La voie endogène des microARN (miARN) est un processus de régulation cellulaire responsable principalement de réguler la traduction des ARN messagers (ARNm). Les miARN sont de petits ARN d'environ 21 à 23 nucleotides qui se lient spécifiquement à des sites de liaison retrouvés dans la région 3' non-codante des ARNm. Bien que le processus régule une panoplie d'ARNm différents, seulement quelques composantes protéiques sont impliquées afin de réaliser la biogenèse des miARN et de médier leur action régulatrice sur l'expression des gènes. La ribonucléase III Dicer est responsable de la génération des miARN, alors que la protéine Argonaute 2 (Ago2) est au centre du complexe effecteur de nature microribonucléoprotéique (miRNP). Afin d'étudier le fonctionnement de la voie des miARN chez l'humain, nous avons élaboré différents protocoles afin de pouvoir monitorer l'activité catalytique des protéines Dicer et Ago2 in vitro. Dicer a précédemment été localisée au reticulum endoplasmique (RE), mais ne possède pas de signal connu de localisation au RE. L'objectif général de mon projet de doctorat était donc d'identifier si des partenaires protéiques peuvent expliquer la présence de Dicer au RE. Dans ce travail, nous avons identifié et caractérisé la «cytoskeleton-linking endoplasmic reticulum membrane protein of 63 kDa» (CLIMP-63) comme nouveau partenaire protéique de Dicer. Impliquant une portion luminale de la CLIMP-63, l'interaction semble se produire à l'intérieur du RE. Dans les cellules humaines, on retrouve un complexe DicerCLIMP-63 de très haut poids moléculaire, une caractéristique possiblement conférée par la formation d'oligomères de la CLIMP-63. Le marquage métabolique des protéines cellulaires a permis d'observer que la CLIMP-63 interagit avec la forme nouvellement synthétisée de Dicer. La CLIMP-63 semble stabiliser la protéine Dicer, car sa surexpression augmente l'expression de la protéine endogène et surexprimée. La diminution de l'expression de la CLIMP-63, quant à elle, influence négativement l'expression de Dicer de même que celle d'un gène rapporteur contenant des sites de liaison à un miARN. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la CLIMP-63 est importante pour le bon fonctionnement de la voie endogène des miARN en interagissant et en stabilisant les formes nouvellement synthétisées de la protéine Dicer.

La ribonucléase III humaine Dicer est responsable de la biosynthèse des microARN et représente un pilier de la régulation génique, et donc de l’homéostasie cellulaire. Les microARN sont de petits éléments régulateurs de 19 à 24 nt qui régulent ~60% des gènes chez l’humain et sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires. De ce fait, il n’est pas étonnant qu’il y ait, dans la majorité des cancers, une diminution globale du niveau des microARN et que, dans plusieurs cas, un changement d’expression ou de localisation de la protéine Dicer ait été noté. Malgré le rôle important que joue Dicer dans la cellule, sa régulation n’est pas très bien connue, ni même les complexes de nature protéique au sein duquel il se trouve. Pour pallier à ce manque, nous avons criblé une librairie d’ADN complémentaires par double-hybride chez la levure, ce qui nous a permis de découvrir, et de caractériser, de nouvelles protéines pouvant interagir avec Dicer. Les résultats obtenus démontrent que Dicer est stabilisé par son interaction avec la protéine résidente du réticulum endoplasmique (RE) cytoskeleton-linking endoplasmic réticulum (ER) membrane protein of 63 kDa (CLIMP-63). La protéine Dicer forme un complexe avec CLIMP-63 peu de temps après sa traduction de novo. Les protéines semblent interagir à l’intérieur du RE et mener à l’export de la protéine Dicer hors de la cellule. Durant la mitose, où les niveaux de protéines Dicer sont réduits, Dicer peut être acétylé par l’acétyl-transférase General Control of Amino-acid Synthesis 5 (GCN5), une modification qui semble stabiliser Dicer. La localisation nucléaire de Dicer peut être causée par la protéine Mitogen-activated protein kinase upstream kinase-binding inhibitory protein (MBIP), au cours d’un processus nécessitant une lysine acétylable à la position 301 du signal de localisation nucléaire de MBIP. Finalement, la cytokine (TWEAK) pourrait moduler l’activité de clivage de Dicer via une interaction directe entre les deux protéines. L’utilisation du double-hybride chez la levure a permis de jeter un éclairage nouveau sur les protéines pouvant réguler la fonction et la localisation de l’enzyme Dicer dans les cellules humaines, au-delà de sa simple activité catalytique.

Chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) est un mécanisme endogène de régulation génique transcriptionnelle et posttranscriptionnellc médié par de petits acides ribonucleiques (ARN) non-codants générés par la ribonucléase III Dicer (Dcrl). Le rôle et la fonction de Dcrl, cependant, demeure méconnus. Une étude réalisée au laboratoire a précédemment permis l'identification, par une analyse en spectrométrie de masse, de la protéine Byr3 dans des immunoprécipitats de Dcrl. Cette observation suggère la possibilité que Byr3 interagisse avec Dcrl et qu'elle soit impliquée dans la voie de l'iARN. L'homologue de Byr3 chez l'humain est la protéine CNBP, « ccllular nuclcic acid binding protein ». L'interaction entre CNBP et Dicer est donc également envisageable. L'objectif principal de mon travail est de déterminer si la protéine Byr3 et son homologue humain peuvent interagir avec la ribonucléase Dicer, et ainsi être impliquées dans la voie de l'iARN. Chez S. pombe, la création de lignées mutées et d'outils moléculaires a permis d'étudier la protéine Byr3. Chez l'humain, des approches de microscopic par immunofluorescenec et de co-immunoprécipitation (co-IP) ont permis de définir une interaction entre la CNBP et Dicer. Notre travail pave la voie à une caractérisation plus approfondie de l'importance et de la signification de l'interaction entre Byr3 et Dcrl dans la voie de l'iARN / In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), the RNA interference (RNAi) pathway is an endogenous mechanism of transcriptional and posttranscriptional gene regulation by non-coding small ribonuclcic acids (RNAs) generated by the ribonuclease III Dicer (Dcr1). The role and function of Dcr1 though remains unclear. A previous study in our laboratory allowed the identification, by mass spectroscopy, of the Byr3 protein in Dcr1 immunoprecipitates. This observation suggests the possibility that Byr3 interacts with Dcr1 and is involved in the RNAi pathway. The main objective of my project was to define whether Byr3 and its human homolog, the cellular nucleic acid binding protein, (CNBP), can interact with the ribonuclease Dicer and be implicated in the RNAi pathway. In S. pombe, the creation of mutated strains and molecular tools allowed the study of the protein Byr3. In the human cellular model, methods of immunofluorescence microscopy and co-immunoprecipitation allowed the delineation of an interaction between CNBP and Dicer. Our study paves the way to an in-depth characterization of the importance and significance of the interaction between Byr3 and Dcr1 in the RNAi pathway.

La répression de la traduction des ARN messagers (ARNm) par les microARN est un processus qui régule environ 60% de tous les gènes chez l’humain et module la quasi-totalité des processus biologiques cellulaires. La ribonucléase Dicer étant l’enzyme responsable de la conversion des précurseurs de microARN en microARN matures, nous nous attendons à ce que le maintien de l’homéostasie cellulaire dépende d’une régulation fine des niveaux d’expression et de l’activité enzymatique de Dicer. L’utilisation du double-hybride chez la levure nous a permis d’identifier la protéine Tumor necrosis factor (TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK), comme un partenaire potentiel de la forme humaine de Dicer. TWEAK est un membre de la famille des TNF qui a été découvert récemment et qui est impliqué dans de nombreux processus biologiques, dont l’inflammation. Produit majoritairement par les leucocytes, son expression protéique est altérée dans de nombreuses maladies, dont l’arthrite rhumatoïde. L’objectif de notre étude vise donc à déterminer la nature, l’implication et le rôle de l’interaction entre Dicer et TWEAK dans le processus inflammatoire. Nous avons confirmé l’interaction Dicer-TWEAK par co-immunoprécipitation et leur colocalisation par immunofluorescence dans la lignée cellulaire HEK293. Nous avons également documenté un effet inhibiteur de TWEAK sur la capacité enzymatique de Dicer à produire des microARN matures in vitro et dans les cellules HEK293. Cette étude permet de mieux comprendre les mécanismes régulatoires de l’activité de Dicer et de l’expression des microARN dans le processus inflammatoire.

Les ribonucléases et les hélicases à ARN sont des acteurs clé du métabolisme des ARN et jouent donc des rôles cruciaux pour la régulation de l'expression des gènes. Peu de données sont connues concernant ce métabolisme chez les Archées, le troisième domaine du vivant. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse s'intéresse au métabolisme de l'ARN chez les archées et plus particulièrement aux ribonucléases ß-CASP. Dans ce contexte, nous focalisons nos études sur la compréhension physiologique que pourrait jouer les ribonucléases ß-CASP aCPSF1 et aRNase J, orthologue respectivement du facteur de terminaison de la transcription eucaryotes CPSF-73 et RNase J bactérienne. Par analogie avec CPSF-73 et RNase J, qui font partie de complexes multi-protéiques, des indices sur les fonctions des homologues archéens de ces ribonucléases pourraient provenir de l'identification des complexes autour de aCPSF1 et aRNase J. Utilisant des extraits de Pyrococcus abyssi et les protéines recombinantes aCPSF1 et aRNase J comme appâts, nous avons identifié que aRNase J fait partie d'un réseau d'interaction incluant une hélicase de la famille des Ski2-like (ASH-Ski2). En parallèle, des fractionnements d'extrait de P. abyssi sur gradient de saccharose par ultracentrifugation indiquent que aRNase J et ASH-Ski2 sont présentes toutes deux dans les fractions de haut poids moléculaires avec les sous-unités du ribosome et ceux de l'exosome. Nous avons aussi démontré une interaction stable entre aRNase J et ASH-Ski2 ainsi que des motifs impliquées dans cette interaction par des expériences de co- purification par chromatographie d'affinité. De plus, les caractérisations biochimiques de ASH-Ski2 indiquent que cette protéine possède une activité d'hydrolyse de l'ATP dépendant de la présence d'acides nucléiques. ASH-Ski2 possède de plus la capacité d'hybridation et de déroulement de deux brins d'acides nucléiques en présence d'ATP. A notre connaissance, nos résultats sont les premiers à indiquer un complexe contenant une ribonucléase et d'une hélicase à ARN Ski2-like chez les archées. De manière intriguent, aRNase J est orthologue de la RNase J bactérienne et ASH-Ski2 des hélicases Ski2-like des eucaryotes. Cela démontre que les Archées pourraient posséder un système composite impliqué dans le métabolisme des ARN partageant des caractéristiques bactériens et eucaryotes. Ces résultats mettent en lumière l'avantage de l'étude des Archées pour la compréhension des mécanismes moléculaires et évolutives des processus fondamentaux des trois domaines du vivant. / Ribonucleases and RNA helicases are the main actors of RNA processing and have a critical role in gene expression regulation. Little is known about this process in Archaea. Our group focuses in RNA metabolism in Archaea involving ß-CASP ribonucleases. Recently, we published phylogenomic and experimental work demonstrating that archaeal ß-CASP proteins, aCFSF1 and aRNase J, are highly conserved ribonucleases in Archaea. Archaeal aCPSF1, an ortholog of the eukaryal transcription termination factor CPSF73, is ubiquitous in Archaea suggesting an essential conserved function. Archaeal aRNase J, an ortholog of the bacterial ribonuclease RNase J, is conserved through a major phylum of the Archaea, the Euryarchaeota. These findings suggest that the role of these enzymes in RNA processing can be reminiscent of ancient functions that had arisen early in evolution. We now want to focus on understanding the physiological role of aCPSF1 and aRNase J with the hyperthermophilic euryarchaeal Pyrococcus abyssi as model. By analogy to eukaryal CPSF73 and bacterial RNase J, which are part of multiprotein complexes, clues to the function of the archaeal ß-CASP homologs might come from the identification of archaeal multiprotein complex(es) containing aCPSF1 and aRNase J orthologs. Using P. abyssi cell extracts and recombinant aCPSF1 or aRNase J as bait, we have found that aRNase J is a part of protein interaction networks that include Ski2-like RNA helicase (ASH-Ski2). In parallel, fractionation of P. abyssi whole cell extracts in sucrose gradient by ultracentrifugation shows that aRNase J and ASH-Ski2 are present in high sedimentation fractions with ribosomal and exosome sub-units. We also demonstrate a direct interaction of aRNase J with ASH-Ski2 by co-purification affinity chromatography experiments and identify motifs that potentially involve in this interaction. Biochemical characterization of ASH-Ski2 demonstrates a nucleic dependant ATPase activity. ASH-Ski2 also possesses annealing and unwinding activities in presence of ATP. To our knowledge, our results are the first experimental indications of interacting of a complex containing ribonuclease and RNA helicase-like proteins in Archaea. Remarkably, aRNase J is an orthologue of the bacterial RNase J and ASH-Ski2 is an orthologue of the eukaryotic Ski2-like family proteins. This shows that Archaea might possess a composite RNA processing system sharing both eukaryal and bacterial features. This highlights the advantage of an archaeal model to gain further mechanistic and evolutionary information of fundamental processes across the three domains of life.

Les microARN (miARN) sont des ARN endogènes d'environ 21 à 24 nucleotides (nt) produits lors du clivage d'une structure d'ARN en forme de tige-boucle par la ribonucléase Dicer III (ARNase III). Il a été rapporté que certains vims peuvent être ciblés par les composantes protéiques de la voie des miARN et représenter une source exogène de miARN. Les génomes d'ARN des vims de l'hépatite C (VHC) et de Timmunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) possèdent des structures secondaires d'ARN en tige-boucle pouvant représenter des substrats potentiels pour Dicer. Les résultats rapportés ici suggèrent que la région fortement structurée en 5' du génome du VHC, nommée "Internai ribosome entry site" (1RES), est réfractaire au clivage par Dicer in vivo. Cependant, nous montrons que TARN "Transactivating response" (TAR) du VIH-1 qui est situé en 5' de tous les transcrits viraux, est clivé par Dicer in vivo et représente une source de deux miARN fonctionnels nommés miR-TAR-5p et miR-TAR-3p. La caractérisation de ces miARN a permis de constater qu'un clivage asymétrique de TARN TAR par Dicer permet le relarguage préférentiel de miR-TAR-3p, dont les effets régulatoires sur un ARN messager (ARNm) rapporteur sont plus prononcés. Enfin, la protéine B23/Nucléophosmine (NPM) a été identifiée par analyse protéomique et son ARN caractérisé pour être ciblé par les miARN viraux dans des cellules exprimant Télément TAR du VIH-1. Certaines données préliminaires concernant la fonction de B23/NPM dans la pathogenèse du VIH-1 sont discutées. Ces travaux portant sur l'identification de miARN dérivant de la région TAR du VIH-1 et d'un ARNm cible de la cellule hôte permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires associés à l'infection par le VIH-1 et mettent en lumière la complexité des interactions hôte-virus.