Les molybdoenzymes (MoEs) à bisPGD sont des métalloprotéines dont le site actif est constitué d'un cofacteur à molybdène (Mo) mononucléaire. Elles sont impliquées dans les cycles biogéochimiques de l'azote, du carbone et du soufre et catalysent essentiellement des réactions d'oxydoréduction à 2 e-/2 H+ envers une grande variété de substrats. En dépit de la connaissance de la structure cristallographique de nombreuses MoEs, leur fonctionnement reste encore largement incompris. Ces enzymes présentent un intérêt biotechnologique car certains de leurs substrats sont des composés toxiques notoires, tels que les oxydes de sélénium ou d'arsenic. L'objectif de ma thèse a été d'identifier quels facteurs structuraux gouvernent la réactivité d'une MoE à bisPGD, la nitrate réductase A d'E. coli. Le premier axe de mes travaux de thèse a consisté à étudier l'activité de l'enzyme envers différents substrats et examiner le rôle du ligand protéique du Mo dans sa réactivité, en combinant des approches de mutagenèse dirigée, de biochimie et de spectroscopie RPE. J'ai montré que le ligand protéique du Mo est impliqué dans une étape clé du cycle catalytique. Le second axe a consisté à identifier les relations existantes entre la structure atomique du site actif et ses signatures spectrales. Pour augmenter la résolution et permettre d'identifier les transitions structurales mises en jeu lors de l'interconversion entre les différentes formes spectrales, j'ai utilisé la spectroscopie RPE impulsionnelle, qui permet de détecter les noyaux magnétiques (1H et 14N, …). Mes résultats constituent un pré-requis nécessaire pour l'étude structurale à haute résolution du site actif de la nitrate réductase. / Molybdenum (Mo) is a rare transition metal that is indispensable to most living organisms. In particular, it makes part of the active site of metalloenzymes involved in the biogeochemical cycles of carbon, nitrogen and sulphur. In this context, prokaryotic molybdoenzymes (MoEs) with the bisPGD cofactor at their active site essentially catalyze oxidoreduction reactions with 2 e-/2 H+ towards a wide range of substrates. Given that some MoEs can activate substrates that are well-known pollutants, understanding the mechanism of these enzymes accounts for a major prerequisite for future enzymatic engineering strategies aimed at optimizing enzyme reactivity towards bioremediation processes. To identify the molecular determinants of the reactivity of MoEs, we have explored the importance of the Mo proteic ligand aspartate in the respiratory Nitrate Reductase from E. coli. We have combined biochemistry and EPR spectroscopy to analyze the impact of the Mo-ligand substitution on both the enzymatic and the structural properties of the molybdenum cofactor. Our results show that the nature of the proteic ligand plays a critical role in the reactivity of the active site. A second part of my thesis work consisted in establishing the link between spectroscopic data on the MoV centre and its atomic structure. To get a high level of resolution and to identify which kind of structural modification is responsible for the spectroscopic differences between every Mo(V) signature, pulsed EPR spectroscop is most promising. Our results constitute a pre-requisite for structural studies of every species of the MoV center of the NRA.