L’identité des cellules souches et des progéniteurs neuraux, comme celle de tout type cellulaire, est caractérisée par des signatures moléculaires spécifiques qui dépendent de l’environnement dans lesquelles les cellules se trouvent. Ainsi, il est primordial d’étudier ces cellules dans un contexte in vivo. Le toit optique du poisson zèbre est un modèle idéal pour ce type d’étude. En effet, c’est une large partie du cerveau moyen localisée en position dorsale et qui présente la particularité de croitre de manière orientée tout au long de la vie de l’animal grâce aux cellules neuroépitheliales présentes à sa périphérie (dans la « peripheral midbrain layer », PML). De plus, les progéniteurs neuroépithéliaux, les progéniteurs lents et les cellules post-mitotiques sont localisées dans des domaines adjacents du toit, conséquence de sa croissance orientée. Chaque population cellulaire est marquée par des profils d’expression particuliers. Ainsi, une recherche dans la base de données ZFIN nous a permis d’identifier environ 50 gènes ayant une forte expression dans les cellules de la PML (progéniteurs neuroépithéliaux). De façon intéressante, beaucoup de « gènes PML » codent pour des facteurs de la biogenèse des ribosomes. L’accumulation de ce type de transcrits dans les progéniteurs lents était surprenante. Ainsi, au cours de mon doctorat, j’ai étudié le rôle spécifique des facteurs de la biogenèse des ribosomes dans le maintien des cellules neuroepithéliales de la PML. En effet, bien qu’il soit généralement admis que la biogenèse des ribosomes est un processus essentiel dans toutes les cellules, il a été récemment démontré que plusieurs facteurs nécessaires à la synthèse des ribosomes ont un rôle tissu-spécifique. Par exemple, Notchless est requis pour la survie de la masse cellulaire interne de l’embryon préimplantatoire de souris. Récemment, des expériences de knock-out conditionnel chez la souris ont montré que Notchless était nécessaire au maintien des cellules souches hématopoïétiques et intestinales, mais pas à celui des cellules différenciées. En effet, en absence de Notchless dans les cellules souches, la grosse sous-unité ribosomique (60S) ne peut pas être exportée hors du noyau et s’accumule. Au contraire, dans les cellules différenciées, où Notchless n’est pas indispensable, cette accumulation n’est pas observée. J’ai commencé une étude fonctionnelle basée sur la surexpression conditionnelle de la forme dominante-négative du gène notchless homolog 1 (nle1, homologue poisson zèbre du gène Notchless mammifère). Selon mon hypothèse, les progéniteurs lents de la PML (Slow amplifying progenitors, SAPs) pourraient avoir besoin de Notchless pour la maturation de la sous-unité 60S, contrairement aux cellules différenciées qui pourraient survivre après la délétion de ce gène. Des expériences sont encore en cours, mais nous avons déjà pu démontrer que nle1 joue un rôle crucial dans la survie des progénitéurs neuroépithéliaux de la PML. En parallèle, j’ai étudié des lignées de poisson-zèbre mutantes pour des gènes codants pour des composants du complexe de snoRNP (box C/D small nucleolar ribonucleoprotein : Fibrillarine, Nop56, Nop58). Les trois mutants présentent des phénotypes similaires, en particulier une apoptose massive et une dérégulation du cycle cellulaire dans l’ensemble du toit optique à 48 heures de développement. Étonnamment, ces résultats sont en faveur d’un arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M. Ainsi, cette étude pourrait permettre de mettre en évidence de nouveaux mécanismes d’arrêt du cycle cellulaire lors de défauts de biogenèse des ribosomes. L’ensemble de ces résultats montrent comment les facteurs de la biogenèse des ribosomes (tout comme le processus) contribue à la régulation fine de l’homéostasie cellulaire, et donc à la détermination de l’identité des cellules progénitrices. / In neural stem cells (NSCs) and neural progenitors (NPs), as in other cell types, cell identity is characterized by specific molecular signatures that depend on the environment provided by neighboring cells. Thus, it is important to study progenitor cells in vivo. The zebrafish optic tectum (OT) is a suitable model for that purpose. Indeed, this large structure of the dorsal midbrain displays life-long oriented growth supported by neuroepithelial cells present at its periphery (in the peripheral midbrain layer, PML). Moreover, neuroepithelial progenitors, fast-amplifying progenitors and post-mitotic cells are found in adjacent domains of the OT, as a consequence of its oriented growth. Each cell population is marked by concentric gene expression patterns. Interestingly, a datamining of the ZFIN gene expression database allowed us to identify around 50 genes displaying biased expression in PML cells (neuroepithelial progenitors). Interestingly, many “PML genes” code for ribosome biogenesis factors. The accumulation of transcripts for such ubiquitously expressed genes in SAPs was very surprising so during my thesis I examined whether ribosome biogenesis may have specific roles in these neuroepithelial cells, while improving our knowledge. Indeed, although it is generally admitted that ribosome biogenesis is essential in all cells, it has been shown quite recently that several components of the ribosome biogenesis have tissue restricted roles. For example, Notchless is required for the survival of the inner cell mass in the preimplantation mouse embryo. More recently, conditional knock-out experiments in mice showed that Notchless is necessary for the maintenance of hematopoietic stem cells and intestinal stem cells, but not for committed progenitors and differentiated cells. Indeed in the absence of Notchless in stem cells, the immature 60S subunit cannot be exported from the nucleus and accumulates. This does not happen in differentiated cells where Notchless is dispensable. I started a functional study based on the conditional overexpression of a dominant-negative form of the gene notchless homolog 1 (nle1, the zebrafish homolog of the mammalian gene Notchless). My hypothesis was that the PML slow-amplifying progenitors (SAPs) may require Notchless for the maturation of the 60S subunit, but not the differentiated cells which could survive also after the deletion of this gene. Experiments are still underway. So far we could demonstrate that nle1 has a crucial role in SAPs. I studied zebrafish mutants for genes coding for the components of the box C/D small nucleolar ribonucleoprotein (snoRNP) complex (Fibrillarin, Nop56, Nop58). Mutants displayed a similar phenotype with massive apoptosis and a deregulation of the cell cycle in the whole tectum at 48hpf. Our data suggest a cell cycle arrest at the G2/M transition, highlighting novel possible mechanisms of cell cycle arrest upon impaired ribosome biogenesis. All together, these data highlight how ribosome biogenesis factors and the whole ribosome biogenesis contribute to the fine regulation of cell homeostasis thereby contributing to the determination of progenitor cell identity.

Les chromodomaines sont présents dans de nombreux régulateurs de la structure chromatinienne. Ils sont très conservés et reconnaissent spécifiquement certaines lysines méthylées sur les histones. Chez la drosophile, l'Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto, impliqué dans la répression et dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes, contient un chromodomaine (CortoCD). La surexpression de CortoCD dans des drosophiles transgéniques montre que c'est un module d'adressage à la chromatine. L'identification par spectrométrie de masse des polypeptides retenus par CortoCD in vitro révèle qu'ils correspondent à des protéines ribosomiques nucléaires (RPs). Je me suis concentrée sur l'une d'entre elle, RPL12, car les homologues de cette dernière dans d'autres espèces possèdent de nombreux résidus lysines méthylés. J'ai montré que CortoCD reconnaît spécifiquement la lysine 3 de RPL12 triméthylée (RPL12K3me3). De plus, Corto et RPL12 co-localisent avec des marques épigénétiques activatrices sur les chromosomes polytènes. L'analyse par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine), de deux cibles transcriptionnelles de Corto et RPL12, révèle que ces deux protéines sont localisées dans le corps des gènes et ne sont pas enrichies sur les promoteurs, suggèrant un rôle dans l'élongation de la transcription. Des analyses transcriptomiques (RNAseq) montrent que Corto et RPL12 régulent majoritairement des gènes impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Nos résultats mettent en évidence pour la première fois une coopération entre une protéine ribosomique et un facteur de maintien de la mémoire épigénétique dans la régulation transcriptionnelle. Les chromodomaines sont présents dans de nombreux régulateurs de la structure chromatinienne. Ils sont très conservés et reconnaissent spécifiquement certaines lysines méthylées sur les histones. Chez la drosophile, l'Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto, impliqué dans la répression et dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes, contient un chromodomaine (CortoCD). La surexpression de CortoCD dans des drosophiles transgéniques montre que c'est un module d'adressage à la chromatine. L'identification par spectrométrie de masse des polypeptides retenus par CortoCD in vitro révèle qu'ils correspondent à des protéines ribosomiques nucléaires (RPs). Je me suis concentrée sur l'une d'entre elle, RPL12, car les homologues de cette dernière dans d'autres espèces possèdent de nombreux résidus lysines méthylés. J'ai montré que CortoCD reconnaît spécifiquement la lysine 3 de RPL12 triméthylée (RPL12K3me3). De plus, Corto et RPL12 co-localisent avec des marques épigénétiques activatrices sur les chromosomes polytènes. L'analyse par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine), de deux cibles transcriptionnelles de Corto et RPL12, révèle que ces deux protéines sont localisées dans le corps des gènes et ne sont pas enrichies sur les promoteurs, suggèrant un rôle dans l'élongation de la transcription. Des analyses transcriptomiques (RNAseq) montrent que Corto et RPL12 régulent majoritairement des gènes impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Nos résultats mettent en évidence pour la première fois une coopération entre une protéine ribosomique et un facteur de maintien de la mémoire épigénétique dans la régulation transcriptionnelle.

De nombreux facteurs régulant la fonction des Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) ont été identifiés ces dernières années grâce à des modèles murins. Au cours de ma thèse, j'ai montré que le gène Notchless (Nle) était nécessaire au maintien des CSH adultes. L'inactivation ubiquitaire de Nle chez la souris adulte provoque la mort des souris en une douzaine de jours, précédée d'une disparition rapide des CSH et des progéniteurs multipotents. Suite à la délétion de Nle, les CSH entrent en cycle indiquant que Nle pourrait être important pour le maintien de la quiescence des CSH. Aucune augmentation de l'apoptose n'a été détectée. Différentes approches de greffes ont montré que Nle était requis dans les CSH de façon autonome cellulaire. L'ensemble de ces données a permis de conclure que Nle est un régulateur critique du maintien des CSH, à l'homéostasie et en situation de stress. Par ailleurs, des approches in vivo et ex vivo suggèrent que Nle n'est pas requis pour le développement et la survie des cellules B et des progéniteurs myéloïdes. Des données récentes ont montré que l'orthologue de Nle chez la levure était impliqué dans la biogenèse des ribosomes. En utilisant des cellules ES murines, j'ai montré que ce rôle était conservé chez la souris. Par une approche combinée de marquages des cellules hématopoïétiques et de FISH sur les ARNr, j'ai montré que la délétion de Nle affectait la biogenèse des ribosomes dans les CSH et les progéniteurs immatures, mais pas dans le lignage B. Dans son ensemble, mon travail de thèse suggère que la synthèse des ribosomes pourrait être spécifiquement régulée en fonction du type cellulaire, et en particulier dans les cellules souches

Les cellules souches (CS) se démarquent des progéniteurs et cellules différenciées à de nombreux égards. Notamment, les CS présentent des caractéristiques particulières dans des processus cellulaires fondamentaux, et il a été récemment proposé que la biogenèse des ribosomes (BiRi) participe à la régulation des CS. Pendant ma thèse, j’ai utilisé diverses approches pour étudier le rôle et la régulation de la BiRi dans des populations de CS, in vivo et ex vivo dans des modèles murins.Grâce à un modèle d’inactivation génétique du facteur de BiRi Notchless (Nle), j’ai participé à l’étude de son rôle dans le lignage hématopoïétique et l’épithélium intestinal adultes, et cours du développement embryonnaire précoce. In vivo, la perte constitutive de Nle entraîne une létalité embryonnaire, et j’ai montré ex vivo que l’inactivation de Nle dans des CS embryonnaires induit une réponse au stress ribosomique médiée par le suppresseur de tumeur p53, et des défauts de prolifération/survie. L’induction de la perte de Nle chez l’adulte active également p53 dans les CS hématopoïétiques et intestinale, entraînant leur rapide élimination.En parallèle, j’ai utilisé plusieurs méthodes pour mesurer l’activité de BiRi des progéniteurs immatures et CS hématopoïétiques (CSH) à l’homéostasie, in vivo chez la souris adulte. J’ai ainsi mis en évidence des variations de l’activité de BiRi dans ces populations, révélant notamment une activité de BiRi des CSH jusqu’ici insoupçonnée du fait de leur quiescence.Dans l’ensemble, mon travail renforce l’idée d’un rôle de la BiRi dans la régulation des CS, et apporte une meilleure compréhension de la régulation de ce processus dans le lignage hématopoïétique. / Stem cells (SCs) differ from progenitors and differentiated cells on many aspects. Notably, SCs display particular characteristics in fundamental cellular processes, and ribosome biogenesis (RiBi) has recently been proposed to play an important role in the regulation of SCs. During my thesis, I have used various approaches to study the role and regulation of RiBi in SC populations, using in vivo and ex vivo mouse models.Using genetic inactivation of the RiBi factor Notchless (Nle), I have participated to the analysis of its role in the adult hematopoietic system and intestinal epithelium, and in the establishment of the first cell lineages during early embryogenesis. In vivo, constitutive Nle deficiency causes early embryonic lethality, and I showed ex vivo that Nle inactivation in embryonic SCs induces a ribosomal stress response mediated by the tumor suppressor p53, and proliferation/survival defects. Conditional Nle inactivation in the adult mouse also induces activation of p53 in hematopoietic and intestinal SCs in vivo, leading to their rapid elimination.In parallel, I have used different methods to analyze the RiBi activity of hematopoietic SCs (HSCs) and immature progenitors at homeostasis, in vivo in the adult mouse. Thus, I have unraveled variations in the RiBi activity of these populations, and notably uncovered previously unsuspected RiBi activity in HSCs despite their quiescent state.Altogether, my work supports the hypothesis of a role for RiBi in the regulation of SCs and provides better understanding of the activity of this process during hematopoietic differentiation.

La RNase E chez Escherichia coli est une endoribonucléase essentielle qui joue un rôle important dans la maturation des ARN stables, dans le contrôle qualité des ribosomes, ainsi que dans la dégradation constitutive et régulée des ARN messagers. La séquence de ciblage à la membrane (MTS pour Membrane Targeting Sequence), qui forme une hélice α-amphipatique, ancre la RNase E à la membrane cytoplasmique interne des cellules. La conservation absolue du MTS chez l'ensemble des -protéobactéries suggère un rôle important de la localisation membranaire RNase E dans le métabolisme de l'ARN. Pour élucider la fonction cellulaire de l'association membranaire de la RNase E, nous avons caractérisé la souche rne∆MTS qui exprime une RNase E cytoplasmique. Les résultats de cette étude nous amènent à proposer que l'association membranaire de la RNase E est nécessaire à la stabilité de la RNase E, est impliquée dans des interactions fonctionnelles avec des régulateurs associés à la membrane et protège les transcrits présents dans le nucléoïde en évitant des interactions prématurées avec la RNase E. En particulier, garder la RNase E à la membrane est critique pour la spécificité de la RNase E dans le contrôle qualité des ribosomes. Cette association membranaire est une nouvelle couche de régulation qui permet d’expliquer comment la RNase E, une enzyme avec peu de spécificité de séquence et avec beaucoup de substrat, peut remplir les fonctions de «maturase» et de «dégradase». / RNase E in Escherichia coli is an essential endoribonuclease with important roles in stable RNA maturation, in ribosome quality control and in constitutive and regulated mRNA degradation. The Membrane Targeting Sequence (MTS), which forms an amphipathic α-helix, anchors RNase E on the inner cytoplasmic membrane. The absolute conservation of the MTS among -Proteobacteria suggests an important role for RNase E membrane association in RNA metabolism. To elucidate the cellular function of the membrane association of RNase E, we characterized the rne∆MTS strain expressing cytoplasmic RNase E. The results of this study lead us to propose that RNase E membrane association is necessary for RNase E stability, for functional interactions with membrane-associated regulatory factors and for protecting nascent transcripts in the nucleoid from premature interactions with RNase E. In particular, keeping RNase E to the membrane is critical for the specificity of RNase E in ribosome quality control. Membrane association is a new layer of regulation that can explain how RNase E, an enzyme with little sequence specificity and many substrates, can fulfill both ‘maturase’ and ‘degradase’ functions.

Alors que la biogénèse des ribosomes a étéconsidérée comme un mécanisme ubiquiste, lesétapes de ce processus ont récemment étédémontrées comme étant tissu-spécifiques. Letoit optique (OT) du poisson-zèbre est un modèleapproprié pour étudier la prolifération cellulairepuisque les cellules à différents états dedifférenciation se trouvent dans des domainesséparés.Au cours de mon doctorat, j'ai examiné si lesgènes de la biogenèse des ribosomes peuventavoir des rôles spécifiques dans les cellulesprogénitrices neuroépithéliales (CPNe). Profitantd'une analyse transcriptomique antérieure, j'aid'abord examiné les nouveaux candidatsaccumulés dans les CPNe. J'ai décidé de meconcentrer sur proliferation-associated 2G4(pa2G4/ebp1) qui est exprimé de manièrepréférentielle dans les CPNe.Ce gène favorise ou réprime la proliférationcellulaire dans des organismes normaux oupendant la tumorigénèse. J'ai conçu une stratégiepour l'expression inductible et cellule-spécifiquede ce gène.Fibrillarin (Fbl), une méthyltranférasenucléolaire est également préférentiellementexprimée dans CPNe. Ce gène joue un rôleimportant dans le cancer. J'ai montré que lesmutants fbl présentaient des défauts OTspécifiques,en lien avec une apoptose massive etune absence de différenciation neurale. J'aiégalement démontré une diminution de l'activitéde traduction des ribosomes. En outre, lesmutants fbl montrent une progression de la phaseS altérée. Nos données suggèrent que fbl estessentiel à la prolifération des progéniteursneuronaux du poisson-zèbre. / While ribosome biogenesis has been consideredas an ubiquitous mechanism, steps of thisprocess have recently been shown to be tissuespecific. Zebrafish optic tectum (OT) is asuitable model to study cell proliferation sincecells at different differentiation states arespatially partitioned.During my PhD, I examined whether ribosomebiogenesis genes may have specific roles inneuroepithelial progenitor cells (NePCs).Taking advantage of a previous transcriptomicanalysis, I first screened for new candidatesaccumulated in NePCs. I decided to focus onproliferation-associated 2G4 (pa2g4/ebp1),which was expressed preferentially in NePCs.This gene promotes or represses cellproliferation in normal organisms or duringtumorigenesis. I designed a strategy for theinducible expression and cell specificexpression of this gene.Fibrillarin (Fbl), a small nucleolarmethyltransferase is also preferentiallyexpressed in NePCs. It plays an important rolein cancer. I showed that fbl mutants displayedspecific OT defects linked to a massiveapoptosis and an absence of neuraldifferentiation. I also demonstrated deficienciesin the ribosome translational activity.Additionally, fbl mutants showed impaired Sphaseprogression. Our data suggest that fbl isessential for the proliferation of zebrafishneuronal progenitors.

Le contrôle de l'expression des programmes géniques orchestrant le développement précoce et l'homéostasie des cellules souches fait l'objet de recherches intenses. En effet, les cellules souches embryonnaires (CSE) sont caractérisées par des propriétés comme leur clonogénicité (la capacité à proliférer dans le même état indifférencié) et leur pluripotence (la capacité à se différencier et à former les tissus embryonnaires et adultes). Au niveau moléculaire, l'identité des CSE est orchestrée par le contrôle de l'expression génique aux niveaux épigénétique, transcriptionnel, post- transcriptionnel et traductionnel en réponse à l'activation de voies de signalisation spécifiques. Dans ce contexte, des données récentes suggèrent un rôle de la machinerie traductionnelle les ribosomes et de la régulation de leur biogenèse, dans le maintien de l'homéostasie de cellules souches de différentes espèces. À partir de l'analyse de données transcriptomiques à haut débit (RNAseq), mon équipe d'accueil a ainsi identifié un ensemble de protéines associées aux ribosomes (PaR) significativement enrichies dans les cellules souches embryonnaires murines (CSEm) en comparaison à des lignées cellulaires murines différenciées et à des tissus. Parmi ces candidats, mes travaux de thèse ont consisté à la caractérisation d'une PaR particulièrement enrichie : Rsl24d1. Rsl24d1 est une protéine de biogenèse des ribosomes décrites exclusivement chez la levure. Son profil d'expression dans différentes lignées de CSEm suggère une fonction spécifique: enrichissement au niveau transcriptionnel et protéique dans les CSE à l'état de pluripotence naïf et diminution importante au cours de la différenciation. En effet, des approches de perte d'expression de Rsl24d1 m'ont permis d'établir l'importance de cette PaR dans l'homéostasie des CSEm. Rsl24d1 contribue au maintien de la prolifération cellulaire des CSE, de leur clonogénicité et plus modérément à leur pluripotence. Rsl24d1 semble être une protéine majoritairement nucléaire mais également associée aux sous- unités 60S libres des ribosomes cytoplasmiques. D'autre part, la perte d'expression de Rsl24d1 affecte spécifiquement la biogenèse des particules ribosomiques 60S. Ainsi, comme chez la levure, dans les CSEm, Rsl24d1 est un facteur navette orchestrant la maturation des particules ribosomiques pré-60S. Par ailleurs, Rsl24d1 semble permettre le maintien d'un taux de synthèse protéique élevé permettant notamment le renouvellement des protéines ayant une demi-vie courte parmi lesquels on recense des facteurs de transcription de la pluripotence comme Oct4 (Oct3/4), Nanog et Esrrb. Mes travaux de thèse ont donc permis d'identifier et de caractériser un facteur de biogenèse de la sous-unité 60S, Rsl24d1, impliqué dans l'homéostasie des CSEm / Embryonic stem cells (ESC) possess clonogenic and pluripotency abilities i.e. they are able to self-renew indefinitely in the same developpemental state and to differentiate in all the cell types composing embryonic and adult tissues. ESC homeostasis is coordinated by complex networks which are regulated at different levels of gene expression regulation, including epigenetic, transcriptional and post-transcriptional levels. Furthermore, emerging evidences point out that the translational machinery, ribosomes, are directly implicated in the control of adult and embryonic stem cell homeostasis in different model organisms. Along this line, we have identified Rsl24d1, a ribosomal associated protein (RaP), which is strongly expressed in naïve murine ESCs compared to their differentiated progenies. We demonstrated that Rsl24d1 actively contributes to ESC homeostasis and its expression is essential for ESC proliferation and clonogenic capacities. Finally, we have also demonstrated that Rsl24d1, like Rlp24 its yeast ortholog, is associated to pre-ribosomes in ESCs from the nucleus to the cytoplasm and is required for the biogenesis of the large ribosomal subunit

Le complexe Scc2-Scc4 est essentiel pour l’association du complexe cohésine sur l’ADN. Les proteines Cohésine génèrent la cohésion entre les chromatides sœurs, ce qui est essentiel pour la ségrégation des chromosomes. Scc2 (également connu sous le nom NIPBL) est muté chez les patients atteints du syndrome de Cornelia de Lange, une maladie multi-organique caractérisée par des anomalies du développement du visage, de la developpement mental cardiaque et du tractus gastro-intestinal. Comment les mutations localisées au niveau du gène codant pour la proteine Scc2 conduisent à des anomalies du développement chez les patients n’a pas encore été élucidé. Une des hypothèses est que la liaison de Scc2 / cohésine à différentes régions du génome a une incidence sur la transcription. Chez la levure de bière, il a été montre que Scc2 se lie aux genes transcrits par l'ARN Pol III (les ARNt et spliceosomals) , ainsi qu‘aux gènes transcrits par l'ARN Pol II codant pour des petits ARN nucléolaires et nucléaires (snARN et snoARNs ) et des gènes de protéines ribosomiques. Nous rapportons ici que Scc2 est important pour l'expression de ces gènes. Scc2 et le régulateur transcriptionnel Paf1 collaborent pour promouvoir la production de Box H / ACA snoARNs qui guident la pseudouridylation des ARN y compris l'ARN ribosomal. Une mutation de Scc2 a été associée à des défauts dans la production d'ARN ribosomal, la biogenèse des ribosomes, et del’épissage. Alors que le mutant Scc2 n'a pas de défaut général de la synthèse protéique, il montre un déphasage accrue et une réduction de l’utilisation du site interne d'entrée ribosomale (IRES)/ coiffe-indépendante. Ces résultats suggèrent que Scc2 favorise normalement un programme d'expression génétique qui prend en charge la fidélité de la traduction. Nous émettons l'hypothèse que le dysfonctionnement de traduction peut contribuer au syndrome de Cornelia de Lange, qui est causé par des mutations dans Scc2. / The Scc2-Scc4 complex is essential for loading the cohesin complex onto DNA. Cohesin generates cohesion between sister chromatids, which is critical for chromosome segregation. Scc2 (also known as NIPBL) is mutated in patients with Cornelia de Lange syndrome, a multi-organ disease characterized by developmental defects in head, limb, cognition, heart, and the gastrointestinal tract. How mutations in Scc2 lead to developmental defects in patients is yet to be elucidated. One hypothesis is that the binding of Scc2/cohesin to different regions of the genome will affect transcription. In budding yeast, Scc2 has been shown to bind to RNA Pol III transcribed genes (tRNAs, and spliceosomal), as well as RNA Pol II-transcribed genes encoding small nuclear and nucleolar RNAs (snRNAs and snoRNAs) and ribosomal protein genes. Here, we report that Scc2 is important for gene expression. Scc2 and the transcriptional regulator Paf1 collaborate to promote the production of Box H/ACA snoRNAs which guide pseudouridylation of RNAs including ribosomal RNA. Mutation of Scc2 was associated with defects in the production of ribosomal RNA, ribosome biogenesis, and splicing. While the scc2 mutant does not have a general defect in protein synthesis, it shows increased frameshifting and reduced internal ribosomal entry site (IRES) usage/cap-independent translation. These findings suggest Scc2 normally promotes a gene expression program that supports translational fidelity. We hypothesize that translational dysfunction may contribute to the human disorder Cornelia de Lange syndrome, which is caused by mutations in Scc2.

Les cellules cancéreuses produisent une grande quantité de ribosomes afin de synthétiser les protéines nécessaires à leur prolifération rapide. Les mécanismes qui conduisent à cette augmentation de la production de ribosome ne sont que partiellement compris, mais ils semblent intimement liés à l'acquisition du phénotype tumoral. De plus, une nouvelle théorie propose que les ribosomes ne sont pas des effecteurs neutres de la traduction, mais qu'ils jouent un rôle direct dans la régulation de l'expression génique. Cette théorie se base sur l'observation que la composition des ribosomes est hétérogène en fonction des types cellulaires et des conditions environnementales. Dans ce contexte, j'ai étudié les liens entre les altérations des signaux qui contrôlent la biogenèse des ribosomes, tant au niveau quantitatif que qualitatif, et le développement du phénotype tumoral. Ce manuscrit rapporte trois études effectuées au cours de mon travail de thèse. Ces études ont permis d'identifier : i) un nouveau régulateur de la quantité de ribosomes, la LN-Nétrine-1 et ii) des modifications de la composition et de la fonction des ribosomes induites par des altérations génétiques (perte d'activité de p53) et par l'utilisation d'une molécule chimiothérapeutique, le 5- Fluorouracile. Ces perturbations de la quantité et de la fonction des ribosomes modifient le contrôle de la traduction des cellules et la croissance, la prolifération et la survie cellulaire. Il ressort de ces résultats que les ribosomes sont des éléments qui participent au contrôle de l'expression génique et qui jouent un rôle dans la pathologie cancéreuse et la réponse au traitement chimiothérapeutique / Cancer cells produce large amounts of ribosomes to synthesize the proteins required for their rapid proliferation. The mechanisms leading to this increase in ribosome production are only partly understood, but they are related to the acquisition of the tumor phenotype. In addition, a new theory proposes that ribosomes are not neutral effectors of translation, but have a direct role in the regulation of gene expression. This theory is based on the observation that ribosome composition is heterogeneous in different cell types and according to environmental conditions. In this context, I have analyzed the relationships between changes in signals that control ribosome biogenesis, both quantitatively and qualitatively, and the development of the tumor phenotype. This manuscript reports three studies made during this PhD program. These studies identified: i) a novel regulator of the amount of ribosomes, the LN-Netrin-1 and ii) changes in the ribosome composition and function induced by genetic alterations (loss of activity of p53) and by the use of a chemotherapeutic molecule, the 5-Fluorouracil. These perturbations of the amount and the function of ribosomes modify the translation control and cell growth, cell proliferation and cell survival. From these results it can be conclude that ribosomes are elements involved in the regulation of gene expression and play a role in cancer pathology and response to chemotherapy

La biogenèse des ribosomes eucaryotes est un processus complexe qui implique la production et l'assemblage de 4 ARNr et 80 protéines. La production des deux sous-unités du ribosome, 40S et 60S, débute dans le nucléole par la synthèse d'un long précurseur commun contenant les séquences des ARNr matures et se termine dans le cytoplasme où ont lieu les dernières étapes d'assemblage des protéines ribosomiques et de clivage des ARNr. La production de ribosomes nécessite la participation de plus de 200 co-facteurs, qui catalysent les clivages et modifications des ARNr, coordonnent leur repliement et leur association aux protéines ribosomiques, et assurent des étapes de contrôle-qualité. Ces protéines sont associées aux particules en cours de maturation et absentes des sous-unités matures. Cette voie de synthèse, globalement conservée chez les eucaryotes, a été principalement étudiée chez la levure. Cependant, des études récentes ont montré des différences importantes de ce processus entre levure et mammifères. Un des verrous importants pour comprendre la fonction des co-facteurs, est l'absence de données sur la structure des précurseurs des sous-unités ribosomiques. J'ai donc entrepris une étude structurale de l'assemblage cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomique chez l'homme par cryo-microscopie électronique à transmission. Le but de ma thèse était de déterminer la structure 3D des précurseurs de la petite sous-unité ribosomique purifiés à différentes étape de leur maturation. Ce travail a été conduit en collaboration avec l'équipe du Pr. Ulrike Kutay (ETH Zurich) pour la purification des particules pré-40S à partir de cellules humaines. La première structure 3D de particule pré-40S intermédiaire purifiée en étiquetant le co-facteur LTV1 a été déterminée à 19Å de résolution. Dans un deuxième temps, la structure 3D de la particule pré-40S tardive purifiée à via RIO1(KD) a aussi été déterminée à 15Å de résolution. Ces données nous ont permis de proposer un modèle de localisation des co-facteurs sur les précurseurs de la petite sous-unité ribosomique et de montrer une nouvelle différence dans la formation de la petite sous-unité chez l'Homme comparé à la levure, du fait de la présence de la protéine RACK1 sur les particules pré-40S humaines. La comparaison des structures des précurseurs de la petite sous-unité obtenues a permis de mettre en lumière l'existence de remodelages structuraux de la particule pré-40S au cours de sa maturation. Ce travail met en lumière les premières structures 3D de particules pré-40S humaines et pose les fondements méthodologiques d'explorations futures de la dynamique structurale des particules pré-ribosomiques. / Ribosome biogenesis is a complex process that requires the production and the correct assembly of the 4 rRNAs with 80 ribosomal proteins. In Human, the production of the two subunits, 40S and 60S, is initiated by the transcription of a pre-ribosomal rRNA precursor to the mature 18S, 5.8S, and 28S rRNAs by the RNA polymerase I, which is chemically modified and trimmed by endo- and exoribonuclease, in order to form the mature rRNAs. The nascent pre rRNA associated with ribosomal proteins, small ribonucleoprotein particles (snoRNP) and so called co-factors leading to the assembly of an initial 90S particle. This particle is then split into pre-40S and pre-60S pre-ribosomal particles that fallow independent maturation to form the mature subunit into the cytoplasm. Production of eukaryotic ribosomes implies the transient intervention of more than 200 associated proteins and ribonucleoprotein particles, that are absent from the mature subunits. Synthesis of ribosome, globally conserved in eukaryotes, has been principally studied in yeast. However, recent studies reveal that this process is more complex in human compared in yeast. An important bottleneck in this domain is the lack of structural data concerning the formation of intermediate ribosomal subunits to understand the function of assembly factors. Determination of the structural remodeling of pre-ribosomal particles is crucial to understand the molecular mechanism of this complex process. So I have undertaken a structural study on the assembly of the small ribosomal subunit using cryo-electron microscopy and image analysis. The goal of my thesis is to determine the 3D structures of human pre-40S particles at different maturation stages to see the structural remodeling that occurs during the biogenesis of the small ribosomal subunit. We are collaborating with the group of Pr Ulrike Kutay at ETH Zurich, who purify human pre-40S particles. The 3D structures of human pre-40S particles purified at an intermediate and late maturation stages, has been determined with a resolution of 19 and 15Å respectively. Supplementary densities, compared to the mature subunit, indicate the presence of assembly factors and show the unexpected presence of the RACK1 protein in the precursor of the human small ribosomal subunit in the cytoplasm. The comparison of the 3D structures of human pre-40S particle allows showing the structural remodeling that occur during the maturation of the small ribosomal subunit. This work provides the first 3D structure of human pre-40S particles and laid the methodological foundations for future exploration of the structural dynamics of pre-ribosomal particles.