No description available.

The biogenesis of ribosomes is a fundamental process that occurs in all living cells. In mammalian cells, it is a highly complex process consisting of the coordinated synthesis and assembly of four ribosomal RNAs (rRNAs) with about 80 ribosomal proteins (RPs). More than 150 non-ribosomal proteins are involved in the processing of rRNAs. The main focus of this project is to use adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVCs) as a model to address how mTOR complex 1 (mTORC1) and other signalling pathways regulate the synthesis of rRNAs. A new technique has been developed to monitor the synthesis of new rRNAs using 4-thiouridine (4-SU) and I have applied it in both HeLa cells and heart muscle cells to study the control of ribosome synthesis. HeLa cells were treated with different mTOR inhibitors to identify effects on the transcription and/or decay of rRNA. We analysed both the synthesis rate and the decay rate of new RNAs made by Pol I and Pol III using real-time RT-PCR. Interestingly, rapamycin not only blocked the synthesis of 18S, 28S and 5S rRNA, but also induced the decay of newly synthesized rRNAs. This demonstrates that mTORC1 regulates Pol I and Pol III transcription, as well as the decay of rRNA. In cardiomyocytes, hypertrophic agents such as phenylephrine (PE) strongly activate protein synthesis and lead to heart cell growth. The boost of protein synthesis drives the increase of cell size and leads to hypertrophy. Cardiac hypertrophy (CH) is a major risk factor for heart failure. Therefore, it is important to understand the mechanisms that how hypertrophic agents which cause the overgrowth of heart muscle increase ribosome production. Although it is known that inhibiting mTORC1 largely blocks the rapid activation of protein synthesis by PE, here it did not affect the synthesis of new 18S rRNAs. However, inhibitors of the MEK/Erk pathway and p90RSK each block the new rRNA synthesis. These data reveal that, in contrast to many other types of cell, ribosome biogenesis is controlled by MEK/ERK/p90RSK signalling, not mTORC1, in cardiomyocytes. Taken together, the data presented here may provide cues for potential valuable therapy of cardiac left ventricular hypertrophy.

La biogenèse du ribosome est un processus indispensable à la prolifération cellulaire car elle permet la synthèse protéique assurant la croissance avant la division cellulaire. Les ribosomopathies telles que le syndrome myélodysplasique 5q- et l’anémie de Blackfan-Diamond sont dues respectivement à une mutation d’un gène codant une protéine ribosomique (RP) et à l’haploinsuffisance en RPS14, RP de la petite sous-unité du ribosome. Les patients atteints de l’une de ces ribosomopathies présentent un défaut de l’érythropoïèse suggérant que celle-ci est particulièrement dépendante du ribosome. L’érythropoïèse est le processus qui permet la formation de globules rouges à partir de cellules souches hématopoïétiques et consiste en différents stades de différenciation appelés érythroblastes. C’est dans ce contexte que je me suis intéressée au ribosome au cours de l’érythropoïèse. Dans un premier temps, nous avons caractérisé la biogenèse du ribosome dans des cellules érythroïdes primaires humaines et murines. Pour cela nous avons adapté une technique de SILAC pulsé et mis au point la ribomique, technique de protéomique permettant l’analyse de la biogenèse du ribosome dans des échantillons de cellules primaires basée sur l’identification presque exhaustive des protéines ribosomiques. À l’aide de la ribomique et par d’autres techniques, nous avons mis en évidence une diminution de la biogenèse du ribosome après le stade érythroblaste basophile. Nous avons également montré que cette biogenèse du ribosome est en partie sous le contrôle de la voie mTORC1 régulée par les deux cytokines fondamentales de l’érythropoïèse : le Stem Cell Factor (SCF) et l’érythropoïétine (EPO). L’expression par l’érythroblaste des récepteurs des deux cytokines permet une biogenèse du ribosome optimale. L’inhibition de la biogenèse du ribosome par le CX-5461, inhibiteur spécifique de l’ARN polymérase I, ou par la rapamycine, inhibiteur de mTORC1, entraîne une accélération de la différenciation érythroïde soulignant un rôle de la biogenèse du ribosome au cours de l’érythropoïèse. L’inhibition de la voie mTORC1 modifie l’ordre de clivage de l’ARNr, reflet d’une modification de sa maturation. Les expériences de ribomique dans les érythroblastes humains ont également permis de mettre en évidence la présence de paralogues de RP et la sous-représentation de certaines RPs au sein des ribosomes suggérant une hétérogénéité des ribosomes dans les érythroblastes humains. Parallèlement, un modèle mimant le syndrome 5q- a été développé par une approche shRPS14 dans une lignée humaine érythroleucémique dépendante de l’EPO. L’inhibition de RPS14 entraîne un défaut de biogenèse de la sous-unité 40S du ribosome aboutissant à une diminution des ribosomes entiers formés et une diminution de la traduction globale. Cependant une traduction est maintenue. Le défaut de biogenèse de la sous-unité 40S entraîne une augmentation de la quantité de c-KIT, récepteur du SCF et une diminution de la quantité de GATA1, facteur de transcription spécifique de l’érythropoïèse. Nous avons mis en évidence que la diminution de GATA1 est due à une diminution de sa traduction tandis que la traduction d’autres protéines est conservée dans ce contexte d’altération de la biogenèse du ribosome. Nous avons ensuite réalisé une analyse des transcrits présents dans les fractions polysomales correspondants à la traduction la plus efficace. Nous avons montré grâce à ce traductome que les propriétés thermodynamiques des parties 5’ et 3’UTR des ARNm modulent leur traduction dans le contexte d’inhibition de RPS14. Ces données suggèrent que l’altération de la biogenèse du ribosome peut aboutir à une modification du programme traductionnel. Ce travail montre que la biogenèse du ribosome diminue au cours de l’érythropoïèse et participe à la différenciation érythroïde. La voie mTORC1 participe au contrôle de cette biogenèse. / Ribosome biogenesis is a key event allowing cell growth before division. Defective RB recognized in ribosomopathyinherited Diamond-Blackfan anemia and 5q- syndrom. In this study, we aimed at investigating the regulatory role of RB during the erythroid precursor maturation which is characterized by a cell size reduction during 2 to 3 rapid cell divisions. We used two in vitro systemsé of expansion and differentiation of erythroblasts (E.) derived of immature hematopoietic progenitors from human mobilized peripheral blood or mouse fetal liver. The expansion step is supported by the Stem Cell Factor (SCF) and the second step depends on erythropoietin (EPO). The structure of the nucleolus was studied by electron microscopy. Compared to immature proerythroblasts (proE), a dramatic size reduction and change in nucleolar structure (ie. the disappearance of fibrillar and dense fibrillar components) is observed at the stage of mature polychromatophilic E. suggesting a loss of functionality. RB was measured by a pulsed SILAC (Stable Isotopic Labeling by Amino acids in Culture cell) proteomic assay that quantified the incorporation of newly synthesized ribosomal proteins in the ribosome. Both in mouse and human models, immature proE expanded upon SCF and EPO demonstrate a maximal RB with a renewal rate of 60% and 50% every 14h and 24h, respectively. By contrast, RB rapidly interrupted with the disappearance of proE and basophilic E after the switch to EPO alone. Consistently, the quantities of ribosomal RNA (rRNA) 45S precursor estimated by qPCR are maximal in proE and almost null in orthochromatophilic E. Inhibition of RB at proE stage by RNApol I specific inhibitor (CX-5461) accelerates the onset of terminal erythroid differentiation suggesting that RB is a rate limiting factor for final maturation. We then hypothesize that degree of signaling intensity in response to SCF and EPO may control the level of RB. To address this question, we investigated the mTORC1 (mechanistic Target Of Rapamycin Complex 1) pathway which is directly involved in RB through its substrate p70S6Kinase. Activation of P-p70S6Kinase and P-Rps6, as well as ribosome renewal, are twice more elevated in response to SCF and EPO than to EPO alone. Furthermore, inhibition of mTORC1/p70S6K/Rps6 pathway by rapamycin disrupts RB and leads to an acceleration of terminal erythroid differentiation.This study demonstrates that the collapse of RB promotes erythroid cell terminal maturation and shows the regulatory role of mTORC1 pathway on RB during erythropoiesis.

- / -

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο ρόλος στην ευκαρυωτική πρωτεϊνοσύνθεση των μεταλλάξεων rdn15 (A149G), η οποία βρίσκεται στο κέντρο αποκωδικοποίησης του ριβοσώματος του S. cerevisiae και sup45-R2ts, η οποία είναι εξωριβοσωματική και αφορά στην αντικατάσταση της προλίνης από αλανίνη στην θέση 86 του Τομέα 1 του eRF1. Η μελέτη έγινε με τη βοήθεια των αντιβιοτικών εδεΐνης, η οποία είναι ένας αναστολέας της έναρξης της μετάφρασης, και πακταμυκίνης, η οποία είναι ένας αναστολέας της μετατόπισης. Η μετάλλαξη rdn15 στον S.cerevisiae οδηγεί σε μικρή αύξηση του χρόνου διπλασιασμού των κυττάρων, ενώ επηρέασε μόνο ελαφρώς την πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα του ριβοσώματος. Τα αποτελέσματα αυτά είναι συμβατά με το γεγονός της φυσιολογικής παρουσίας της γουανίνης στη θέση 1491 στους προκαρυώτες και σε κατώτερους ευκαρυώτες. Η παρουσία της μετάλλαξης rdn15 δεν επηρέασε σημαντικά την πιστότητα, αν και η τάση ήταν η απόδοση στα ριβοσώματα ενός ελαφρά υπερακριβούς χαρακτήρα. Η μετάλλαξη sup45-R2ts στον eRF1 φάνηκε να επιβραδύνει την ανάπτυξη των κυττάρων διπλασιάζοντας σχεδόν τον χρόνο διπλασιασμού τους. Το αποτέλεσμα αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε καταστολή των κωδικίων λήξης αλλά και σε επαγωγή μεταφραστικών λαθών από τον μεταλλαγμένο παράγοντα τερματισμού. Η παρουσία της μετάλλαξης sup45-R2ts in vitro επηρέασε μόνο ελαφρά την πρωτεΐνοσυνθετική ενεργότητα του ριβοσώματος, ενώ αντιθέτως μείωσε σημαντικά τη μεταφραστική πιστότητα, αυξάνοντας τη Συχνότητα Λάθους του ριβοσώματος. Το αντιβιοτικό εδεΐνη αναστέλλει την ανάπτυξη τόσο των αγρίου τύπου και όσο και των μεταλλαγμένων στελεχών, ενώ όλα τα στελέχη εμφανίζουν όμοια ευαισθησία έναντι της εδεΐνης. Ο S. cerevisiae εμφανίζει παρόμοια ευαισθησία έναντι της εδεΐνης in vivo με αυτήν του E.coli . Αναδεικνύεται έτσι ότι και στο ευκαρυωτικό κύτταρο του S. cerevisiae , οι βάσεις με τις οποίες αλληλεπιδρά η εδεΐνη έχουν τον ίδιο λειτουργικό ρόλο, όπως και στο προκαρυωτικό ριβόσωμα. Η εδεΐνη μειώνει την πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα του ριβοσώματος του S. cerevisiae σε in vitro σύστημα μετάφρασης ελεύθερο κυττάρων, όπου τόσο το αγρίου τύπου όσο και τα μεταλλαγμένα στελέχη επέδειξαν παρόμοια ευαισθησία στη δράση της εδεΐνης Η έλλειψη διαφοροποίησης ανάμεσα στο αγρίου τύπου και τα μεταλλαγμένα στελέχη, μπορεί να ερμηνευθεί από το γεγονός ότι οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις δεν εμπλέκονται στη διαδικασία της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης, που είναι ο κύριος στόχος της εδεΐνης. Η επίδραση της εδεΐνης στη μεταφραστική πιστότητα μετρήθηκε με τη Συχνότητα Λάθους (Σ.Λ.). Η εδεΐνη ελαττώνει την πιστότητα της μετάφρασης στον ίδιο βαθμό περίπου στο ευκαρυωτικό όσο και στο προκαρυωτικό ριβόσωμα, η δράση της όμως διαφοροποιείται μεταξύ των στελεχών. Το υπερακριβές στέλεχος επέδειξε ελαφρώς μικρότερη ευαισθησία στην επαγωγή μεταφραστικών λαθών από την εδεΐνη σε σχέση με το αγρίου τύπου, ενώ αντιθέτως, το επιρρεπές σε λάθη στέλεχος εμφανίστηκε εξαιρετικά ευαίσθητο στην επαγωγή λαθών από την εδεΐνη σε σχέση με το αγρίου τύπου. Φαίνεται λοιπόν ότι η δράση της εδεΐνης στην πιστότητα ακολουθεί το χαρακτήρα της μετάλλαξης. Το αντιβιοτικό πακταμυκίνη αναστέλλει την ανάπτυξη in vivo των αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών. Ο S.cerevisiae εμφανίζει παρόμοια ευαισθησία έναντι της πακταμυκίνης in vivo με αυτήν του E.coli , ενώ οι υπό μελέτη μεταλλάξεις δεν επηρεάζουν την ευαισθησία των κυττάρων έναντι της πακταμυκίνης. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι τόσο η rdn15 μετάλλαξη στο κέντρο αποκωδικοποίησης όσο και η sup45-R2ts στον eRF1 δεν παρεμβαίνουν στη διαδικασία της μετατόπισης κατά τη μετάφραση, η αναστολή της οποίας αποτελεί τον κύριο τρόπο δράσης της πακταμυκίνης. Η πακταμυκίνη προκαλεί αναστολή σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης in vitro τόσο σε χαμηλές όσο και σε υψηλές συγκεντρώσεις σε όλα τα στελέχη. Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε αντίθεση με αυτό που ισχύει στο προκαρυωτικό κύτταρο, όπου η πακταμυκίνη διεγείρει τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης (Dinos et al., 2004). Η πακταμυκίνη ακόμη και σε υψηλές συγκεντρώσεις δεν προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στη Συχνότητα Λάθους του στελέχους αγρίου τύπου, ούτε στο υπερακριβές υπόβαθρο του rdn15 και στο επιρρεπές στα λάθη υπόβαθρο του sup45rdnwt. Το αποτέλεσμα αυτό δεν επιβεβαιώνει την υπερακρίβεια που προκαλεί στα προκαρυωτικά αλλά και δεν την αναιρεί. Η ταυτόχρονη παρουσία των δύο αντιβιοτικών ανέστειλε τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης σε αντίθεση με το πρωκαρυωτικό (Dinos et al., 2004), ακόμη και όταν η πακταμυκίνη χρησιμοποιήθηκε σε μεγάλη περίσσεια επί της εδεΐνης. Η ταυτόχρονη παρουσία των δύο αντιβιοτικών δεν έδειξε να μεταβάλλει το χαρακτήρα της αναστολής. Τα αποτελέσματα αυτά συνηγορούν υπέρ μιας αθροιστικής δράσης των δύο αντιβιοτικών και αποκλείουν τη συνεργατικότητά τους στη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης από το ευκαρυωτικό ριβόσωμα. Κατά την ταυτόχρονη παρουσία ακόμη και μεγάλης περίσσειας πακταμυκίνης η εδεΐνη εξακολουθεί να προκαλεί αύξηση στη Συχνότητα Λάθους που προσομοιάζει με αυτήν που παρατηρείται κατά την παρουσία εδεΐνης μόνο. Η αλληλεπίδραση των αντιβιοτικών στην πιστότητα της μετάφρασης είναι όμοια με αυτήν που παρατηρείται στο προκαρυωτικό ριβόσωμα. / In the present study we investigated the role of two mutations, rdn15 and sup45-R2ts, in eukaryotic protein synthesis. The former is substitution A1491G and it is located in the decoding center of the S. cerevisiae ribosome. The latter is extraribosomal and involves the substitution of proline by alanine in position 86 of Domain 1 of eukaryotic release factor eRF1. These strains were then employed for the study of the mode of action of two antibiotics, edeine and pactamycin, in eukaryotic protein synthesis. In bacterial cells, edeine has been characterized as an inhibitor of translation initiation, whereas pactamycin was recently found to act as a translocation inhibitor. Mutation rdn15 leads to a slight increase of doubling times but it has no significant effect on translational fidelity although there was a slight increase of the latter indicated by slightly lower error frequencies. It should be noted that guanine is naturally present in position 1491 of prokaryotic 16S rRNA. Thus, the lack of severe impairment of ribosomal function by mutation rdn15 shows that the nature of nucleotide 1491 is not essential for ribosomal function but may be useful in the fine tuning of ribosomal activity. Omnipotent suppressor mutation sup45-R2ts in eRF1 leads to a significant increase of doubling times, almost by a factor of 2 compared to the wild type strain. This might be a result of the suppression of nonsense codons or, in our case, an increase in misincorporation of amino acids during elongation. The presence of the sup45-R2ts mutation affected marginally the synthesis of polyphenylalanine in vitro. On the contrary, it remarkably reduced translational fidelity, increasing the Error Frequency. Edeine inhibits the growth of the wild type as well as the mutant strains. All strains exhibited similar sensitivity towards edeine. Moreover, this sensitivity of S. cerevisiae cells towards edeine is similar to the sensitivity of E. coli cells towards edeine. This could indicate that the RNA bases of the yeast ribosome, with which edeine interacts, have a similar functional role as in the prokaryotic one. Edeine reduces the amount polyphenylalanine synthesis in a cell-free in vitro system and it was found that all the strains exhibit the same sensitivity towards edeine. The lack of effect may be attributed to the fact that these mutations are not involved in the initiation of translation, which is the primary target of edeine. The effect of edeine in the translational fidelity was estimated by the error frequency. Edeine highly reduces translational fidelity in the eucaryotic ribosome, almost as much as in the prokaryotic one, but differentially between the wild type strain of S. cerevisiae and the mutant strains. The hyperaccurate strain exhibited less translational errors in the presence of edeine in comparison to the wild type strain. On the contrary, the error prone strain was very sensitive and displayed a very high translational error rate. It appears that the effect of edeine in fidelity is in line with the character of the mutation. Pactamycin suppressed the growth of both the wild type and the mutant strains in vivo. S. cerevisiae exhibits a similar sensitivity as E. coli in the effect of pactamycin in vivo, whereas the mutations under study did not affect the sensitivity of the cells. This could be attributed to the fact that mutation rdn15 in the decoding center and sup45-R2ts in eRF1 do not affect translocation during translation, which is the primary target of pactamycin. Pactamycin, both at low and high concentrations, suppresses the synthesis of polyphenylalanine in vitro in all the strains under study. This result is in contrast with the effect of pactamycin in the prokaryotic cell, where pactamycin increases polyphenylalanine synthesis (Dinos et al., 2004). Pactamycin, even at high concentrations, did not have severe effects in the error frequency of the wild type strain or in that of the hyperaccurate rdn15 strain or in that of the error-prone sup45rdnwt strain. This result does not agree with the hyperaccuracy that pactamycin induces in prokaryotes but does not come in contrast to it either. In the presence of both edeine and pactamycin the synthesis of polyphenylalanine was reduced, in contrast with what is observed in the prokaryotic ribosome (Dinos et al., 2004), even when pactamycin was used in higher concentrations than edeine. Thus, the simultaneous presence of both antibiotics does not seem to alter the character of the inhibition. These results are in favor of an additive effect of these antibiotics. Moreover, in the presence of high pactamycin concentrations, edeine induces a decrease in translational fidelity which is similar to that in the presence of edeine alone. The effects of these two antibiotics on the fidelity of translation are similar to those observed in the prokaryotic ribosome.

Il est maintenant clairement établi que la biogenèse des ribosomes est l’un des nombreux processus cellulaires qui voit sa régulation profondément modifiée au cours de la transformation cellulaire.Toutefois, si il est bien décrit que le taux synthèse des ribosomes est augmenté au cours du processus tumoral, de plus en plus de données suggèrent que les étapes posttranscriptionnelles peuvent aussi être altérées. Dans ce contexte biologique, les objectifs de cette thèse sont de déterminer si : i) la maturation de l’ARNr est altérée en plus de l’augmentation de sa synthèse ; ii) cette altération peut conduire à la synthèse de ribosomes modifiés dont la fonction est altérée ; iii) ces modifications participent directement à la dérégulation traductionnelle observée dans les cellules cancéreuses. Pour cela, nous avons étudié les principales étapes de la biogenèse des ribosomes ainsi que la composition des ribosomes et leurs capacités fonctionnelles dans différents modèles de progression et/ou d’agressivité tumorale. Les résultats obtenus montrent qu’en plus de l’augmentation du taux de synthèse des ribosomes, les étapes post-transcriptionnelles sont modifiées, en particuliers le niveau de méthylation de l’ARNr. Ces modifications sont associées à des défauts importants de traduction (saut de codon stop, incorporation erronée des acide-amines) et particulièrement à une augmentation de la traduction IRES-dépendante de facteur clefs de la tumorigénèse. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que les modifications de la biogenèse des ribosomes pourraient être une étape clef de la cancérogenèse, en modifiant les capacités traductionnelles des ribosomes cytoplasmiques / Ribosome biogenesis is a fundamental and extremely complex cell process. In mammals, ribosome synthesis coordinates the assembly of 80 proteins and 4 rRNA to form the two ribosomal sub-units. The maturation of the ribosome is a multi-step post-transcriptional process essential to obtain functional ribosomes. It is now well demonstrated that ribosome biogenesis and its regulation is altered during transformation process. However, if the increase of ribosome synthesis in cancer cell is well documented, there are numerous recent data suggesting that post-transcriptional steps could also be altered. In this biological context, the objectives of my Ph.D were to determine if: i) the maturation of rRNA is altered during the increase of ribosome synthesis; ii) these alterations could modify the ribosomes and alter their function and iii) these modifications directly participate to the deregulation of translation observed in cancer cells. We have explored the major steps of ribosome biogenesis as well as the structure of the cytoplasmic ribosomes and their functional capacity in different cellular models of tumor progression and/or aggressively. The results obtained show that in addition of the increase of the level of ribosome synthesis, post-transcriptional modifications are altered, particularly the level of rRNA methylation. These modifications are associated with strong defect of translation (stop codon bypass, misincorporation of amino-acid) and an increase of the IRES-dependant translation of important factors playing a crucial role in tumorigenesis. These results suggest that modifications of ribosome biogenesis could be a key step of cancer cell transformation

Plus de 200 facteurs pré-ribosomiques sont impliqués dans la maturation des ribosomes. La majorité de ces facteurs sont essentiels à la survie cellulaire, mais la fonction précise de la plupart d’entre eux demeure inconnue. Une des dernières étapes de maturation de la petite sous-unité du ribosome est le clivage du pré-ARNr 20S en ARNr 18S mature. Ce clivage est réalisé par l'endonucléase Nob1 et nécessite également la présence de la NTPase Fap7 ainsi que d’une pléthore d’autres facteurs pré-ribosomiques. La fonction de Fap7 est particulièrement intrigante, car l'homologue humain hCINAP possède une activité adénylate kinase, activité enzymatique qui n’est généralement pas liée à la biogenèse des particules ribonucléoprotéiques. En outre, la fonction de Fap7 est intimement liée à son interaction avec la protéine ribosomique Rps14. La partie C-terminale de Rps14 est essentielle pour le clivage au niveau du site D et est située à proximité de l’extrémité 3’ de l’ARNr 18S dans le ribosome mature. La suppression de cette protéine provoque le syndrome 5q qui est phénotypiquement proche de l’anémie de Diamond-Blackfan. Ces deux protéines interviennent également au niveau d’une voie de régulation de p53 qui est dérégulée dans de nombreux cancers. La combinaison d’études structurales par cristallographie aux rayons X, d’études enzymatiques sur des protéines recombinantes ainsi que des tests de maturation in vitro réalisés sur des pré-ribosomes purifiés, nous a permis de mieux appréhender la fonction de Fap7 au sein de la sous-unité pré-40S du ribosome. Nous avons également montré que l'interaction Fap7-Rps14 est impliquée dans un changement conformationnel majeur au cœur des pré-ribosomes et que cette réorganisation est nécessaire afin d'exposer le site D pour le clivage par l’endonucléase Nob1. / Over 200 pre-ribosomal factors involved in the maturation of ribosomes. Most of these factors are essential to cell survival, but the precise function of most of these factors remains elusive. One of the last steps of maturation of the small subunit of the ribosome is the cleavage of 20S pre-rRNA in 18S rRNA in the cytoplasm. This cleavage is carried out by the endonuclease Nob1 and also requires the presence of other factors such as the methyltransferase Dim1, and a plethora of NTPases including the Rio protein kinases, Prp43 and its cofactor Pfa1, the Ltv1 GTPase and the Fap7 NTPase. The function of Fap7 is especially intriguing since the human homologue bears Adenylate activity, an enzymatic activity not usually linked to ribonucleoprotein biogenesis. In addition, the function of Fap7 is intimately linked its interaction with the Rps14 ribosomal protein. The Rps14 C-terminal is essential of D site cleavage and is located in proximity to the 18S C-terminus in the mature ribosome. The deletion of this protein causes the 5q syndrome that is phenotypically close to Diamond Blackfan anemia. The link between the enzymatic activity of Fap7 and its role in ribosome biogenesis remains enigmatic. Using a combination of structural studies by X-ray crystallography, small angle X-ray scattering (SAXS) in solution, enzymatic studies on purified proteins, and in vitro D site cleavage reaction assays on purified pre-ribosomes, we were able to uncover the function of Fap7 within pre-40S ribosomes. We show that the Fap7/Rps14 interaction is involved in a major conformational change at the heart of the pre-ribosomes and that this structural rearrangement is necessary to expose the D-site for cleavage by the endonuclease Nob1.

La biogenèse des ribosomes est un processus complexe qui implique la production et l'assemblage de 4 ARN et d'environ 80 protéines. Chez l'Homme, la production des deux sous-unités ribosomiques débute dans le nucléole par la synthèse par l'ARN polymérase I d'un long transcrit contenant les séquences des ARN ribosomiques 5.8S, 18S et 25S, qui s'associe de manière co-transcriptionnelle à des protéines ribosomiques et à des facteurs d'assemblage. Le quatrième ARN ribosomique, l'ARNr 5S est transcrit séparément par l'ARN polymérase III, et s'associe avec les protéines ribosomiques Rpl5 et Rpl11 en dehors du ribosome. Ce sous-complexe, appelé particule 5S, est ensuite intégré au sein de la grande sous-unité. La particule 5S est également impliquée dans le contrôle de la prolifération cellulaire. En effet, en cas de dé-régulation de la biogenèse du ribosome, la particule 5S s'accumule dans le nucléoplasme et interagit directement avec l'ubiquitine-ligase MDM2, provoquant la stabilisation du suppresseur de tumeur p53. L'objectif principal de ma thèse est d'étudier le rôle des facteurs d'assemblage Rpf2 et Rrs1 dans la biogenèse du ribosome. Ces protéines assurent deux fonctions distinctes : elles sont requises pour l'association de la particule 5S avec la sous-unité pré-60S, et stimulent la transcription des ARNr par l'ARN polymérase I. Elles sont donc impliquées dans deux événements fondamentaux qui conditionnent les capacités de prolifération cellulaire. La combinaison d'études structurales par cristallographie aux rayons X, et d'études d'interactions protéine-ARN in vitro et in vivo, m'ont permis de mieux appréhender le rôle du complexe Rpf2/Rrs1 dans l'intégration de la particule 5S et dans la maturation de la grande sous-unité. J'ai également étudié le rôle du complexe Rpf2/Rrs1 dans la régulation de la transcription des ARNr, en caractérisant ses interactions avec la polymérase I. / Ribosome Biogenesis is a complex process that requires the production and the correct assembly of the 4 rRNA with more than 80 proteins. Ribosome biogenesis starts by the transcription of a pre-RNA precursor in the nucleolus. Three of the four ribosomal RNAs, the 5.8S, 18S, and 25S rRNAs, are cotranscribed as a single 35S precursor by polymerase I. This precursor is cotranscriptionally modified, folded, cleaved, and assembled with both ribosomal proteins and non-ribosomal factors to generate the mature ribosomes. The fourth rRNA, the 5S rRNA, is transcribed by RNA polymerase III and is assembled into the 5S particle, containing ribosomal proteins Rpl5 and Rpl11, prior to its incorporation into preribosomes. In mammals, the 5S RNP is also a central regulator of the homeostasis of the tumor suppressor p53 The main objective of my thesis was to understand the precise roles of the two assembly factors Rpf2 and Rrs1 in ribosome biogenesis. These proteins have two distinctive functions : Rpf2 and Rrs1 are required for the 5S particle incorporation into the large subunit, and stimulate the rRNA transciption by polymerase I. Using a combination of structural studies by X-Ray crystallography and biochemical approaches as in vitro and in vivo methods to study proteins-RNA interactions, I was able to uncover the function of the Rpf2/Rrs1 dimer in the maturation of the large subunit through the recruitment of the 5S particle. I also studied the function of Rpf2 and Rrs1 in the rRNA transcription regulation, by characterizing physical connection with polymerase I subunits.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε ο ρόλος της έλικας h44 του 18S rRNA του Saccharomyces cerevisiae επί διαφόρων παραμέτρων της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η μελέτη διεξήχθη με την βοήθεια των σημειακών μεταλλάξεων A1491G (rdn15) και U1495C (rdnhyg1), οι οποίες εντοπίζονται στην Α-θέση του ριβοσώματος. Η μετάλλαξη rdn15 επιδρά ήπια στον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων ενώ τα rdn15 ριβοσώματα επιτελούν την πρωτεϊνοσύνθεση με αυξημένη ακρίβεια. Η έλλειψη σοβαρών επιπτώσεων παρουσία της rdn15 φανερώνει ότι το νουκλεοτίδιο 1491 δεν παίζει καθοριστικό ρόλο στην λειτουργία του ριβοσώματος. Τα κύτταρα ζύμης που φέρουν την μετάλλαξη rdnhyg1 αναπτύσσονται βραδύτερα από τα κύτταρα αγρίου τύπου, ενώ τα rdnhyg1 ριβοσώματα πρωτεϊνοσυνθέτουν με ελαφρώς αυξημένη συχνότητα λάθους. Η μετάλλαξη αυξάνει επίσης την συγγένεια της Α-θέσης του ριβοσώματος για το αμινοακυλο-tRNA και επιδρά αρνητικά στο στάδιο της μετατόπισης, χωρίς να επηρεάζει την ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Η επίδραση της μετάλλαξης rdnhyg1 επί διαφόρων παραμέτρων της πρωτεϊνοσύνθεσης δικαιολογεί την συντήρηση της U1495 κατά την εξέλιξη. Η μετάλλαξη sup45-R2ts εντοπίζεται στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον παράγοντα τερματισμού eRF1 και οδηγεί στην αντικατάσταση της προλίνης 86 από αλανίνη. Η μετάλλαξη δεν επηρεάζει τις περισσότερες από τις λειτουργίες του ριβοσώματος που εξετάστηκαν, αλλά μειώνει την μεταφραστική πιστότητα. Σε κύτταρα που φέρουν ταυτόχρονα την μετάλλαξη sup45-R2ts και την ριβοσωματική μετάλλαξη rdn15, η συχνότητα λάθους αυξάνεται σε βαθμό μεγαλύτερο από την αθροιστική επίδραση των δύο επιμέρους μεταλλάξεων, επιβεβαιώνοντας μια ιδιαίτερη αλληλεπίδραση του μεταλλαγμένου παράγοντα eRF1 με τα rdn15 ριβοσώματα, που, όπως προκύπτει, αντιστρέφει τον υπερακριβή χαρακτήρα των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων. Όταν η μετάλλαξη sup45-R2ts συνυπάρχει με την ριβοσωματική μετάλλαξη rdnhyg1 η συχνότητα λάθους δεν επηρεάζεται σημαντικά. Η rdnhyg1 φαίνεται να ελαχιστοποιεί την επίδραση του μεταλλαγμένου παράγοντα eRF1 ενισχύοντας την δράση GTPάσης του eRF3. Τα παραπάνω αποτελέσματα φανερώνουν επιπλέον ότι η sup45 δύναται να μεταβάλει τις ιδιότητας ορισμένων μεταλλάξεων κατά την ριβοσωματική λειτουργία. Το στέλεχος που φέρει την μετάλλαξη rdn15 είναι πολύ ευαίσθητο έναντι της παρομομυκίνης αλλά και έναντι της τομπραμυκίνης, αν και σε μικρότερο βαθμό. Τα αποτελέσματα αυτά αποδίδονται στην ικανότητα της μετάλλαξης να αυξάνει την συγγένεια της Α-θέσης του ριβοσώματος για τα εν λόγω αντιβιοτικά. Αντίθετα, η μετάλλαξη rdn15 προσδίδει ανθεκτικότητα στην υγρομυκίνη, φανερώνοντας ότι ο τρόπος πρόσδεσης και δράσης του συγκεκριμένου αμινογλυκοζίτη διαφοροποιείται. Το στέλεχος που φέρει την μετάλλαξη rdnhyg1 είναι ανθεκτικό και στα τρία αντιβιοτικά σε σύγκριση με το αγρίου τύπου, φανερώνοντας ότι η U1495 είναι καθοριστική για την πρόσδεση των αμινογλυκοζιτών στο ριβόσωμα. Τα κύτταρα που φέρουν την εξωριβοσωματική μετάλλαξη sup45-R2ts είναι πιο ευαίσθητα από τα αντίστοιχα αγρίου τύπου έναντι και των τριών αμινογλυκοζιτών. Ωστόσο η μετάλλαξη sup45-R2ts, δεν επηρεάζει την ικανότητα των αντιβιοτικών αυτών να προσδένονται στα αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα ριβοσώματα και να επάγουν άμεσα τα μεταφραστικά λάθη. Η μελέτη επίδρασης των αμινγλυκοζιτών επιβεβαίωσε ότι η παρομομυκίνη και η υγρομυκίνη αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων ζύμης, ενώ η τομπραμυκίνη δεν έχει καμία επίδραση. Το γεγονός αυτό συνδυάζεται με την αδυναμία της τομπραμυκίνης να αναστείλει την πρόσδεση του υποστρώματος στην Α-θέση των ριβοσωμάτων. Ωστόσο η τομπραμυκίνη, όπως η παρομομυκίνη και η υγρομυκίνη, είναι ικανή να αυξήσει την συχνότητα λάθους και την σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης. / In present study, we investigated the role of helix h44 of 18S rRNA of Saccharomyces cerevisiae on several parameters of protein synthesis. For this purpose we employed mutations A1491G (rdn15) and U1495C (rdnhyg1) which are located in the A-site of the ribosome. The rdn15 mutation slightly delays cell growth, while rdn15 ribosomes translate proteins with higher fidelity. The lack of severe impairment of ribosomal function by mutation rdn15 indicates that the nature of nucleotide 1491 is not essential for ribosomal function. Yeast cells carrying the rdnhyg1 mutation grow slower than wild-type cells, while their ribosomes possess a slightly increased error rate. This mutation also increases the affinity of the A-site for aminoacyl-tRNA and renders ribosomes less efficient in translocation without affecting peptidyltransferase activity. The effect of mutation rdnhyg1 on several parameters of protein synthesis explains why U1495 is evolutionarily conserved. Mutation sup45-R2ts is located in the gene encoding eukaryotic Release Factor 1 (eRF1) and results in the substitution of proline 86 by alanine. This mutation leaves unaffected most ribosomal functions but it decreases translational fidelity. When ribosomal mutation rdn15 is introduced in cells already carrying sup45-R2ts mutation, the error frequency is increased to a degree which is higher than the additive effect of the two mutations, testifying to a previously reported special interaction of eRF1 with rdn15 ribosomes, which in this case reverses the hyperaccurate character of rdn15 ribosomes. When mutation sup45-R2ts is expressed in cells also carrying ribosomal mutation rdnhyg1, the error frequency is not significantly altered. Mutation rdnhyg1 seems to minimize the effect of the mutant factor eRF1 on ribosomal function by enhancing GTPase activity of eRF3. The results obtained with rdn15 and rdnhyg1 alone or in combination with sup45-R2ts show for the first time that the presence of sup45 may result in significant changes in the properties of the mutations under study. The strain carrying mutation rdn15 exhibits extremely high sensitivity toward paromomycin and also increases sensitivity of yeast ribosomes to tobramycin but to a lesser degree. These results demonstrate the ability of this mutation to increase affinity of the A-site for aminoglycosides. In contrast, mutation rdn15 causes resistance to hygromycin, revealing that binding and possibly action of hygromycin is differentiated from the other two aminoglycosides. The strain carrying mutation rdnhyg1 is resistant to all three antibiotics tested compared to wild type, indicating that U1495 participates in aminoglycoside binding to the ribosome. Cells carrying the extraribosomal mutation sup45-R2ts are more sensitive toward all three antibiotics compared to their wild type cells. Nevertheless, mutation sup45-R2ts does not affect the ability of these antibiotics to bind to the ribosome and directly induce translational errors. The study of amingolycoside action confirmed that paromomycin and hygromycin inhibit cells growth, while no such effect is observed during cell growth in the presence of tobramycin. This fact is combined with the inability of tobramycin to inhibit substrate binding to the ribosomal A-site Nevertheless, it was shown that tobramycin, like paromomycin and hygromycin, is effective both in inducing translational errors and increasing polyphenylalanine synthesis in wild-type and mutant ribosomes.