京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20273号 / 医博第4232号 / 新制||医||1021(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 椛島 健治, 教授 山田 亮, 教授 清水 章 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La découverte de l’ARN interférence et des micro-ARN a permis de définir un principe majeur de régulation de l’expression des gènes, et a produit de nouveaux outils pour la médecine. Chez les mammifères, l’étude des fonctions des micro-ARN a été restreinte au cytoplasme, bien qu’ils soient aussi présents dans le noyau.Cette thèse présente une série d’expériences visant à caractériser les facteurs moléculaires requis pour l’activité nucléaire des micro-ARN. Nous avons débuté ce projet en explorant les partenaires ARN-dépendant de la protéine AGO2 par immunoprécipitation et spectrométrie de masse quantitative. Parmi les interactants ARN-dépendants, nous nous sommes concentrés sur trois protéines nucléaires abondantes : SFPQ, PSPC1 et NONO qui forment la famille drosophila behavior and human splicing (DBHS). Nous avons démontré que le complexe RISC nucléoplasmique est associé aux protéines SFPQ, PSPC1 et NONO dans plusieurs lignées cellulaires murines et humaines, d’une manière qui dépend de SFPQ. Des expériences de type HITS-CLIP de la protéine AGO2 et/ou de la protéine SFPQ dans des cellules souches nous ont permis de montrer que SFPQ se lie préférentiellement aux 3’UTR longs en utilisant deux motifs spécifiques. En effet, SFPQ contrôle significativement environ 20% de l’activité de liaison de AGO2, ce qui est répercuté au niveau transcriptomique. Cependant, cette activité concerne uniquement les sites de liaison de SFPQ proches (<500 nucléotides) de AGO2. De plus, nous avons observé que cette régulation s’étend aux ARNm cytoplasmiques. Ce résultat suggère que la liaison et l’agrégation de la protéine SFPQ à l’ARN programme la structure du 3’UTR et donc les possibilités de ciblage par les miARN dans le noyau, et ceci d’une manière qui semble préservée dans le cytoplasme. Enfin, nous avons montré en particulier que l’expression de SFPQ contrôle le programme de ciblage par let-7a, et module la transition des cellules souches vers l’état différencié.
Ces résultats contribuent à la diversité des mécanismes de régulation de l’activité des miARN. Dans la deuxième partie du projet, nous avons exploré les partenaires ARN-indépendant de la protéine nucléaire AGO2. Nous avons découvert que la protéine AGO2 interagit avec le complexe CCR4-NOT1 et l’exosome nucléaire d’une manière indépendante de l’ARN. Nous proposons une série d’expériences visant à confirmer ces résultats. Brièvement, l’hypothèse de travail qui semble la plus cohérente avec les données actuelles est la liaison directe de l’exosome au module CNOT2-CNOT3 du complexe CCR4-NOT1. Ce modèle permettrait d’expliquer le mécanisme d’extinction des gènes par les miARN nucléaires qui reposerait donc sur leur interaction avec les complexes CCR4-NOT1 et exosome. Son mode opératoire comprendrait des protéines de liaison à l’ARN et des micro-ARN pour sélectionner les cibles. / The discovery of RNA interference and micro-RNA has unravelled a fundamental principle of gene expression regulation, and has produced new tools for medicine. In mammals, the study of micro-RNA functions have been confined to the cytoplasm, although there is a growing body of evidence about their presence in the nucleus.This thesis present a set of experiments directed towards understanding the molecular factors required for nuclear miRNA activity.We started this project by exploring the RNA-dependent interactors of AGO2 by immunoprecipitation followed by quantitative mass spectrometry analysis. We focused on three partners: SFPQ, PSPC1 and NONO which are abundant nuclear proteins and belong to the DBHS family (drosophila behavior and human splicing). We demonstrated that the nucleoplasmic RISC complex associates with DBHS proteins in multiple murine and human cell lines in an SFPQ-dependent manner.HITS-CLIP experiments of AGO2 and SFPQ proteins in mouse embryonic stem cells showed that SFPQ preferentially binds long 3’UTR using two specific motifs. Using these motifs, SFPQ significantly controls about 20% of local AGO2 binding activity and target mRNA stability as we observe by transcriptomic analysis. SFPQ mode of action appears to be local and SFPQ motifs are functional only when proximal to AGO2 binding sites in a window of 500 nucleotides.Moreover, although SFPQ is only nuclear, we observe that SFPQ has an effect on cytoplasmic mRNAs, which suggests that SFPQ binding and aggregation to mRNA in the nucleus programs the 3’UTR for miRNA targeting, in a way that appears preserved in the cytoplasm.In particular, we found that SFPQ controls let-7 targeting program and modulates embryonic stem cell differentiation into neuron cells.These results contribute to expand the diversity of miRNA regulatory mechanisms.In the second part of the project, we explored the RNA-independent interactors of AGO2. We discovered that nuclear AGO2 interacts with CCR4-NOT1 complex and the RNA exosome in an RNA-independent manner.We propose a set of experiments to confirm these results, based on a new working model. Briefly, the most likely hypothesis to explain the current data is the direct binding of RNA exosome to the CNOT2-CNOT3 module of CCR4-NOT1 complex.This model would explain the silencing mechanism of genes by nuclear miRNAs, whose activity would depend on the RISC complex interaction with CCR4-NOT1 complex and RNA exosome.Hence, the RNA exosome would use both RNA binding proteins and miRNAs to select targets for degradation, based on CCR4-NOT1 mode of action.

Les miARN sont de petits ARN non codant dont la taille varie entre 21-24 nucléotides. Ils jouent un rôle de régulateurs post-transcriptionnels en utilisant leur complémentarité de séquence avec l’ARN messager (ARNm) cible afin d’induire sa répression. Grâce à la protéine Argonaute 2 (Ago2) dans laquelle les miARN sont incorporés formant ainsi le complexe miRISC, des cofacteurs sont recrutés afin d’induire la dégradation ou le blocage de la traduction de l’ARNm cible. Initialement connus pour réguler leurs cibles dans le cytoplasme, les miARN sont de plus en plus décrits comme étant des régulateurs de l’expression génique au niveau nucléaire. Dans ce travail, nous avons démontré la présence, au sein du noyau, d’un nouveau mécanisme de régulation post-transcriptionel par les miARN dont les facteurs majeurs sont Sfpq et Pspc1 / Micro-RNA, nuclear regulation, gene silencing, SfpqThere is a growing body of evidence about the presence and the activity of the miRISC in the nucleus of mammalian cells. Here we show by quantitative proteomic analysis that Ago2 interacts with the complex formed by Sfpq, Pspc1 and NonO in a RNA-dependent fashion. Sfpq mediates the interaction between miRISC with Pspc1 and NonO in the nucleoplasm. By HITS-CLIP coupled with transcriptomic analysis, we demonstrated that Sfpq specifically controls the downregulation of a subset of crucial let-7a-target mRNAs in stem cells, including Lin28a, Prtg, and Igf2bp1. Sfpq directly binds to specific sequence in the 3'UTR to promote the recruitment of selected nucleoplasmic miRNAs and triggers the decay, as we show for Lin28a mRNA. These results extend the miRNA-mediated post-transcriptional gene silencing into the nucleus and indicate that a dual strategy

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Hepatitis delta virus (HDV) is the smallest known mammalian RNA virus, containing a genome of ~ 1700 nt. Replication of HDV is extremely dependent on the host transcription machinery. Previous studies indicated that RNA polymerase II (RNAPII) directly binds to and forms an active preinitiation complex on the right terminal stem-loop fragment (R199G) of HDV genomic RNA, and that the polypyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor (PSF) directly binds to the same region. Further studies demonstrated that PSF also binds to the carboxyl-terminal domain (CTD) of RNAP II. In my thesis, co-immunoprecipitation assays were performed to show that PSF stimulates the interaction of RNAPII with R199G. Results of co-immunoprecipitation experiments also suggest that both the RNA recognition motif 2 (RRM2) and N-terminal proline-rich region (PRR) of PSF are required for the interaction between PSF and RNAPII, while the two RNA recognition motifs (RRM1 and RRM2) might be required for the interaction of PSF with R199G. Furthermore, in vitro run-off transcription assays suggest that PSF facilitates the HDV RNA transcription from the R199G template. Together, the above experiments suggest that PSF might act as a transcription factor for the RNAPII transcription of HDV RNA by linking the CTD of RNAPII and the HDV RNA promoter. My experiments provide a better understanding of the mechanism of HDV RNA-dependent transcription by RNAP II.

Hepatitis delta virus (HDV) is the smallest known mammalian RNA virus, containing a genome of ~ 1700 nt. Replication of HDV is extremely dependent on the host transcription machinery. Previous studies indicated that RNA polymerase II (RNAPII) directly binds to and forms an active preinitiation complex on the right terminal stem-loop fragment (R199G) of HDV genomic RNA, and that the polypyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor (PSF) directly binds to the same region. Further studies demonstrated that PSF also binds to the carboxyl-terminal domain (CTD) of RNAP II. In my thesis, co-immunoprecipitation assays were performed to show that PSF stimulates the interaction of RNAPII with R199G. Results of co-immunoprecipitation experiments also suggest that both the RNA recognition motif 2 (RRM2) and N-terminal proline-rich region (PRR) of PSF are required for the interaction between PSF and RNAPII, while the two RNA recognition motifs (RRM1 and RRM2) might be required for the interaction of PSF with R199G. Furthermore, in vitro run-off transcription assays suggest that PSF facilitates the HDV RNA transcription from the R199G template. Together, the above experiments suggest that PSF might act as a transcription factor for the RNAPII transcription of HDV RNA by linking the CTD of RNAPII and the HDV RNA promoter. My experiments provide a better understanding of the mechanism of HDV RNA-dependent transcription by RNAP II.