Les molybdoenzymes sont des métalloprotéines retrouvées chez tous les êtres vivants, des procaryotes à l’Homme. Chez les organismes procaryotes, leur repliement et leur assemblage est un processus complexe nécessitant l’intervention de protéines chaperons spécifiques qui coordonnent l’insertion des centres métalliques au repliement et à l’assemblage des différentes sous-unités. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle du gène fdhD indispensable à l’activité des formiate déshydrogénases chez Escherichia coli et plus précisément sur son importance vis-à-vis de l’une d’entre elles, FdhF, une métalloprotéine à fer, molybdène et sélénium. FdhD interagit d’une part, avec sa cible FdhF et d’autre part, avec IscS, cystéine désulfurase majeure et impliquée notamment dans la biosynthèse des centres [Fe-S]. L’analyse de la séquence de FdhD met en évidence la présence d’un motif C121GXC124 conservé dont la substitution des résidus cystéine en alanine abolit la fonction de FdhD. En interagissant avec IscS, FdhD stimule son activité cystéine désulfurase et récupère le soufre généré en le fixant sous la forme de persulfures. La substitution des résidus cystéine a pour conséquence de réduire l’efficacité de transfert de soufre entre IscS et les variants de FdhD. La perte totale de l’activité FdhF enregistrée, en absence de FdhD, n’est pas due à une instabilité ou à un défaut d’insertion des centres métalliques mais est causée par une perte de sulfuration de l’enzyme. Sur la base de mes résultats, nous proposons que FdhD soit une soufre transférase entre IscS et FdhF. La sulfuration de FdhF par FdhD est essentielle à son activité enzymatique. Ce modèle est en accord avec les données cristallographiques indiquant la présence d’un atome de soufre au niveau de la sphère de coordination du Mo dans le site actif des formiate deshydrogénases et permet d’aller plus loin en reliant la présence du soufre à un état actif de l’enzyme et en identifiant les acteurs du processus. / Molybdoenzymes are ubiquitous metalloproteins found from prokaryotes to human. In prokaryotes, their folding and assembly is an intricate process assisted by dedicated chaperones coordinating metal centers insertion to folding and assembly of several subunits.During my PhD, I have investigated the role of the fdhD gene absolutely required for formate dehydrogenase activities in Escherichia coli and more precisely on one of them, FdhF, an iron-molybdenum-selenium metalloprotein. FdhD interacts with its target, FdhF and with IscS, a major cysteine desulfurase involved for instance in Fe-S cluster biogenesis. Sequence analysis of FdhD reveals the existence of a conserved C121GXC124 motif. Substitution of any of the two cysteine residues abolished FdhD function. Through IscS interaction, FdhD stimulates cysteine desulfurase activity and binds the sulfide generated by IscS in the forms of persulfides. Substitution of any of the conserved cysteine residues of FdhD reduces the sulfur transfer efficiency from IscS. Loss of FdhF activity in absence of fdhD is not due to intrinsic instability of loss of metal centers but rather due to lack of enzyme sulfuration. Based on my results, we postulate that FdhD functions as a sulfur transferase between IscS and FdhF, an essential step for enzyme activity. Our model is in complete agreement with crystallographic data showing the presence of a sulfur atom at the coordination sphere of the Mo atom at the active site of formate dehydrogenases and furthermore allows reconciling the presence of sulfur at the active site with enzymatic activity and identifying the players in this process.

Les molybdoenzymes (MoEs) à bisPGD sont des métalloprotéines dont le site actif est constitué d'un cofacteur à molybdène (Mo) mononucléaire. Elles sont impliquées dans les cycles biogéochimiques de l'azote, du carbone et du soufre et catalysent essentiellement des réactions d'oxydoréduction à 2 e-/2 H+ envers une grande variété de substrats. En dépit de la connaissance de la structure cristallographique de nombreuses MoEs, leur fonctionnement reste encore largement incompris. Ces enzymes présentent un intérêt biotechnologique car certains de leurs substrats sont des composés toxiques notoires, tels que les oxydes de sélénium ou d'arsenic. L'objectif de ma thèse a été d'identifier quels facteurs structuraux gouvernent la réactivité d'une MoE à bisPGD, la nitrate réductase A d'E. coli. Le premier axe de mes travaux de thèse a consisté à étudier l'activité de l'enzyme envers différents substrats et examiner le rôle du ligand protéique du Mo dans sa réactivité, en combinant des approches de mutagenèse dirigée, de biochimie et de spectroscopie RPE. J'ai montré que le ligand protéique du Mo est impliqué dans une étape clé du cycle catalytique. Le second axe a consisté à identifier les relations existantes entre la structure atomique du site actif et ses signatures spectrales. Pour augmenter la résolution et permettre d'identifier les transitions structurales mises en jeu lors de l'interconversion entre les différentes formes spectrales, j'ai utilisé la spectroscopie RPE impulsionnelle, qui permet de détecter les noyaux magnétiques (1H et 14N, …). Mes résultats constituent un pré-requis nécessaire pour l'étude structurale à haute résolution du site actif de la nitrate réductase. / Molybdenum (Mo) is a rare transition metal that is indispensable to most living organisms. In particular, it makes part of the active site of metalloenzymes involved in the biogeochemical cycles of carbon, nitrogen and sulphur. In this context, prokaryotic molybdoenzymes (MoEs) with the bisPGD cofactor at their active site essentially catalyze oxidoreduction reactions with 2 e-/2 H+ towards a wide range of substrates. Given that some MoEs can activate substrates that are well-known pollutants, understanding the mechanism of these enzymes accounts for a major prerequisite for future enzymatic engineering strategies aimed at optimizing enzyme reactivity towards bioremediation processes. To identify the molecular determinants of the reactivity of MoEs, we have explored the importance of the Mo proteic ligand aspartate in the respiratory Nitrate Reductase from E. coli. We have combined biochemistry and EPR spectroscopy to analyze the impact of the Mo-ligand substitution on both the enzymatic and the structural properties of the molybdenum cofactor. Our results show that the nature of the proteic ligand plays a critical role in the reactivity of the active site. A second part of my thesis work consisted in establishing the link between spectroscopic data on the MoV centre and its atomic structure. To get a high level of resolution and to identify which kind of structural modification is responsible for the spectroscopic differences between every Mo(V) signature, pulsed EPR spectroscop is most promising. Our results constitute a pre-requisite for structural studies of every species of the MoV center of the NRA.