5S importé pourrait participer à la synthèse des protéines mitochondriales, éventuellement être associé aux mitoribosomes. Cependant, les études structurelles ne supportent pas ces observations. Pour comprendre le rôle de l’ARNr 5S dans les mitochondries humaines, nous avons exploité plusieurs approches. Nous avons montré que seule une petite fraction de l’ARNr 5S pourrait être associé à mitoribosomes humaines, insuffisante pour former un complexe stoechiométrique 1:1. Nous avons appliqué l’approche de chromatographie d'affinité à l’ARN MS2 pour identifier les partenaires protéiques de l’ARNr 5S importé. Les résultats suggèrent que l’ARNr 5S pourrait être associé à des protéines ribosomales et des facteurs mitochondriaux d'assemblage du ribosome mitochondrial. Cela nous a permis de formuler une hypothèse sur la participation de l'ARNr 5S dans la biogenèse mitoribosomale. Ces données ont été partiellement validées par des expériences de co-immunoprécipitation, bien que plusieurs expériences sont encore nécessaires pour valider la participation ARNr 5S dans cette voie. / 5S rRNA is a small nuclear-encoded RNA molecule, which is partially imported into mitochondria from cytoplasm in human cells. Although the import mechanism was studied in details, the functional significance of this phenomenon is poorly understood. Published data suggest that imported 5S rRNA might participate in mitochondrial protein synthesis, possibly associating with mitoribosomes. However, structural studies do not support these observations. We have exploited several approaches to figure out the function of 5S rRNA in human mitochondria. Our studies showed that only a minor part of 5S rRNA pool could be associated with human mitoribosomes, insufficient to form stoichiometric 1:1 complex. We applied MS2 affinity chromatography approach to identify protein partners of 5S rRNA in human mitochondria. The results suggested that 5S rRNA could associate with mitochondrial ribosomal proteins and mitochondrial ribosome assembly factors. This allowed us to formulate a hypothesis about possible participation of 5S rRNA in mitoribosome biogenesis. The data were partially validated by co-immunoprecipitation experiments, although subsequent studies are required to validate 5S rRNA involvement in this pathway.

La biogenèse des ribosomes est un processus complexe qui implique la production et l'assemblage de 4 ARN et d'environ 80 protéines. Chez l'Homme, la production des deux sous-unités ribosomiques débute dans le nucléole par la synthèse par l'ARN polymérase I d'un long transcrit contenant les séquences des ARN ribosomiques 5.8S, 18S et 25S, qui s'associe de manière co-transcriptionnelle à des protéines ribosomiques et à des facteurs d'assemblage. Le quatrième ARN ribosomique, l'ARNr 5S est transcrit séparément par l'ARN polymérase III, et s'associe avec les protéines ribosomiques Rpl5 et Rpl11 en dehors du ribosome. Ce sous-complexe, appelé particule 5S, est ensuite intégré au sein de la grande sous-unité. La particule 5S est également impliquée dans le contrôle de la prolifération cellulaire. En effet, en cas de dé-régulation de la biogenèse du ribosome, la particule 5S s'accumule dans le nucléoplasme et interagit directement avec l'ubiquitine-ligase MDM2, provoquant la stabilisation du suppresseur de tumeur p53. L'objectif principal de ma thèse est d'étudier le rôle des facteurs d'assemblage Rpf2 et Rrs1 dans la biogenèse du ribosome. Ces protéines assurent deux fonctions distinctes : elles sont requises pour l'association de la particule 5S avec la sous-unité pré-60S, et stimulent la transcription des ARNr par l'ARN polymérase I. Elles sont donc impliquées dans deux événements fondamentaux qui conditionnent les capacités de prolifération cellulaire. La combinaison d'études structurales par cristallographie aux rayons X, et d'études d'interactions protéine-ARN in vitro et in vivo, m'ont permis de mieux appréhender le rôle du complexe Rpf2/Rrs1 dans l'intégration de la particule 5S et dans la maturation de la grande sous-unité. J'ai également étudié le rôle du complexe Rpf2/Rrs1 dans la régulation de la transcription des ARNr, en caractérisant ses interactions avec la polymérase I. / Ribosome Biogenesis is a complex process that requires the production and the correct assembly of the 4 rRNA with more than 80 proteins. Ribosome biogenesis starts by the transcription of a pre-RNA precursor in the nucleolus. Three of the four ribosomal RNAs, the 5.8S, 18S, and 25S rRNAs, are cotranscribed as a single 35S precursor by polymerase I. This precursor is cotranscriptionally modified, folded, cleaved, and assembled with both ribosomal proteins and non-ribosomal factors to generate the mature ribosomes. The fourth rRNA, the 5S rRNA, is transcribed by RNA polymerase III and is assembled into the 5S particle, containing ribosomal proteins Rpl5 and Rpl11, prior to its incorporation into preribosomes. In mammals, the 5S RNP is also a central regulator of the homeostasis of the tumor suppressor p53 The main objective of my thesis was to understand the precise roles of the two assembly factors Rpf2 and Rrs1 in ribosome biogenesis. These proteins have two distinctive functions : Rpf2 and Rrs1 are required for the 5S particle incorporation into the large subunit, and stimulate the rRNA transciption by polymerase I. Using a combination of structural studies by X-Ray crystallography and biochemical approaches as in vitro and in vivo methods to study proteins-RNA interactions, I was able to uncover the function of the Rpf2/Rrs1 dimer in the maturation of the large subunit through the recruitment of the 5S particle. I also studied the function of Rpf2 and Rrs1 in the rRNA transcription regulation, by characterizing physical connection with polymerase I subunits.

L'importation de ARNtLys CUU (tRK1) de levure dans les mitochondries humaines indique que la cellule humaine possède la machinerie pour importation d'ARNt. Dans la présente étude, nous montrons que le précurseur de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale peut interagir avec tRK1 et ses dérivés contenant les déterminants d'import mitochondrial, et facilite leur internalisation par les mitochondries humaines. L'efficacité de l'importation augmentait à l'addition de l'énolase, d'enzyme glycolytique fonctionnant comme ARN chaperon. La translocation de tRK1 et de ses dérivés dans la matrice mitochondriale dépend également d'une autre protéine, la polynucléotide phosphorylase (PNPase). Mutation ponctuelle pathogénique qui prévient la trimérisation de PNPase diminue l'importation des ARNr 5S et ARN MRP dans les mitochondries ceci affectant la traduction mitochondriale. La surexpression de PNPase induit une augmentation des ARN importé et complémente le déficit de traduction mitochondriale. / The import of yeast tRNALys (tRK1) into human mitochondria in the presence of cytosolic extract suggests that human cell possesses machinery for tRK1 import. Here, we show that precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase (preKARS2) interact with tRK1 and its derivatives containing tRK1 import determinants, and facilitates their import into isolated mitochondria and in vivo, when preKARS2 was overexpressed or downregulated. tRK1 import efficiency increased upon addition of glycolytic enzyme enolase, previously found as an actor of RNA import in yeast. We found that tRK1 and its derivatives translocate into mitochondrial matrix in polynucleotide phosphorylase (PNPase) dependent manner. Furthermore, a point mutation preventing trimerization of PNPase affect import of 5S rRNA and MRP RNA into mitochondria and subsequently mitochondrial translation. Overexpression of the wild-type PNPase induced an increase of 5S rRNA import into mitochondria and rescued translation.