La nécessité de coordonner l’expression des gènes provenant de génomes différents chez les plantes a conduit à l’émergence de mécanismes imposant un contrôle nucléaire sur l’expression génétique de l’organelle. Des signaux antérogrades, exercés par des protéines reconnaissant des séquences spécifiques, existent en parallèle avec un contrôle des synthèses chloroplastiques dépendant de l’assemblage (CES). Ensemble, ils coordonnent la formation stoichiométrique des complexes photosynthétiques.La Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygénase (Rubisco) est une enzyme localisée dans le chloroplaste qui contient deux sous-unités. La grande sous-unité (LSU) et la petite sous-unité (SSU) sont codées par les génomes chloroplastique et nucléaire respectivement. Elles s’assemblent dans le stroma du chloroplaste pour former une holoenzyme hexadécamérique (LSU8SSU8). Pendant mon travail au laboratoire, j’ai tenté de décrire les étapes régulatrices majeures de la synthèse de la Rubisco chez Chlamydomonas reinhardtii en me focalisant sur la régulation post-transcriptionelle de la LSU.J’ai montré que la protéine PPR – MRL1 est un facteur limitant pour l’accumulation de l’ARN messager de rbcL. Bien qu’il ait été décrit précédemment comme un facteur stabilisateur du transcrit susnommé, MRL1 s’est révélé avoir un rôle dans la traduction.J’ai par ailleurs démontré que chez Chlamydomonas, l’expression de la Rubisco est contrôlée par la présence de la SSU. En son absence, la traduction de rbcL est inhibée par son propre produit – la grande sous-unité non assemblée. J’ai pu montrer qu’un intermédiaire d’assemblage, constitué de LSU en complexe avec sa chaperonne RAF1, est nécessaire pour cette régulation, ce qui prouve que ce processus dépend de l’état d’oligomérisation de la LSU. Parallèlement, j’ai caractérisé le devenir de la LSU non assemblée quand la régulation CES est perturbée, et grâce à cela ait contribué à améliorer la connaissance de son processus de repliement et d’assemblage. / The necessity to coordinate the expression of genes originating from different genomes within the plant cell resulted in the appearance of mechanisms imposing nuclear control over organelle gene expression. Anterograde signaling through sequence-specific trans-acting proteins (OTAFs) coexists in the chloroplast with an assembly dependent control of chloroplast synthesis (CES process) that coordinates the stoichiometric formation of photosynthetic complexes.Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) is a chloroplast-located carbon fixing enzyme constituted of two subunits. Large subunit (LSU) and small subunit (SSU) are encoded in the chloroplast and nuclear genomes respectively. In the stroma they assemble to form a hexadecameric holoenzyme (LSU8SSU8). In this study I tried to highlight major regulatory points of its synthesis in Chlamydomonas reinhardtii focusing on the posttranscriptional regulation of LSU.I showed that the MRL1 PPR protein is a limiting factor for rbcL mRNA accumulation. Whereas it has been previously designated as a stabilization factor for the abovementioned transcript, MRL1 appeared also to have a function in rbcL translation.Most notably, I have demonstrated that in Chlamydomonas reinhardtii Rubisco expression is controlled by the small subunit (SSU) presence. In its absence rbcL undergoes an inhibition of translation through its own product – the unassembled Rubisco large subunit. This process depends on LSU-oligomerization state as I was able to show that the presence of a high order LSU assembly intermediate bound to the RAF1 assembly chaperone is essential for the regulation to occur. In parallel I shed light on the fate of unassembled LSU in a deregulated CES context, thereby improving our understanding of the process of its folding and assembly.

Les molybdoenzymes sont des métalloprotéines retrouvées chez tous les êtres vivants, des procaryotes à l’Homme. Chez les organismes procaryotes, leur repliement et leur assemblage est un processus complexe nécessitant l’intervention de protéines chaperons spécifiques qui coordonnent l’insertion des centres métalliques au repliement et à l’assemblage des différentes sous-unités. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle du gène fdhD indispensable à l’activité des formiate déshydrogénases chez Escherichia coli et plus précisément sur son importance vis-à-vis de l’une d’entre elles, FdhF, une métalloprotéine à fer, molybdène et sélénium. FdhD interagit d’une part, avec sa cible FdhF et d’autre part, avec IscS, cystéine désulfurase majeure et impliquée notamment dans la biosynthèse des centres [Fe-S]. L’analyse de la séquence de FdhD met en évidence la présence d’un motif C121GXC124 conservé dont la substitution des résidus cystéine en alanine abolit la fonction de FdhD. En interagissant avec IscS, FdhD stimule son activité cystéine désulfurase et récupère le soufre généré en le fixant sous la forme de persulfures. La substitution des résidus cystéine a pour conséquence de réduire l’efficacité de transfert de soufre entre IscS et les variants de FdhD. La perte totale de l’activité FdhF enregistrée, en absence de FdhD, n’est pas due à une instabilité ou à un défaut d’insertion des centres métalliques mais est causée par une perte de sulfuration de l’enzyme. Sur la base de mes résultats, nous proposons que FdhD soit une soufre transférase entre IscS et FdhF. La sulfuration de FdhF par FdhD est essentielle à son activité enzymatique. Ce modèle est en accord avec les données cristallographiques indiquant la présence d’un atome de soufre au niveau de la sphère de coordination du Mo dans le site actif des formiate deshydrogénases et permet d’aller plus loin en reliant la présence du soufre à un état actif de l’enzyme et en identifiant les acteurs du processus. / Molybdoenzymes are ubiquitous metalloproteins found from prokaryotes to human. In prokaryotes, their folding and assembly is an intricate process assisted by dedicated chaperones coordinating metal centers insertion to folding and assembly of several subunits.During my PhD, I have investigated the role of the fdhD gene absolutely required for formate dehydrogenase activities in Escherichia coli and more precisely on one of them, FdhF, an iron-molybdenum-selenium metalloprotein. FdhD interacts with its target, FdhF and with IscS, a major cysteine desulfurase involved for instance in Fe-S cluster biogenesis. Sequence analysis of FdhD reveals the existence of a conserved C121GXC124 motif. Substitution of any of the two cysteine residues abolished FdhD function. Through IscS interaction, FdhD stimulates cysteine desulfurase activity and binds the sulfide generated by IscS in the forms of persulfides. Substitution of any of the conserved cysteine residues of FdhD reduces the sulfur transfer efficiency from IscS. Loss of FdhF activity in absence of fdhD is not due to intrinsic instability of loss of metal centers but rather due to lack of enzyme sulfuration. Based on my results, we postulate that FdhD functions as a sulfur transferase between IscS and FdhF, an essential step for enzyme activity. Our model is in complete agreement with crystallographic data showing the presence of a sulfur atom at the coordination sphere of the Mo atom at the active site of formate dehydrogenases and furthermore allows reconciling the presence of sulfur at the active site with enzymatic activity and identifying the players in this process.

L’identité des cellules souches et des progéniteurs neuraux, comme celle de tout type cellulaire, est caractérisée par des signatures moléculaires spécifiques qui dépendent de l’environnement dans lesquelles les cellules se trouvent. Ainsi, il est primordial d’étudier ces cellules dans un contexte in vivo. Le toit optique du poisson zèbre est un modèle idéal pour ce type d’étude. En effet, c’est une large partie du cerveau moyen localisée en position dorsale et qui présente la particularité de croitre de manière orientée tout au long de la vie de l’animal grâce aux cellules neuroépitheliales présentes à sa périphérie (dans la « peripheral midbrain layer », PML). De plus, les progéniteurs neuroépithéliaux, les progéniteurs lents et les cellules post-mitotiques sont localisées dans des domaines adjacents du toit, conséquence de sa croissance orientée. Chaque population cellulaire est marquée par des profils d’expression particuliers. Ainsi, une recherche dans la base de données ZFIN nous a permis d’identifier environ 50 gènes ayant une forte expression dans les cellules de la PML (progéniteurs neuroépithéliaux). De façon intéressante, beaucoup de « gènes PML » codent pour des facteurs de la biogenèse des ribosomes. L’accumulation de ce type de transcrits dans les progéniteurs lents était surprenante. Ainsi, au cours de mon doctorat, j’ai étudié le rôle spécifique des facteurs de la biogenèse des ribosomes dans le maintien des cellules neuroepithéliales de la PML. En effet, bien qu’il soit généralement admis que la biogenèse des ribosomes est un processus essentiel dans toutes les cellules, il a été récemment démontré que plusieurs facteurs nécessaires à la synthèse des ribosomes ont un rôle tissu-spécifique. Par exemple, Notchless est requis pour la survie de la masse cellulaire interne de l’embryon préimplantatoire de souris. Récemment, des expériences de knock-out conditionnel chez la souris ont montré que Notchless était nécessaire au maintien des cellules souches hématopoïétiques et intestinales, mais pas à celui des cellules différenciées. En effet, en absence de Notchless dans les cellules souches, la grosse sous-unité ribosomique (60S) ne peut pas être exportée hors du noyau et s’accumule. Au contraire, dans les cellules différenciées, où Notchless n’est pas indispensable, cette accumulation n’est pas observée. J’ai commencé une étude fonctionnelle basée sur la surexpression conditionnelle de la forme dominante-négative du gène notchless homolog 1 (nle1, homologue poisson zèbre du gène Notchless mammifère). Selon mon hypothèse, les progéniteurs lents de la PML (Slow amplifying progenitors, SAPs) pourraient avoir besoin de Notchless pour la maturation de la sous-unité 60S, contrairement aux cellules différenciées qui pourraient survivre après la délétion de ce gène. Des expériences sont encore en cours, mais nous avons déjà pu démontrer que nle1 joue un rôle crucial dans la survie des progénitéurs neuroépithéliaux de la PML. En parallèle, j’ai étudié des lignées de poisson-zèbre mutantes pour des gènes codants pour des composants du complexe de snoRNP (box C/D small nucleolar ribonucleoprotein : Fibrillarine, Nop56, Nop58). Les trois mutants présentent des phénotypes similaires, en particulier une apoptose massive et une dérégulation du cycle cellulaire dans l’ensemble du toit optique à 48 heures de développement. Étonnamment, ces résultats sont en faveur d’un arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M. Ainsi, cette étude pourrait permettre de mettre en évidence de nouveaux mécanismes d’arrêt du cycle cellulaire lors de défauts de biogenèse des ribosomes. L’ensemble de ces résultats montrent comment les facteurs de la biogenèse des ribosomes (tout comme le processus) contribue à la régulation fine de l’homéostasie cellulaire, et donc à la détermination de l’identité des cellules progénitrices. / In neural stem cells (NSCs) and neural progenitors (NPs), as in other cell types, cell identity is characterized by specific molecular signatures that depend on the environment provided by neighboring cells. Thus, it is important to study progenitor cells in vivo. The zebrafish optic tectum (OT) is a suitable model for that purpose. Indeed, this large structure of the dorsal midbrain displays life-long oriented growth supported by neuroepithelial cells present at its periphery (in the peripheral midbrain layer, PML). Moreover, neuroepithelial progenitors, fast-amplifying progenitors and post-mitotic cells are found in adjacent domains of the OT, as a consequence of its oriented growth. Each cell population is marked by concentric gene expression patterns. Interestingly, a datamining of the ZFIN gene expression database allowed us to identify around 50 genes displaying biased expression in PML cells (neuroepithelial progenitors). Interestingly, many “PML genes” code for ribosome biogenesis factors. The accumulation of transcripts for such ubiquitously expressed genes in SAPs was very surprising so during my thesis I examined whether ribosome biogenesis may have specific roles in these neuroepithelial cells, while improving our knowledge. Indeed, although it is generally admitted that ribosome biogenesis is essential in all cells, it has been shown quite recently that several components of the ribosome biogenesis have tissue restricted roles. For example, Notchless is required for the survival of the inner cell mass in the preimplantation mouse embryo. More recently, conditional knock-out experiments in mice showed that Notchless is necessary for the maintenance of hematopoietic stem cells and intestinal stem cells, but not for committed progenitors and differentiated cells. Indeed in the absence of Notchless in stem cells, the immature 60S subunit cannot be exported from the nucleus and accumulates. This does not happen in differentiated cells where Notchless is dispensable. I started a functional study based on the conditional overexpression of a dominant-negative form of the gene notchless homolog 1 (nle1, the zebrafish homolog of the mammalian gene Notchless). My hypothesis was that the PML slow-amplifying progenitors (SAPs) may require Notchless for the maturation of the 60S subunit, but not the differentiated cells which could survive also after the deletion of this gene. Experiments are still underway. So far we could demonstrate that nle1 has a crucial role in SAPs. I studied zebrafish mutants for genes coding for the components of the box C/D small nucleolar ribonucleoprotein (snoRNP) complex (Fibrillarin, Nop56, Nop58). Mutants displayed a similar phenotype with massive apoptosis and a deregulation of the cell cycle in the whole tectum at 48hpf. Our data suggest a cell cycle arrest at the G2/M transition, highlighting novel possible mechanisms of cell cycle arrest upon impaired ribosome biogenesis. All together, these data highlight how ribosome biogenesis factors and the whole ribosome biogenesis contribute to the fine regulation of cell homeostasis thereby contributing to the determination of progenitor cell identity.

La maladie de Parkinson (MP) est caractérisée par une dégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire. Elle est le plus souvent sporadique mais des formes familiales monogéniques existent, notamment dues à des mutations de PARK2 et de PINK1. Ces gènes codent pour l'ubiquitine-protéine ligase cytosolique Parkine et la sérine/thréonine kinase mitochondriale PINK1, deux acteurs majeurs du contrôle de qualité mitochondrial. Ce travail étudie le rôle de leur interaction au niveau de la membrane mitochondriale externe dans la régulation de l'homéostasie mitochondriale.Nous avons montré que l'association de PINK1 et Parkine au complexe d'import mitochondrial TOM lors d'un stress mitochondrial permet l'import de la grande majorité des protéines adressées à la mitochondrie ; que déstabiliser ce complexe suffit à initier la mitophagie ; et que l'activation de Parkine par PINK1 facilite l'import de son substrat HSD17?10. Nous avons développé un biosenseur moléculaire inductible, permettant d'étudier la voie d'import classique des protéines à pré-séquence. Nous avons également montré, dans un modèle neuronal, qu'un stress mitochondrial, en présence de Parkine, induit une forte augmentation de l'expression de gènes clés de la biogenèse mitochondriale ; et que ces gènes sont up-régulés de façon basale dans les neurones PARK2-/-, indiquant une possible altération de la réponse aigüe au stress.Ces résultats approfondissent notre connaissance de la physiopathologie des formes autosomiques récessives de MP en soulignant l'importance de la voie PINK1/Parkine dans l'import et la biogenèse mitochondriaux. / Parkinson’s disease (PD) is linked to a specific loss of dopaminergic neurons of the substancia nigra. The disease is most often sporadic but familial monogenic forms exist, for example due to mutations in PARK2 or PINK1. Those genes encore the cytosolic ubiquitin-protein ligase Parkin and the mitochondrial serine/threonine kinase PINK1, both essential for mitochondrial quality control. This work studies the role of their interaction at the outer mitochondrial membrane in the regulation of mitochondrial homeostasis. We found that the association of PINK1 and Parkin to the mitochondrial import TOM complex during mitochondrial stress induces the import of most proteins targeted to mitochondria; that destabilizing this complex is sufficient to initiate mitophagy; and that Parkin activation by PINK1 facilitates the import of its substrate, HSD17β10. We developed an inducible BRET-based molecular biosensor to study the classical pre-sequence import pathway. We also found, in a neuronal model, that mitochondrial stress induced a strong increase in the expression of mitochondrial biogenesis key genes, in the presence of Parkin; and that these genes are basally up-regulated in PARK2-/- neurons, possibly reflecting an alteration of acute stress response. These results increase our understanding of the pathophysiology of autosomal recessive forms of PD, underlining the importance of the PINK1/Parkin pathway in mitochondrial import and biogenesis.

L'énergie indispensable au fonctionnement de la cellule est produite principalement par la mitochondrie grâce au mécanisme de phosphorylation oxydative impliquant des protéines codées par le génome nucléaire et celui de la mitochondrie. La coordination transcriptionnelle de ces génomes est nécessaire à la biogenèse de mitochondries fonctionnelles, et est assurée par divers facteurs de transcription, tels que les NRFs (Nuclear Respiratory Factors) et les ERRs (Estrogen-Related Receptors). Leur efficacité transcriptionnelle est contrôlée par les coactivateurs de la famille PGC-1 (Peroxisome proliferator-activated receptor γ Coactivator-1) – PGC-1α, PGC-1β et PRC (PGC-1-Related Coactivator) – dont l'expression dépend de signaux endogènes ou environnementaux. Afin de préciser le rôle de PRC dans le dialogue nucléo-mitochondrial, nous avons utilisé plusieurs modèles cellulaires de carcinomes folliculaires thyroïdiens humains (RO82 W-1, FTC-133 et XTC.UC1) présentant une richesse en mitochondries, une orientation métabolique et des niveaux d'expression de PRC et de PGC-1α différents. Ce travail a mis en évidence le rôle clef du complexe ERRα–PRC dans la biogenèse de mitochondries fonctionnelles. PRC semble par ailleurs coordonner les phases du cycle cellulaire selon l'efficacité du métabolisme énergétique mitochondrial et le statut redox de la cellule. Dans ces modèles, notre travail a mis en évidence un rôle du monoxyde d'azote et du calcium comme régulateurs de la biogenèse et de la fonction mitochondriales PRC-dépendantes. L'ensemble de ces données fait du coactivateur PRC et des voies qui régulent sa fonction des cibles thérapeutiques potentielles dans les tumeurs.

Les chromodomaines sont présents dans de nombreux régulateurs de la structure chromatinienne. Ils sont très conservés et reconnaissent spécifiquement certaines lysines méthylées sur les histones. Chez la drosophile, l'Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto, impliqué dans la répression et dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes, contient un chromodomaine (CortoCD). La surexpression de CortoCD dans des drosophiles transgéniques montre que c'est un module d'adressage à la chromatine. L'identification par spectrométrie de masse des polypeptides retenus par CortoCD in vitro révèle qu'ils correspondent à des protéines ribosomiques nucléaires (RPs). Je me suis concentrée sur l'une d'entre elle, RPL12, car les homologues de cette dernière dans d'autres espèces possèdent de nombreux résidus lysines méthylés. J'ai montré que CortoCD reconnaît spécifiquement la lysine 3 de RPL12 triméthylée (RPL12K3me3). De plus, Corto et RPL12 co-localisent avec des marques épigénétiques activatrices sur les chromosomes polytènes. L'analyse par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine), de deux cibles transcriptionnelles de Corto et RPL12, révèle que ces deux protéines sont localisées dans le corps des gènes et ne sont pas enrichies sur les promoteurs, suggèrant un rôle dans l'élongation de la transcription. Des analyses transcriptomiques (RNAseq) montrent que Corto et RPL12 régulent majoritairement des gènes impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Nos résultats mettent en évidence pour la première fois une coopération entre une protéine ribosomique et un facteur de maintien de la mémoire épigénétique dans la régulation transcriptionnelle. Les chromodomaines sont présents dans de nombreux régulateurs de la structure chromatinienne. Ils sont très conservés et reconnaissent spécifiquement certaines lysines méthylées sur les histones. Chez la drosophile, l'Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto, impliqué dans la répression et dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes, contient un chromodomaine (CortoCD). La surexpression de CortoCD dans des drosophiles transgéniques montre que c'est un module d'adressage à la chromatine. L'identification par spectrométrie de masse des polypeptides retenus par CortoCD in vitro révèle qu'ils correspondent à des protéines ribosomiques nucléaires (RPs). Je me suis concentrée sur l'une d'entre elle, RPL12, car les homologues de cette dernière dans d'autres espèces possèdent de nombreux résidus lysines méthylés. J'ai montré que CortoCD reconnaît spécifiquement la lysine 3 de RPL12 triméthylée (RPL12K3me3). De plus, Corto et RPL12 co-localisent avec des marques épigénétiques activatrices sur les chromosomes polytènes. L'analyse par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine), de deux cibles transcriptionnelles de Corto et RPL12, révèle que ces deux protéines sont localisées dans le corps des gènes et ne sont pas enrichies sur les promoteurs, suggèrant un rôle dans l'élongation de la transcription. Des analyses transcriptomiques (RNAseq) montrent que Corto et RPL12 régulent majoritairement des gènes impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Nos résultats mettent en évidence pour la première fois une coopération entre une protéine ribosomique et un facteur de maintien de la mémoire épigénétique dans la régulation transcriptionnelle.

De nombreux facteurs régulant la fonction des Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) ont été identifiés ces dernières années grâce à des modèles murins. Au cours de ma thèse, j'ai montré que le gène Notchless (Nle) était nécessaire au maintien des CSH adultes. L'inactivation ubiquitaire de Nle chez la souris adulte provoque la mort des souris en une douzaine de jours, précédée d'une disparition rapide des CSH et des progéniteurs multipotents. Suite à la délétion de Nle, les CSH entrent en cycle indiquant que Nle pourrait être important pour le maintien de la quiescence des CSH. Aucune augmentation de l'apoptose n'a été détectée. Différentes approches de greffes ont montré que Nle était requis dans les CSH de façon autonome cellulaire. L'ensemble de ces données a permis de conclure que Nle est un régulateur critique du maintien des CSH, à l'homéostasie et en situation de stress. Par ailleurs, des approches in vivo et ex vivo suggèrent que Nle n'est pas requis pour le développement et la survie des cellules B et des progéniteurs myéloïdes. Des données récentes ont montré que l'orthologue de Nle chez la levure était impliqué dans la biogenèse des ribosomes. En utilisant des cellules ES murines, j'ai montré que ce rôle était conservé chez la souris. Par une approche combinée de marquages des cellules hématopoïétiques et de FISH sur les ARNr, j'ai montré que la délétion de Nle affectait la biogenèse des ribosomes dans les CSH et les progéniteurs immatures, mais pas dans le lignage B. Dans son ensemble, mon travail de thèse suggère que la synthèse des ribosomes pourrait être spécifiquement régulée en fonction du type cellulaire, et en particulier dans les cellules souches

Les salmonelles, responsables de fièvres typhoïdes et gastro-entérites, sont un problème majeur de santé publique. Les systèmes de sécrétion de type III (TTSS) sont des facteurs de virulence cruciaux de Salmonella. Nos travaux ont montré que délétion du cadre ouvert de lecture yfgL conduit à une faible transcription des gènes codant les 3 TTSS conduisant à une baisse importante de la virulence de Salmonella Enteritidis. Or, la délétion de ce gène, dont la protéine chez E.coli est en complexe avec les protéines YaeT, YfiO, NlpB et SmpA, conduit à une altération de la membrane externe. Chez S. Enteritidis, nous avons montré que le rôle du complexe « YaeT » dans l’assemblage des protéines de membrane externe est conservé. Or, seule l’inactivation d’yfiO, conduit une diminution de l’expression des TTSS. Nos travaux ont toutefois suggéré que le défaut d’assemblage des protéines de membrane externe n’est pas la cause de ce défaut d’expression des TTSS observés chez les mutants yfgL et yfiO. / Salmonella, responsible for typhoid fever and gastroenteritis, is a worldwide health problem. Type three secretion system (TTSS) are crucial virulence factors in Salmonella. Our work showed that deletion of the open reading frame yfgL led to a transcriptional down-regulation of the genes encoding the proteins involved in the biosynthesis of the 3 TTSS in Salmonella Enteritidis. It was shown that inactivation of yfgL whose encoded protein is in complex with YaeT, YfiO, NlpB and SmpA in E. coli, causes an outer membrane alteration. In S. Enteritidis, we observed that the role of the “YaeT” complex in outer membrane protein assembly is conserved in S. Enteritidis. In addition, only yfiO inactivation resulted in a down-expression of the TTSS. However, we presented elements suggesting that the outer membrane protein targeting defect was not responsible for the TTSS down-expression observed in the yfgL and yfiO mutants.

Les cellules souches (CS) se démarquent des progéniteurs et cellules différenciées à de nombreux égards. Notamment, les CS présentent des caractéristiques particulières dans des processus cellulaires fondamentaux, et il a été récemment proposé que la biogenèse des ribosomes (BiRi) participe à la régulation des CS. Pendant ma thèse, j’ai utilisé diverses approches pour étudier le rôle et la régulation de la BiRi dans des populations de CS, in vivo et ex vivo dans des modèles murins.Grâce à un modèle d’inactivation génétique du facteur de BiRi Notchless (Nle), j’ai participé à l’étude de son rôle dans le lignage hématopoïétique et l’épithélium intestinal adultes, et cours du développement embryonnaire précoce. In vivo, la perte constitutive de Nle entraîne une létalité embryonnaire, et j’ai montré ex vivo que l’inactivation de Nle dans des CS embryonnaires induit une réponse au stress ribosomique médiée par le suppresseur de tumeur p53, et des défauts de prolifération/survie. L’induction de la perte de Nle chez l’adulte active également p53 dans les CS hématopoïétiques et intestinale, entraînant leur rapide élimination.En parallèle, j’ai utilisé plusieurs méthodes pour mesurer l’activité de BiRi des progéniteurs immatures et CS hématopoïétiques (CSH) à l’homéostasie, in vivo chez la souris adulte. J’ai ainsi mis en évidence des variations de l’activité de BiRi dans ces populations, révélant notamment une activité de BiRi des CSH jusqu’ici insoupçonnée du fait de leur quiescence.Dans l’ensemble, mon travail renforce l’idée d’un rôle de la BiRi dans la régulation des CS, et apporte une meilleure compréhension de la régulation de ce processus dans le lignage hématopoïétique. / Stem cells (SCs) differ from progenitors and differentiated cells on many aspects. Notably, SCs display particular characteristics in fundamental cellular processes, and ribosome biogenesis (RiBi) has recently been proposed to play an important role in the regulation of SCs. During my thesis, I have used various approaches to study the role and regulation of RiBi in SC populations, using in vivo and ex vivo mouse models.Using genetic inactivation of the RiBi factor Notchless (Nle), I have participated to the analysis of its role in the adult hematopoietic system and intestinal epithelium, and in the establishment of the first cell lineages during early embryogenesis. In vivo, constitutive Nle deficiency causes early embryonic lethality, and I showed ex vivo that Nle inactivation in embryonic SCs induces a ribosomal stress response mediated by the tumor suppressor p53, and proliferation/survival defects. Conditional Nle inactivation in the adult mouse also induces activation of p53 in hematopoietic and intestinal SCs in vivo, leading to their rapid elimination.In parallel, I have used different methods to analyze the RiBi activity of hematopoietic SCs (HSCs) and immature progenitors at homeostasis, in vivo in the adult mouse. Thus, I have unraveled variations in the RiBi activity of these populations, and notably uncovered previously unsuspected RiBi activity in HSCs despite their quiescent state.Altogether, my work supports the hypothesis of a role for RiBi in the regulation of SCs and provides better understanding of the activity of this process during hematopoietic differentiation.

Dans un premier temps, je me suis intéressé à la sous-unité ε de l’ATP synthase mitochondriale chez la levure, un organisme qui se prête bien à l’étude des fonctions mitochondriales. Cette protéine fait partie d’un élément de l’ATP synthase appelé la tige centrale. Celui-ci permet de coupler le domaine translocateur de protons de cette enzyme (FO) à son secteur catalytique (F1) où l’ATP est synthétisé. En utilisant un système d’expression régulable (répressible par la doxycycline), j’ai montré qu’en l’absence de la sous-unité ε les secteurs F1 et FO ne sont plus couplés, avec pour résultat des fuites massives de protons à travers la membrane interne des mitochondries. J’ai ensuite montré que l’absence de la sous-unité ε peut être compensée par des mutations ralentissant l’activité du FO. Ces données permettent de conclure que la sous-unité ε est nécessaire au maintien de l’intégrité physique de l’ATP synthase lors de son fonctionnement. Dans un second temps, j’ai cherché à identifier de nouveaux facteurs intervenant dans la biogenèse du FO. Pour cela, j’ai utilisé un crible génétique où la survie des cellules de levure est conditionnée à des mutations inactivation le FO. Un millier d’isolats a été analysé. Les mutations ont été localisées dans les génomes mitochondrial et nucléaire. Dix-huit clones, issus de mutations n’affectant pas des facteurs connus pour être nécessaires à l’expression de l’ATP synthase, ont été entièrement séquencés. Plusieurs nouveaux systèmes cellulaires potentiellement impliqués dans la biogenèse du FO ont été identifiés. / At first, I am interested in the ε subunit of mitochondrial ATP synthase in yeast, an organism that is well suited for the study of mitochondrial functions. This protein is a part of the ATP synthase called central stalk. This allows the coupling of proton translocator domain of this enzyme (FO) to its catalytic domain (F1) where ATP is synthesized. Using a tetO expression system, I showed that in the absence of the ε subunit, F1 and FO domains are no longer coupled. It results in a massive proton leakage across the inner membrane of mitochondria. I then showed that the absence of the ε subunit can be compensated by mutations slowing the activity of FO. These data allow to conclude that the ε subunit is necessary to maintain the physical integrity of the ATP synthase for oxydative phosphorylation. Later, I tried to identify new factors involved in the biogenesis of the FO. For this, I used a genetic screen where the survival of yeast cells is conditioned by mutations inactivating the FO. About a thousand clones were analyzed. The mutations were localized in mitochondrial and nuclear genomes. Eighteen clones with mutations in genes encoding not yet known ATP synthase expression factors were completely sequenced. Several new cellular systems that are potentially involved in the biogenesis of FO were identified.