京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20273号 / 医博第4232号 / 新制||医||1021(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 椛島 健治, 教授 山田 亮, 教授 清水 章 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Coiled-Coil Domain Containing 9 is a novel gene located beside C5aR1/R2 on murine chromosome 7. This proximal relationship is mirrored on human chromosome 19, making this research translational and relevant to the medical field. CCDC9-/- mice were created through a contract research organization utilizing CRISPR/Cas9 gene editing. Necropsy, gross examination, hematology, and clinical chemistry analysis were conducted to ensure that the global knockout of the CCDC9 gene did not induce any abnormalities in the development of the mice. Bone Marrow Derived Macrophages and Thioglycolate Elicited Peritoneal Macrophages were utilized from wild type and CCDC9-/- mice to explore the cytokine response from these macrophages when stimulated with various pattern recognition receptor agonists. Poly (I:C) and LPS were the two agonists that led to the most significant difference in cytokine release. Interactions with Poly (I:C), a synthetic double-stranded RNA that activates anti-viral RNA sensing immune responses, were targeted to elucidate how CCDC9 may be interacting with RNA. Meanwhile, interactions with LPS demonstrated that the role of CCDC9 is not specific to RNA-sensing but plays a modulatory role in the TLR4 and LPS pathway. These agonists were then paired with complement anaphylatoxin, C5a, and stimulated TEPM to explore the proximal relationship between CCDC9 and C5aR1/R2. The pairing with Poly (I:C) did not reveal any significant changes, but the pairing with LPS lead to a cytokine decrease that was not mirrored in CCDC9-/- macrophages. In-vivo applications were established in which wild type and CCDC9 -/- mice were injected intraperitoneally with LPS and Poly (I:C) to investigate the cytokine release. CCDC9-/- mice and cells consistently displayed a greater inflammatory cytokine induction when encountering stimulators of viral and bacterial pathogen sensing, suggesting that CCDC9 plays a role in immune function. / 2025-03-07T00:00:00Z

Bacterial and viral infections affect billions of people each year. While bacterial infections are treated by the use of antibiotics, viral infections are eradicated by the immune system. This thesis comprises two parts. Part I presents the reconstitution of enzymes required for the synthesis of the minimal pharmacophore of moenomycin A (MmA), a molecule with antibacterial activity. Part II details single-particle electron microscopy studies of MDA5 alone and in complex with double-stranded RNA (dsRNA). MmA is a natural product antibiotic from Streptomyces ghanaensis that possesses remarkable potency against clinically relevant Gram-positive bacteria. MmA exerts its antibacterial activity by binding directly to peptidoglycan glycosyltransferases, enzymes involved in the synthesis of the glycan strands of peptidoglycan. The genes responsible for MmA biosynthesis have been identified, and a complete biosynthetic pathway has been proposed. Part I of this thesis describes the reconstitution of enzymes required for the synthesis of two trisaccharide scaffolds of MmA that retain antibacterial activity. It also describes the synthesis of unnatural phosphoglycerate lipid acceptors and UDP-amino sugars that can be used to probe the substrate tolerances of key glycosyltransferases in MmA biosynthesis. This work lays the foundation for the synthesis of unnatural MmA analogs that may possess better pharmacokinetic properties than the parent molecule. MDA5 is a helicase that detects viral dsRNA in the cytoplasm of vertebrate cells. Upon dsRNA recognition, MDA5 initiates a series of signal transduction events that activate the innate immune response. Part II of this thesis presents the structures of apo MDA5 protein and the MDA5-dsRNA complex obtained by using single-particle electron microscopy. Two-dimensional averages of apo MDA5 revealed that the protein is very flexible and can adopt multiple conformations. This finding suggests that MDA5 does not adopt an autorepressed conformation in the absence of viral dsRNA. When MDA5 is incubated with dsRNA, the protein assembles onto the dsRNA to form a linear oligomer. Two-dimensional averages and a three-dimensional reconstruction reveal the complex to consist of seven to eight stacked discs per strand of 112 base pair dsRNA. This work lays the foundation for further structural studies aimed at elucidating the mechanism by which MDA5 is activated. / Chemistry and Chemical Biology

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24329号 / 生博第488号 / 新制||生||65(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 野田 岳志, 教授 杉田 昌彦, 教授 垣塚 彰 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Lors d'une infection virale, l'hôte déclenche une réponse rapide, la rémonse immunitaire innée, dont l'interféron (IFN) de type I est la cytokine centrale. Des motifs moléculaires associés aux micro-organismes (MAMP) sont déteectés par de nombreux récepteurs dédiés, dont les récepteurs cytoplasmiques de type RIG-I (RLR) identifiés à partir de 2004. Les RLR, au nombre de trois, RIG-I, MAD5 et LGP2, sont les ARN-hélicases composées de deux ou trois types de domaines : deux domaines CARD, resposables du recrutement de la cascade de signalisation, un domaine C-terminal CTD, site de liaison initial de l'ARN viral, et le domaine central hélicase, site secondaire de liaison àl'ARN et possédant également une activité enzymatiques ATP-dépendante. RIG-I est impliqué dans la détection de plusieurs virus dont ceux de l'ordre des mononegavirales (virus de la rage, de la rougeole, Ebola). Ce récepteur reconnait des ARN viraux possédant une région double brin adjacente à une extrémité 5'-triphosphate. Les nombreuses études menées n'ont cepnedant pas encore permis de dégager un mécanisme complet et cohérent de l'activation de RIG-I. Notre objectif était donc d'apporter des réponses molécualires quant au mécanismes d'activation de RIG-I. Dans un premier temps, l'élucidation de la structure de la protéine entière RIG-I de canard, par l'équipe de Stephen Cusack, leur a permis d'identifier une conformation auto-réprimée de la protéine. En l'absence d'ARN le domaine CARD2 interagit avec le sous domaine Hel2i du domaine hélicase. Nous avons apporté une preuve fonctionelle de cette observation. Les mutations F540 A/D, du résidu situé dans le sous domaine Hel2i, inhibent l'interaction CARD2-Hel2i et produisent des mutant constituvement actifs. A l'opposé, les mutations correspondantes dans le domaine CARD2 rendent RIG-I inactif. L'interaction CARD2-Hel2i semble donc impliquer une double auto-répression via (i) le masquage du site de liaison à l'ARN du sous-domaine Hel2i, et (ii) le masquage de résidus du domaine CARD2 impliqués dans le recrutement d'intermédiaires requis pour la transduction du signal. Par ailleurs, l'étude de mutants impliqués dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP nous a permis de proposer un nouveau rôle régulateur pour cette activité enzymatique. Dans un deuxième temsp, l'étude de la nécessité de l'oligomérisation de RIG-I pour l'activation de la réponse IFN a été menée. Eva Kowalinski, en thèse dans l'équipe de Stephen Cusack, n'observe la formation de dimères de RIG-I, in vitro, qu'en présence d'un ARN synthétique possédant deux extrémités 5'-triphosphate. Nous avons complété cette observation avec des analyse montrant que des ARN synthéttiques leader incapables d'induire la dimérisation de RIG-I in viro, activent néanmoins ce récepteur in cellula. Par ailleurs, nim'utilisation de la technique de co-immunoprécipitation, ni celle du test de complémentation basé sur la luciférase Gaussia, avec ou sans activiation par un ARN ou une infection virale, n'ont permis d'observer d'oligomérisation de RIG-I. L'auto-association de RIG-I ne semble donc pas être indispensable pour son activation. / Vertebrate are permanently threatened by infections that they manage to counteract using a dedicated system. The innate immunity allows a rapid response against viral infection, mainly through the type I interferon (IFN) production. Dedicated receptors detect microbe-associated molecular patterns (MAMPs), and among them the RIG-likereceptors (RLRs), RIG-I, MDA5 and LGP2, can sense viral RNA into the cytoplasm. RLRs are compossed of two or three different domains : two N-terminal CARDs domains are resposible for signal transduction, a C-terminal domains is the first RNA binding site, and a central helicase domainis the second RNA binding site and possesses an ATP-dependent activity. RIG-I is important for sensing of several mononegavirales, such as rabies, measle and Ebola viruses, and recongnized 5'-triphosphorylated double stranded RNA. Despite intensive studies, a full and comprehensive model of the mechanismof RIG-I activation is still lacking. Our aim was to clarify the first molecular steps of RIG-I activation. First, Stephen Cusack's team elucidated the structure of the full lenght duck RIG-I protein and identified the principle of RIG-I auto-repressed conformation. In absence of ligand RNA, CARD2 domain interacts with Hel2i subdomain of helicase domain. We confirmed this conformation with functional evidence. Mutaions F540A/D, in Hel2i subdomain, inhibits CARD2:Hel2i interaction and renders RIG-I constitutively active. In contrast, the corresponding mutations in the Hel2i contacting site of CARD2 domain produce inactive mutants. Thus CARDS;Hel2i interactio induces an auto-repressed state through a deual masking of both Hel2i RNA binding site and CARD2 residus necessary for signal transduction. Moreover, study of mutants involved in ATP binding and hydrolysis reealed a portential unsuspected regulatory role for the ATP-dependent enzymatic activity of RIG-I. Second, we studied the necessity of RIG-I oligomerization for RIG-I activation. Eva Kowalinski, PhD student in Stephen Cusack's team, observed RIG-I dimers in vitro, only in presence of synthetic RNA with two 5'triphosphorylated ends. We complete this observation with functional assays showing that synthetic leader RNA incapable to induce RIG-I oligomerization in vitro, did activate RIG-I in cellula. Moreover, we did not observe RIG-I oligomerization using either co-immunoprecipitation or Gaussia Luciferase-based-protein complementation assay, after activation with cognate RNA or viral infection. Altogether our results indicate that the self-oligomerization og RIG-I is either dispensable or very transient for signal transduction.

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN de polarité négative. Les études démontrent que toute la population sera infectée par ce virus au moins deux fois avant l’âge de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aiguë et la pneumonie. Les infections sévères corrèlent avec le développement de l’asthme. Lors d’une infection virale, les particules du RSV sont détectées par le senseur RIG-I qui induit l’activation des facteurs de transcription NF-κB et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les réponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une réponse immunitaire mal adaptée. Plus précisément, par l’entremise de NF-κB, le RSV provoque une production exagérée de cytokines et chimiokines qui induisent une réponse inflammatoire démesurée provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable d’échapper à la réponse antivirale. Ces deux phénomènes sont contrôlés par l’entremise des protéines non structurales NS1 et NS2. Le mécanisme délimitant le mode d’action de NS1 et NS2 sur la réponse antivirale reste à être déterminé. Avec pour objectif d’élucider comment NS1 et NS2 inhibent la réponse antivirale, nous avons investigué le mécanisme de reconnaissance de l’hôte vis-à-vis de RSV. Nous démontrerons, pour la première fois, que le senseur cytosolique MDA5 est impliqué dans la réponse antivirale contre le RSV. Nous présenterons des résultats préliminaires qui suggèrent que le rôle de MDA5 est non redondant à RIG-I. À l’aide d’ARN interférant dirigé contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous démontrerons que MDA5 ne contribue pas à la phosphorylation d’IRF-3, mais plutôt qu’elle régit la stabilité du facteur de transcription. Nous démontrerons aussi que, contrairement à l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, l’inhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN−β. Cependant, l’expression ectopique de NS1 et NS2 réduit l’activité du promoteur de l’IFN-β et de la protéine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsqu’elle est mesurée par essai luciférase. / Respiratory Syncytial Virus (RSV) is a RNA virus with negative polarity. RSV infections are the most common cause of hospitalization among infants. Among populations at risk, infection of RSV can be quite severe. RSV infections can cause bronchiolitis, pneumonia, while severe infections are linked to the development of asthma. Early in the infectious cycle of RSV, the cytosolic sensor RIG-I captures viral particles, and activates the immune response by engaging the transcription factors IRF-3 and NF-κB. At the heart of RSV mediated pathologies is a skewed immune response. More precisely, RSV over stimulates the release of proinflammatory chemokines and cytokines. Intriguingly, while RSV is able to stimulate the production of proinflammatory cytokines and chemokines, RSV under stimulates the antiviral response. The ability of RSV to evade the antiviral response is thought to be mediated by its non-structural proteins: NS1 and NS2. However, the mechanism by which NS1 and NS2 enable RSV to evade the antiviral response remains to be determined. In this memoir we investigated, how RSV is recognized by the innate immune response in airway epithelial cells. With this information we hope to improve our understanding of how NS1 and NS2 allow RSV to circumvent the antiviral response. We show for the first time that cytosolic sensor MDA5 plays a role in the recognition of RSV particles. Using a combination of interfering RNA directed against RIG-I, and transfection of MDA5, we show that MDA5 does not contribute to the phosphorylation of IRF-3. According to the data presented, we suggest that MDA5’s role in the immune response is to prevent the degradation of IRF-3. Contrary to previous research, we show that the inhibition of the nonstructural protein does not increase the production of the antiviral cytokine IFN-β. However, the ectopic expression of NS1 and NS2 does lead to a reduction of the promoter activity of IFN-β and the antiviral protein ISG56 when measured by luciferase assay. This research highlights the importance of MDA5 as a potential therapeutic target in the development of a cure for RSV.

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN de polarité négative. Les études démontrent que toute la population sera infectée par ce virus au moins deux fois avant l’âge de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aiguë et la pneumonie. Les infections sévères corrèlent avec le développement de l’asthme. Lors d’une infection virale, les particules du RSV sont détectées par le senseur RIG-I qui induit l’activation des facteurs de transcription NF-κB et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les réponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une réponse immunitaire mal adaptée. Plus précisément, par l’entremise de NF-κB, le RSV provoque une production exagérée de cytokines et chimiokines qui induisent une réponse inflammatoire démesurée provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable d’échapper à la réponse antivirale. Ces deux phénomènes sont contrôlés par l’entremise des protéines non structurales NS1 et NS2. Le mécanisme délimitant le mode d’action de NS1 et NS2 sur la réponse antivirale reste à être déterminé. Avec pour objectif d’élucider comment NS1 et NS2 inhibent la réponse antivirale, nous avons investigué le mécanisme de reconnaissance de l’hôte vis-à-vis de RSV. Nous démontrerons, pour la première fois, que le senseur cytosolique MDA5 est impliqué dans la réponse antivirale contre le RSV. Nous présenterons des résultats préliminaires qui suggèrent que le rôle de MDA5 est non redondant à RIG-I. À l’aide d’ARN interférant dirigé contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous démontrerons que MDA5 ne contribue pas à la phosphorylation d’IRF-3, mais plutôt qu’elle régit la stabilité du facteur de transcription. Nous démontrerons aussi que, contrairement à l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, l’inhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN−β. Cependant, l’expression ectopique de NS1 et NS2 réduit l’activité du promoteur de l’IFN-β et de la protéine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsqu’elle est mesurée par essai luciférase. / Respiratory Syncytial Virus (RSV) is a RNA virus with negative polarity. RSV infections are the most common cause of hospitalization among infants. Among populations at risk, infection of RSV can be quite severe. RSV infections can cause bronchiolitis, pneumonia, while severe infections are linked to the development of asthma. Early in the infectious cycle of RSV, the cytosolic sensor RIG-I captures viral particles, and activates the immune response by engaging the transcription factors IRF-3 and NF-κB. At the heart of RSV mediated pathologies is a skewed immune response. More precisely, RSV over stimulates the release of proinflammatory chemokines and cytokines. Intriguingly, while RSV is able to stimulate the production of proinflammatory cytokines and chemokines, RSV under stimulates the antiviral response. The ability of RSV to evade the antiviral response is thought to be mediated by its non-structural proteins: NS1 and NS2. However, the mechanism by which NS1 and NS2 enable RSV to evade the antiviral response remains to be determined. In this memoir we investigated, how RSV is recognized by the innate immune response in airway epithelial cells. With this information we hope to improve our understanding of how NS1 and NS2 allow RSV to circumvent the antiviral response. We show for the first time that cytosolic sensor MDA5 plays a role in the recognition of RSV particles. Using a combination of interfering RNA directed against RIG-I, and transfection of MDA5, we show that MDA5 does not contribute to the phosphorylation of IRF-3. According to the data presented, we suggest that MDA5’s role in the immune response is to prevent the degradation of IRF-3. Contrary to previous research, we show that the inhibition of the nonstructural protein does not increase the production of the antiviral cytokine IFN-β. However, the ectopic expression of NS1 and NS2 does lead to a reduction of the promoter activity of IFN-β and the antiviral protein ISG56 when measured by luciferase assay. This research highlights the importance of MDA5 as a potential therapeutic target in the development of a cure for RSV.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第23336号 / 生博第454号 / 新制||生||60(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 野田 岳志, 教授 片山 高嶺, 教授 高田 穣 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第18627号 / 生博第318号 / 新制||生||42(附属図書館) / 31527 / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 藤田 尚志, 教授 米原 伸, 教授 朝長 啓造 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19625号 / 医博第4132号 / 新制||医||1015(附属図書館) / 32661 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 高田 穣, 教授 松田 文彦, 教授 小泉 昭夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM