Les ribonucléases et les hélicases à ARN sont des acteurs clé du métabolisme des ARN et jouent donc des rôles cruciaux pour la régulation de l'expression des gènes. Peu de données sont connues concernant ce métabolisme chez les Archées, le troisième domaine du vivant. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse s'intéresse au métabolisme de l'ARN chez les archées et plus particulièrement aux ribonucléases ß-CASP. Dans ce contexte, nous focalisons nos études sur la compréhension physiologique que pourrait jouer les ribonucléases ß-CASP aCPSF1 et aRNase J, orthologue respectivement du facteur de terminaison de la transcription eucaryotes CPSF-73 et RNase J bactérienne. Par analogie avec CPSF-73 et RNase J, qui font partie de complexes multi-protéiques, des indices sur les fonctions des homologues archéens de ces ribonucléases pourraient provenir de l'identification des complexes autour de aCPSF1 et aRNase J. Utilisant des extraits de Pyrococcus abyssi et les protéines recombinantes aCPSF1 et aRNase J comme appâts, nous avons identifié que aRNase J fait partie d'un réseau d'interaction incluant une hélicase de la famille des Ski2-like (ASH-Ski2). En parallèle, des fractionnements d'extrait de P. abyssi sur gradient de saccharose par ultracentrifugation indiquent que aRNase J et ASH-Ski2 sont présentes toutes deux dans les fractions de haut poids moléculaires avec les sous-unités du ribosome et ceux de l'exosome. Nous avons aussi démontré une interaction stable entre aRNase J et ASH-Ski2 ainsi que des motifs impliquées dans cette interaction par des expériences de co- purification par chromatographie d'affinité. De plus, les caractérisations biochimiques de ASH-Ski2 indiquent que cette protéine possède une activité d'hydrolyse de l'ATP dépendant de la présence d'acides nucléiques. ASH-Ski2 possède de plus la capacité d'hybridation et de déroulement de deux brins d'acides nucléiques en présence d'ATP. A notre connaissance, nos résultats sont les premiers à indiquer un complexe contenant une ribonucléase et d'une hélicase à ARN Ski2-like chez les archées. De manière intriguent, aRNase J est orthologue de la RNase J bactérienne et ASH-Ski2 des hélicases Ski2-like des eucaryotes. Cela démontre que les Archées pourraient posséder un système composite impliqué dans le métabolisme des ARN partageant des caractéristiques bactériens et eucaryotes. Ces résultats mettent en lumière l'avantage de l'étude des Archées pour la compréhension des mécanismes moléculaires et évolutives des processus fondamentaux des trois domaines du vivant. / Ribonucleases and RNA helicases are the main actors of RNA processing and have a critical role in gene expression regulation. Little is known about this process in Archaea. Our group focuses in RNA metabolism in Archaea involving ß-CASP ribonucleases. Recently, we published phylogenomic and experimental work demonstrating that archaeal ß-CASP proteins, aCFSF1 and aRNase J, are highly conserved ribonucleases in Archaea. Archaeal aCPSF1, an ortholog of the eukaryal transcription termination factor CPSF73, is ubiquitous in Archaea suggesting an essential conserved function. Archaeal aRNase J, an ortholog of the bacterial ribonuclease RNase J, is conserved through a major phylum of the Archaea, the Euryarchaeota. These findings suggest that the role of these enzymes in RNA processing can be reminiscent of ancient functions that had arisen early in evolution. We now want to focus on understanding the physiological role of aCPSF1 and aRNase J with the hyperthermophilic euryarchaeal Pyrococcus abyssi as model. By analogy to eukaryal CPSF73 and bacterial RNase J, which are part of multiprotein complexes, clues to the function of the archaeal ß-CASP homologs might come from the identification of archaeal multiprotein complex(es) containing aCPSF1 and aRNase J orthologs. Using P. abyssi cell extracts and recombinant aCPSF1 or aRNase J as bait, we have found that aRNase J is a part of protein interaction networks that include Ski2-like RNA helicase (ASH-Ski2). In parallel, fractionation of P. abyssi whole cell extracts in sucrose gradient by ultracentrifugation shows that aRNase J and ASH-Ski2 are present in high sedimentation fractions with ribosomal and exosome sub-units. We also demonstrate a direct interaction of aRNase J with ASH-Ski2 by co-purification affinity chromatography experiments and identify motifs that potentially involve in this interaction. Biochemical characterization of ASH-Ski2 demonstrates a nucleic dependant ATPase activity. ASH-Ski2 also possesses annealing and unwinding activities in presence of ATP. To our knowledge, our results are the first experimental indications of interacting of a complex containing ribonuclease and RNA helicase-like proteins in Archaea. Remarkably, aRNase J is an orthologue of the bacterial RNase J and ASH-Ski2 is an orthologue of the eukaryotic Ski2-like family proteins. This shows that Archaea might possess a composite RNA processing system sharing both eukaryal and bacterial features. This highlights the advantage of an archaeal model to gain further mechanistic and evolutionary information of fundamental processes across the three domains of life.

Le complexe Arp2/3, conservé sur le plan évolutif, joue un rôle central dans la nucléation d’actine branchée, qui entraîne la migration cellulaire, l’endocytose et d’autres processus cellulaire. Récemment, une petite protéine, Arpin, qui inhibe le complexe Arp2/3 au front du lamellipode a été découverte et caractérisée. Sur sa partie C-terminale, Arpin possède un motif acide (A), qui est homologue au motif A des différents NPF (Nucleation Promoting Factor). Il a été prédit qu’Arpin peut se lier à deux sites de liaison au complexe Arp2/3, similaire aux domaines VCA des NPF. Ici, nous utilisons la microscopie électronique de particules uniques pour obtenir une reconstruction 3D du complexe Arp2/3 lié à Arpin, à une résolution de 25 Å. Nous avons montré que la liaison d’Arpin induit la conformation ouverte, standard, du complexe Arp2/3. Nous avons confirmé qu’il y a deux sites de liaison sur le complexe Arp2/3 pour Arpin : un à l’arrière de la sous-unité Arp3, et le second localisé entre les sous-unités Arp2 et ARPC1. La distance entre le complexe Arp2/3 et Arpin (5nm) confirme qu’Arpin interagit avec son partenaire via sa queue acide C-terminale non structurée.Nous avons, ensuite, identifié Tankyrases1/2, comme un nouveau partenaire qui se lie à Arpin, par « pull-down ». De façon intéressante, les sites de liaisons d’Arpin aux Tankyrases et à Arp2/3 se chevauchent. Nous avons, par conséquent, démontré qu’il y a une compétition dose-dépendante entre le domaine ARC4 de Tankyrase1 et le complexe Arp2/3.Pour comprendre les principes de l’interaction entre Arpin et Tankyrases, nous avons créé un mutant d’Arpin (ArpinG218D) qui, in vitro, se lie toujours au complexe Arp2/3, mais plus aux Tankyrases. In vivo, ArpinG218D n’est pas capable d’inhiber le complexe Arp2/3, ce qui suggère que Tankyrase pourrait être nécessaire pour l’interaction entre Arpin et le complexe Arp2/3. Arpin est le facteur responsable du changement de direction des cellules migrantes. Nous avons donc analysé, la migration de cellules MCF10A exprimant soit la forme sauvage d’Arpin (ArpinWT) soit son mutant ArpinG218D en parallèle de la déplétion d’Arpin endogène. Les cellules exprimant ArpinG218D ont une persistance de migration supérieure, similaire à celles déplétées d’Arpin endogène. Nous avons, ainsi, fait l’hypothèse que le mutant ArpinG218D ne peut pas inactiver le complexe Arp2/3 car il n’est pas présent au niveau du lamellipode. Nous avons donc comparé la quantité de protéine d’ArpinWT et d’ArpinG218D dans la fraction membranaire de cellules migrantes. Une différence significative (44%) dans la quantité d’ArpinWT et d’ArpinG218D a confirmé notre hypothèse.Les Tankyrases sont des cibles thérapeutiques dans de nombreux cancers, mais il n’existe pas de modèle structural pour ces protéines grandes et flexibles. Dans ce travail, nous avons, pour la première fois, obtenu deux reconstructions 3D de Tankyrase1 et Tankyrase2 complètes liées à Arpin en utilisant la microscopie électronique de particules uniques. La résolution obtenue (27 Å) a été suffisante pour détecter un changement de conformation dramatique des domaines SAM et PARP de Tankyrase après fixation d’Arpin. Dans notre reconstruction, trois molécules d’Arpin se lient aux domaines ARC1, ARC4 et ARC5 de Tankyrase1. ARC5 a été montré pour être la partie le plus flexible de l’ensemble des domaines ARC.Grâce aux données que nous avons obtenues, nous avons suggéré un modèle de régulation de l’activité d’Arpin par les Tankyrases. Selon notre modèle, les Tankyrases se lient à Arpin dans le cytoplasme, changent sa conformation et amènent Arpin au niveau de la membrane dans le lamellipode. Traduisant les signaux extracellulaires, la GTPase Rac active Arpin, qui séquentiellement inactive le complexe Arp2/3, tandis que les Tankyrases sont libérées. / The evolutionarily conserved Arp2/3 complex plays a central role in nucleating the branched actin filament arrays that drive cell migration, endocytosis, and other processes. Recently, an inactivator of the Arp2/3 complex at the lamellipodium tip, a small protein, Arpin, was discovered and characterized. On its C-terminus, Arpin possesses an acidic (A) motif, which is homologous to the A-motif of various Nucleation Promoting Factors (NPFs). It was predicted that Arpin can bind at two binding sites to the Arp2/3 complex, similar to VCA domains of NPFs. Here, we used single particle electron microscopy to obtain a 3D reconstruction of the Arp2/3 complex bound to Arpin at a 25Å resolution. We showed that the binding of Arpin causes the standard open conformational of the Arp2/3 complex. We confirmed that there are two binding sites on the Arp2/3 complex for Arpin: one on the back of the Arp3 subunit, and the second is located between Arp2 and ARPC1 subunits. The distance between the Arp2/3 complex and Arpin (5 nm) supports the view that Arpin interacts with its partner via its unstructured C-terminal acidic tail.Next, using the pull-down assay, we identified the new Arpin binding partners, Tankyrases1/2. Interestingly, Tankyrases and the Arp2/3 complex possess overlapping amino acid sequences at Arpin binding sites. Hence, we demonstrated a competition between the ARC4 domain of Tankyrase1 and the Arp2/3 complex in a dose-dependent manner.To understand the principles of Tankyrases-Arpin interaction, we created a mutant Arpin (ArpinG218D) that lacks its ability to interact with Tankyrases, but not with the Arp2/3 complex in vitro. Interestingly, ArpinG218D was not able to inhibit the Arp2/3 complex in vivo, suggesting that Tankyrase may be necessary for Arpin-Arp2/3 complex interaction. Arpin is the turning factor of migrating cells, so we performed a migration analysis of MCF10-A cells expressing either wild type Arpin (ArpinWT) or mutant ArpinG218D in parallel with the depletion of endogenous Arpin. Cells expressing ArpinG218D had higher directional persistence, similar to the cells where the endogenous Arpin was knocked down. Thus, we suggested that mutant ArpinG218D cannot inactivate the Arp2/3 complex since it is not present at the lamellipodial tip. We compared the amount of protein for both ArpinWT and ArpinG218D in the membrane fraction of the migrating cells. A significant difference (44%) in the amount of ArpinWT and Arpin G218D was consistent with our hypothesis.Tankyrases are therapeutic targets in a variety of cancers, but currently there is no structural model available for these large and flexible proteins. In this work, we obtained for the first time two 3D reconstructions of full-length Tankyrase1 and Tankyrase1 bound to Arpin using single particle electron microscopy. The achieved resolution (27Å) was enough to detect a dramatic conformational change in Tankyrase SAM and PARP domains upon binding of Arpin molecules. In our reconstruction, three Arpins were bound to the ARC1, ARC4 and ARC5 domains of Tankyrase1. ARC5 was shown to be the most flexible part of the ARC cluster.Based on the obtained data, we suggested a model of regulation of the activity of Arpin by Tankyrases. According to our model, Tankyrases bind Arpin in the cytoplasm, change their conformational state and bring Arpin closer to the membrane in the lamellipodia. Deciphering the extracellular signals, Rac GTPase activates Arpin, which sequentially inactivates the Arp2/3 complex, while Tankyrases are released.

Chez les eucaryotes pluricellulaires, la différenciation des cellules repose en partie sur l'activation oula répression des gènes. Les profils d'expression génique mis en place vont perdurer d'une générationcellulaire à l'autre. Ce phénomène met en jeu des mécanismes épigénétiques qui remodèlentlocalement la structure de la chromatine. Chez Drosophila melanogaster, les protéines des groupesPolycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) participent au maintien du profil d'expression des gènes au coursdu développement. Les protéines PcG maintiennent les gènes réprimés tandis que les protéines TrxGmaintiennent les gènes activés. Une troisième classe de protéines nommée Enhancers of Trithoraxand Polycomb (ETP) module l'activité des PcG et TrxG. Dorsal Switch Protein 1 (DSP1) est uneprotéine HMGB (High Mobility Group B) classée comme une ETP. Par tamisage moléculaire, nousavions montré que la protéine DSP1 était présente au sein de complexes de poids moléculaire de 100kDa à 1 MDa. Le travail de thèse présenté ici a pour but d'identifier les partenaires de la protéineDSP1 dans l'embryon et de mieux connaître les propriétés biochimiques de DSP1. Premièrement, j'aimis en place puis effectué l'immunopurification des complexes contenant DSP1 dans des extraitsprotéiques embryonnaires. Cette approche nous a permis d'identifier 23 partenaires putatifs de laprotéine DSP1. Parmi ces protéines, nous avons identifié la protéine Rm62 qui est une ARN hélicaseà boîte DEAD. Les relations biologiques entre DSP1 et Rm62 ont été précisées. Deuxièmement, j'aidéterminé, par une approche biochimique, de nouvelles caractéristiques physico-chimiques de laprotéine DSP1.

Chez les eucaryotes pluricellulaires, la différenciation des cellules repose en partie sur l’activation oula répression des gènes. Les profils d’expression génique mis en place vont perdurer d’une générationcellulaire à l’autre. Ce phénomène met en jeu des mécanismes épigénétiques qui remodèlentlocalement la structure de la chromatine. Chez Drosophila melanogaster, les protéines des groupesPolycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) participent au maintien du profil d’expression des gènes au coursdu développement. Les protéines PcG maintiennent les gènes réprimés tandis que les protéines TrxGmaintiennent les gènes activés. Une troisième classe de protéines nommée Enhancers of Trithoraxand Polycomb (ETP) module l’activité des PcG et TrxG. Dorsal Switch Protein 1 (DSP1) est uneprotéine HMGB (High Mobility Group B) classée comme une ETP. Par tamisage moléculaire, nousavions montré que la protéine DSP1 était présente au sein de complexes de poids moléculaire de 100kDa à 1 MDa. Le travail de thèse présenté ici a pour but d’identifier les partenaires de la protéineDSP1 dans l’embryon et de mieux connaître les propriétés biochimiques de DSP1. Premièrement, j’aimis en place puis effectué l’immunopurification des complexes contenant DSP1 dans des extraitsprotéiques embryonnaires. Cette approche nous a permis d’identifier 23 partenaires putatifs de laprotéine DSP1. Parmi ces protéines, nous avons identifié la protéine Rm62 qui est une ARN hélicaseà boîte DEAD. Les relations biologiques entre DSP1 et Rm62 ont été précisées. Deuxièmement, j’aidéterminé, par une approche biochimique, de nouvelles caractéristiques physico-chimiques de laprotéine DSP1. / In multicellular organism, the identity of cell is determined by several factors playing on genesexpression. Once established, the gene expression pattern is transmitted to daughter cells through aprocess involving epigenetic mechanisms that locally reshape the structure of chromatin. In Drosophilamelanogaster, the Polycomb (PcG) and trithorax (trxG) group genes are involved in the maintenanceof gene expression profile during development. Inside multimeric complexes, PcG proteins maintaingenes in repressed state whereas TrxG maintain genes active. A third class of proteins, calledEnhancers of Trithorax and Polycomb, regulate PcG and TrxG activities. Dorsal Switch Protein 1(DSP1) is a High Mobility Group B protein acting as an ETP. But DSP1 has not yet been identified inPcG or TrxG complexes. On the basis of gel filtration analysis of protein complexes in embryo nuclearextracts, it appears that the majority of DSP1 is present in complex(es) from 100 kDa to 1MDa. Aimsof present work are the identification of DSP1 protein partners in drosophila embryo and thecharacterization of biochemical properties of DSP1. Firstly, I used immunopurification from drosophilaembryonic nuclear extracts. The proteins purified with DSP1 were characterized through sequencingof peptides from individual protein bands by mass spectrometry. Among identified proteins, wefocused on the DEAD Box RNA helicase, Rm62. The role of interaction between DSP1 and Rm62 hasbeen characterized. Secondly, I have identified a new physicochemical aspect of DSP1 protein.