La découverte de l’ARN interférence et des micro-ARN a permis de définir un principe majeur de régulation de l’expression des gènes, et a produit de nouveaux outils pour la médecine. Chez les mammifères, l’étude des fonctions des micro-ARN a été restreinte au cytoplasme, bien qu’ils soient aussi présents dans le noyau.Cette thèse présente une série d’expériences visant à caractériser les facteurs moléculaires requis pour l’activité nucléaire des micro-ARN. Nous avons débuté ce projet en explorant les partenaires ARN-dépendant de la protéine AGO2 par immunoprécipitation et spectrométrie de masse quantitative. Parmi les interactants ARN-dépendants, nous nous sommes concentrés sur trois protéines nucléaires abondantes : SFPQ, PSPC1 et NONO qui forment la famille drosophila behavior and human splicing (DBHS). Nous avons démontré que le complexe RISC nucléoplasmique est associé aux protéines SFPQ, PSPC1 et NONO dans plusieurs lignées cellulaires murines et humaines, d’une manière qui dépend de SFPQ. Des expériences de type HITS-CLIP de la protéine AGO2 et/ou de la protéine SFPQ dans des cellules souches nous ont permis de montrer que SFPQ se lie préférentiellement aux 3’UTR longs en utilisant deux motifs spécifiques. En effet, SFPQ contrôle significativement environ 20% de l’activité de liaison de AGO2, ce qui est répercuté au niveau transcriptomique. Cependant, cette activité concerne uniquement les sites de liaison de SFPQ proches (<500 nucléotides) de AGO2. De plus, nous avons observé que cette régulation s’étend aux ARNm cytoplasmiques. Ce résultat suggère que la liaison et l’agrégation de la protéine SFPQ à l’ARN programme la structure du 3’UTR et donc les possibilités de ciblage par les miARN dans le noyau, et ceci d’une manière qui semble préservée dans le cytoplasme. Enfin, nous avons montré en particulier que l’expression de SFPQ contrôle le programme de ciblage par let-7a, et module la transition des cellules souches vers l’état différencié.
Ces résultats contribuent à la diversité des mécanismes de régulation de l’activité des miARN. Dans la deuxième partie du projet, nous avons exploré les partenaires ARN-indépendant de la protéine nucléaire AGO2. Nous avons découvert que la protéine AGO2 interagit avec le complexe CCR4-NOT1 et l’exosome nucléaire d’une manière indépendante de l’ARN. Nous proposons une série d’expériences visant à confirmer ces résultats. Brièvement, l’hypothèse de travail qui semble la plus cohérente avec les données actuelles est la liaison directe de l’exosome au module CNOT2-CNOT3 du complexe CCR4-NOT1. Ce modèle permettrait d’expliquer le mécanisme d’extinction des gènes par les miARN nucléaires qui reposerait donc sur leur interaction avec les complexes CCR4-NOT1 et exosome. Son mode opératoire comprendrait des protéines de liaison à l’ARN et des micro-ARN pour sélectionner les cibles. / The discovery of RNA interference and micro-RNA has unravelled a fundamental principle of gene expression regulation, and has produced new tools for medicine. In mammals, the study of micro-RNA functions have been confined to the cytoplasm, although there is a growing body of evidence about their presence in the nucleus.This thesis present a set of experiments directed towards understanding the molecular factors required for nuclear miRNA activity.We started this project by exploring the RNA-dependent interactors of AGO2 by immunoprecipitation followed by quantitative mass spectrometry analysis. We focused on three partners: SFPQ, PSPC1 and NONO which are abundant nuclear proteins and belong to the DBHS family (drosophila behavior and human splicing). We demonstrated that the nucleoplasmic RISC complex associates with DBHS proteins in multiple murine and human cell lines in an SFPQ-dependent manner.HITS-CLIP experiments of AGO2 and SFPQ proteins in mouse embryonic stem cells showed that SFPQ preferentially binds long 3’UTR using two specific motifs. Using these motifs, SFPQ significantly controls about 20% of local AGO2 binding activity and target mRNA stability as we observe by transcriptomic analysis. SFPQ mode of action appears to be local and SFPQ motifs are functional only when proximal to AGO2 binding sites in a window of 500 nucleotides.Moreover, although SFPQ is only nuclear, we observe that SFPQ has an effect on cytoplasmic mRNAs, which suggests that SFPQ binding and aggregation to mRNA in the nucleus programs the 3’UTR for miRNA targeting, in a way that appears preserved in the cytoplasm.In particular, we found that SFPQ controls let-7 targeting program and modulates embryonic stem cell differentiation into neuron cells.These results contribute to expand the diversity of miRNA regulatory mechanisms.In the second part of the project, we explored the RNA-independent interactors of AGO2. We discovered that nuclear AGO2 interacts with CCR4-NOT1 complex and the RNA exosome in an RNA-independent manner.We propose a set of experiments to confirm these results, based on a new working model. Briefly, the most likely hypothesis to explain the current data is the direct binding of RNA exosome to the CNOT2-CNOT3 module of CCR4-NOT1 complex.This model would explain the silencing mechanism of genes by nuclear miRNAs, whose activity would depend on the RISC complex interaction with CCR4-NOT1 complex and RNA exosome.Hence, the RNA exosome would use both RNA binding proteins and miRNAs to select targets for degradation, based on CCR4-NOT1 mode of action.

La RNase E chez Escherichia coli est une endoribonucléase essentielle qui joue un rôle important dans la maturation des ARN stables, dans le contrôle qualité des ribosomes, ainsi que dans la dégradation constitutive et régulée des ARN messagers. La séquence de ciblage à la membrane (MTS pour Membrane Targeting Sequence), qui forme une hélice α-amphipatique, ancre la RNase E à la membrane cytoplasmique interne des cellules. La conservation absolue du MTS chez l'ensemble des -protéobactéries suggère un rôle important de la localisation membranaire RNase E dans le métabolisme de l'ARN. Pour élucider la fonction cellulaire de l'association membranaire de la RNase E, nous avons caractérisé la souche rne∆MTS qui exprime une RNase E cytoplasmique. Les résultats de cette étude nous amènent à proposer que l'association membranaire de la RNase E est nécessaire à la stabilité de la RNase E, est impliquée dans des interactions fonctionnelles avec des régulateurs associés à la membrane et protège les transcrits présents dans le nucléoïde en évitant des interactions prématurées avec la RNase E. En particulier, garder la RNase E à la membrane est critique pour la spécificité de la RNase E dans le contrôle qualité des ribosomes. Cette association membranaire est une nouvelle couche de régulation qui permet d’expliquer comment la RNase E, une enzyme avec peu de spécificité de séquence et avec beaucoup de substrat, peut remplir les fonctions de «maturase» et de «dégradase». / RNase E in Escherichia coli is an essential endoribonuclease with important roles in stable RNA maturation, in ribosome quality control and in constitutive and regulated mRNA degradation. The Membrane Targeting Sequence (MTS), which forms an amphipathic α-helix, anchors RNase E on the inner cytoplasmic membrane. The absolute conservation of the MTS among -Proteobacteria suggests an important role for RNase E membrane association in RNA metabolism. To elucidate the cellular function of the membrane association of RNase E, we characterized the rne∆MTS strain expressing cytoplasmic RNase E. The results of this study lead us to propose that RNase E membrane association is necessary for RNase E stability, for functional interactions with membrane-associated regulatory factors and for protecting nascent transcripts in the nucleoid from premature interactions with RNase E. In particular, keeping RNase E to the membrane is critical for the specificity of RNase E in ribosome quality control. Membrane association is a new layer of regulation that can explain how RNase E, an enzyme with little sequence specificity and many substrates, can fulfill both ‘maturase’ and ‘degradase’ functions.

Les ribonucléases et les hélicases à ARN sont des acteurs clé du métabolisme des ARN et jouent donc des rôles cruciaux pour la régulation de l'expression des gènes. Peu de données sont connues concernant ce métabolisme chez les Archées, le troisième domaine du vivant. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse s'intéresse au métabolisme de l'ARN chez les archées et plus particulièrement aux ribonucléases ß-CASP. Dans ce contexte, nous focalisons nos études sur la compréhension physiologique que pourrait jouer les ribonucléases ß-CASP aCPSF1 et aRNase J, orthologue respectivement du facteur de terminaison de la transcription eucaryotes CPSF-73 et RNase J bactérienne. Par analogie avec CPSF-73 et RNase J, qui font partie de complexes multi-protéiques, des indices sur les fonctions des homologues archéens de ces ribonucléases pourraient provenir de l'identification des complexes autour de aCPSF1 et aRNase J. Utilisant des extraits de Pyrococcus abyssi et les protéines recombinantes aCPSF1 et aRNase J comme appâts, nous avons identifié que aRNase J fait partie d'un réseau d'interaction incluant une hélicase de la famille des Ski2-like (ASH-Ski2). En parallèle, des fractionnements d'extrait de P. abyssi sur gradient de saccharose par ultracentrifugation indiquent que aRNase J et ASH-Ski2 sont présentes toutes deux dans les fractions de haut poids moléculaires avec les sous-unités du ribosome et ceux de l'exosome. Nous avons aussi démontré une interaction stable entre aRNase J et ASH-Ski2 ainsi que des motifs impliquées dans cette interaction par des expériences de co- purification par chromatographie d'affinité. De plus, les caractérisations biochimiques de ASH-Ski2 indiquent que cette protéine possède une activité d'hydrolyse de l'ATP dépendant de la présence d'acides nucléiques. ASH-Ski2 possède de plus la capacité d'hybridation et de déroulement de deux brins d'acides nucléiques en présence d'ATP. A notre connaissance, nos résultats sont les premiers à indiquer un complexe contenant une ribonucléase et d'une hélicase à ARN Ski2-like chez les archées. De manière intriguent, aRNase J est orthologue de la RNase J bactérienne et ASH-Ski2 des hélicases Ski2-like des eucaryotes. Cela démontre que les Archées pourraient posséder un système composite impliqué dans le métabolisme des ARN partageant des caractéristiques bactériens et eucaryotes. Ces résultats mettent en lumière l'avantage de l'étude des Archées pour la compréhension des mécanismes moléculaires et évolutives des processus fondamentaux des trois domaines du vivant. / Ribonucleases and RNA helicases are the main actors of RNA processing and have a critical role in gene expression regulation. Little is known about this process in Archaea. Our group focuses in RNA metabolism in Archaea involving ß-CASP ribonucleases. Recently, we published phylogenomic and experimental work demonstrating that archaeal ß-CASP proteins, aCFSF1 and aRNase J, are highly conserved ribonucleases in Archaea. Archaeal aCPSF1, an ortholog of the eukaryal transcription termination factor CPSF73, is ubiquitous in Archaea suggesting an essential conserved function. Archaeal aRNase J, an ortholog of the bacterial ribonuclease RNase J, is conserved through a major phylum of the Archaea, the Euryarchaeota. These findings suggest that the role of these enzymes in RNA processing can be reminiscent of ancient functions that had arisen early in evolution. We now want to focus on understanding the physiological role of aCPSF1 and aRNase J with the hyperthermophilic euryarchaeal Pyrococcus abyssi as model. By analogy to eukaryal CPSF73 and bacterial RNase J, which are part of multiprotein complexes, clues to the function of the archaeal ß-CASP homologs might come from the identification of archaeal multiprotein complex(es) containing aCPSF1 and aRNase J orthologs. Using P. abyssi cell extracts and recombinant aCPSF1 or aRNase J as bait, we have found that aRNase J is a part of protein interaction networks that include Ski2-like RNA helicase (ASH-Ski2). In parallel, fractionation of P. abyssi whole cell extracts in sucrose gradient by ultracentrifugation shows that aRNase J and ASH-Ski2 are present in high sedimentation fractions with ribosomal and exosome sub-units. We also demonstrate a direct interaction of aRNase J with ASH-Ski2 by co-purification affinity chromatography experiments and identify motifs that potentially involve in this interaction. Biochemical characterization of ASH-Ski2 demonstrates a nucleic dependant ATPase activity. ASH-Ski2 also possesses annealing and unwinding activities in presence of ATP. To our knowledge, our results are the first experimental indications of interacting of a complex containing ribonuclease and RNA helicase-like proteins in Archaea. Remarkably, aRNase J is an orthologue of the bacterial RNase J and ASH-Ski2 is an orthologue of the eukaryotic Ski2-like family proteins. This shows that Archaea might possess a composite RNA processing system sharing both eukaryal and bacterial features. This highlights the advantage of an archaeal model to gain further mechanistic and evolutionary information of fundamental processes across the three domains of life.

La régulation de l’expression génique par des ARNs permet une réponse rapide et polyvalente des cellules à des changements environnementaux. Cependant, elle nécessite souvent des partenaires protéiques. La protéine bactérienne Hfq en est un bon exemple. Facteur de virulence, elle est présente chez une variété de procaryotes et intervient dans nombre de circuits de régulation. Structurellement, Hfq adopte un repliement caractéristique, le repliement Sm. Ainsi, Les feuillets β qui la constituent se regroupent et forment un hexamère toroïdal. Outre cette région N-terminale, il existe aussi parfois une région C-terminale (CTR) de séquence et de longueur variables. Chez E. coli, cette région comprend une trentaine de résidus et est prédite comme non-structurée. Jusqu’à présent, son rôle n’a été que peu étudié.Ce travail de thèse met en lumière de nouvelles pistes quant à la fonction du CTR. Nous avons constaté sa capacité à former des fibres amyloïdes, expliquant la formation de structures auto-assemblées in vivo. De plus, la protéine est capable de lier l’ADN et de le condenser fortement in vitro. Cette compaction est complètement dépendante de la présence du CTR, qui permet de ponter les brins d’ADN. Ce résultat suggère une nouvelle fonction de Hfq dans la structuration du chromosome. Enfin, nous avons démontré que ce domaine permet aussi à Hfq de s’assembler à la surface d’une bicouche lipidique, expliquant sa localisation membranaire. La désorganisation de la membrane qui en résulte pourrait permettre le passage d’ARNs dans le milieu extracellulaire, avec d’importantes implications sur la capacité de la bactérie à interagir avec ses voisines et son environnement. / RNA-based regulations of gene expression allow quick and versatile responses from cells to changing environmental conditions. However, these regulations are often protein-mediated. The bacterial protein Hfq is one of the most studied RNA-based regulation partner. Found in various prokaryotes, it is an important virulence factor involved in many cellular processes. Hfq’s structure resembles a torus, formed by multiple β-sheets. Apart from this N-terminal region (NTR), a supplemental C-terminal region (CTR) with variable lengths and sequences may exist in some species. In E. coli, this specific region measures around 30 residues and is predicted as intrinsically disordered. Few studies focused on Hfq-CTR until recently.This work highlights new potential roles for Hfq-CTR. First, this region is able to self-interact and forms amyloid fibers which explains the self-assembled Hfq superstructures observed in vivo. Second, the protein can bind and efficiently condense DNA in vitro, strengthening the suggested role of Hfq in shaping the bacterial chromosome. This compaction is fully dependent on the CTR which is responsible for DNA bridging. Third, the CTR also gives to Hfq the ability to self-assemble on a lipid bilayer, explaining its membrane-localized fraction observed in vivo. The subsequent membrane reorganization might facilitate the release of RNAs in the extracellular medium, with potential implications on bacterial communication and interaction with surrounding cells and environment.