Le génome de tous les organismes vivants est constamment menacé par de nombreux agents qui causent des dommages à l'ADN. Lorsque la fourche de réplication rencontre une lésion de l'ADN non réparée, deux voies de tolérance aux dommages de l'ADN sont possibles : la voie de synthèse translésionnelle (TransLesion Synthesis - TLS) potentiellement mutagène et les voies fidèles de contournement des lésions (Damage Avoidance - DA) qui utilisent l'information du brin complémentaire non endommagé. L’équilibre entre ces deux voies de tolérance fidèle et mutagène est un paramètre essentiel puisqu’il permet de définir le niveau de mutagénèse lors de la réplication d'un ADN endommagé. Afin d’étudier in vivo ces différentes voies de tolérance ainsi que leur équilibre, le laboratoire a développé un système qui permet l’introduction d’une lésion unique sur le chromosome de la bactérie Escherichia coli. Il a montré que cet équilibre est contrôlé par le niveau d'expression des ADN polymérases translésionnelles, ainsi que par la capacité de la cellule à faire de la recombinaison homologue. Au cours de cette thèse, nous montrons que cet équilibre est également régulé par des contraintes structurales au niveau de la fourche de réplication. Nous montrons que la proximité de deux lésions sur des brins opposés entraine une forte inhibition de la voie fidèle DA due à un chevauchement des régions d’ADN simple brins générées en aval des lésions. Cette inhibition conduit alors à une augmentation de la TLS, indépendamment de la réponse SOS. Ces données révèlent ainsi que la proximité des lésions de l'ADN est un facteur essentiel dans l’équilibre des voies de tolérance, pouvant favoriser la mutagénèse. / The genome of all living organisms is constantly injured by several agents that cause DNA damages. When the replication fork encounters an unrepaired DNA lesion, two DNA damage tolerance pathways are possible : the potentially mutagenic Translesion Synthesis (TLS) pathway and the error-free Damage Avoidance (DA) pathways that use the information of the undamaged complementary strand. The balance between these error-free and error-prone tolerance pathways is an essential parameter since it defines the level of mutagenesis during replication of a damaged DNA. In order to study these different pathways of tolerance and their balance in vivo, the laboratory has developed a genetic system that allows the introduction of a single lesion on the chromosome of Escherichia coli. They showed that the balance is controlled by the level of expression of the TLS polymerases, as well as the capacity of the cell to perform homologous recombination. In this thesis, we show that this balance is also modulated by structural constraints at the level of the replication fork. We show that the proximity of two lesions on opposite strands results in a strong inhibition of DA due to an overlap of the single stranded DNA regions generated downstream of the lesions. This inhibition leads to an increase in TLS independently of the SOS response. These data reveal that the proximity of DNA lesions is an essential factor in the balance of DDT pathways, favoring mutagenesis.

Catalyseurs de la dégradation de polysaccharides dans le cadre de diverses applications industrielles, de nombreuses glycoside hydrolases (GH) possèdent également une activité de transglycosylation qui peut être exploitée pour la synthèse d'oligosaccharides. Afin d'augmenter cette activité, minoritaire par rapport à l'hydrolyse, des expériences de mutagenèse rationnelle peuvent être employées. Toutefois, l'ensemble des bases moléculaires régissant l’équilibre entre ces deux activités reste en revanche difficile a élucider. L'étude de quatre GH (Ttβgly, AgaD, TcTS, TrSA) par simulation de dynamique moléculaire a permis la découverte de canaux d'eau internes à leurs structures et connectant le site actif au milieu. Cette observation suggère que les canaux d'eau internes aux GH pourraient être impliqués dans leur activité d'hydrolyse. Plusieurs paires de résidus bordant deux de ces canaux ont été mis en évidence chez Ttβgly et AgaD et semblent contrôler le passage de l'eau du canal vers le site actif. La mutagenèse de ces résidus a été entreprise afin de tenter d'augmenter l'activité de transglycosylation chez ces deux enzymes. Une réduction de l'hydrolyse d'un facteur 7 et 50 au profit de l'activité de transglycosylation a été caractérisée chez les deux meilleurs mutants de Ttβgly et AgaD, respectivement. L'analyse des simulations a révélé que ces résultats étaient corrélés à une augmentation de la dynamique des molécules d'eau internes aux deux canaux étudiés. Cette étude souligne ainsi l'importance fonctionnelle de l'eau interne aux hydrolases et suggère que l'ingénierie de sa dynamique peut constituer une approche originale pour convertir les GH en transglycosidases. / Known for their ability to hydrolyse glycosidic linkages,numerous glycoside hydrolases (GH) are also able tocatalyse transglycosylation reaction which can beharnessed for the synthesis of oligosaccharides. Althoughin the vast majority of cases hydrolysis prevails overtransglycosylation reaction, the latter has already beenincreased through mutagenesis and directed evolutionexperiments. However, little is known about the regulationof the balance between both activities. We discover, viamolecular dynamics (MD) simulations, several potentialwater channels connecting the bulk to the active site infour GH: Ttβgly, AgaD and the pair of homologsTcTS/TrSA. This observation supports the hypothesis thatchannels could be involved in the hydrolytic activity of GH.Amino acid residues forming bottlenecks at the interfacebetween two water channels and the active site in Ttβglyand AgaD were suspected to control water access fromthe bulk to the channel interior and the active site.Mutagenesis of key amino acids in the vicinity of selectedchannels was performed in order to attempt to increasethe transglycosylation/hydrolysis ratio balance.Characterization of the best mutants showed a 7 and 50fold decrease of hydrolysis compared to the wild type forTtβgly and AgaD respectively, while the transglycosylaseactivity was improved. MD simulations showed that thesemodifications were correlated with greater water dynamicsin the corresponding channels. These results highlight theimportance of water dynamics in hydrolases catalysis andsuggest that modifying the protein internal water dynamicscould serve as a generic approach to engineertransglycosylase activity in GH.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La transcétolase (TK, EC 2.2.1.1) est une enzyme catalysant la formation de cétoses de configuration D-thréo à partir d'aldéhydes α-hydroxylés (2R), par formation stéréospécifique d'une liaison C-C. L'objectif de ces travaux est d'inverser l'énantiosélectivité de cette enzyme par ingénierie afin d'obtenir des cétoses L-érytho (recherchés pour leurs applications potentielles dans les domaines pharmaceutique et/ou nutritionnel) à partir d'aldéhydes α-hydroxylés (2S). Dans ce but, une TK thermostable (mTKgst) issue de la bactérie thermophile Geobacillus stearothermophillus a d'abord été identifiée et produite. L'étude de sa structure tridimensionnelle a permis d'identifier deux résidus du site actif ayant un rôle potentiel dans l'inversion de son énantiosélectivité : Leu382 et Asp470. Des banques demTKgst mutées ont alors été créées, selon deux stratégies : rationnelle et semi-rationnelle. La première a consisté à muter les deux résidus sélectionnés par mutagenèse par saturation de site, tandis que la seconde a consisté à modifier deux séquences de cinq résidus contigus à aux positions clés, selon la mutagenèse par cassette. Afin d'identifier les mTKgst mutées d'intérêt, un test de criblage à haut-débit a été mis au point, basé sur le suivi pH-métrique de la réaction en présence de rouge de phénol. A l'issue du criblage, le variant mTKgst-L382D/D470S a été mis en évidence. Son activité vis-à-vis d'un aldéhyde modèle de configuration (2S) a été augmentée d'un facteur 5 par rapport à l'enzyme sauvage et la perte de l'énantiosélectivité vis-à-vis desaldéhydes (2R) a été confirmée.

La transcétolase (TK) permet de synthétiser des cétoses D-thréo par formation stéréospécifique d'une liaison C-C. L'objectif de ces travaux vise à modifier la spécificité de substrat de la TK de Saccharomyces cerevisiae par mutagenèse afin d'élargir le potentiel synthétique aux aldoses D-thréo et cétoses L-érythro. Notre stratégie a consisté à créer des banques de TK mutées à partir de courtes séquences du gène TKL1 (identifiées d'après la structure 3D) qui ont été dégénérées grâce à une approche de type "cassette mutagenesis". Pour identifier les TK recherchées, nous avons développé un test de sélection in vivo basé sur l'auxotrophie vis-à-vis d'un acide aminé. Dans ce but, nous avons synthétisé des sondes appropriées comportant un motif reconnu par la TK naturelle (cétose D-thréo) ou par les TK mutées recherchées (cétose L-érythro ou aldose D-thréo) et la chaîne latérale d'un acide aminé (alanine, valine leucine, méthionine, thréonine). La faisabilité de ce test a été étudiée en présence des composés cétose D-thréo et de la TK sauvage. In vitro, nous avons montré que ces différents composés sont des sustrats de la TK. Pour le développement du test de sélection in vivo dans E. coli, les substrats précurseurs de la leucine et la méthionine ont été retenus en raison de la stabilité de l'auxotrophie pour ces acides aminés. Les meilleurs taux de croissance ont été obtenus avec la sonde cétose D-thréo précurseur de la méthionine.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La kinésine mitotique humaine HsEg5 est essentielle à la division cellulaire. Ce moteur moléculaire permet la séparation des centrosomes et la mise en place du fuseau mitotique, structure nécessaire au partage équitable de l'information génétique. La suppression de la fonction d'HsEg5 bloque les cellules en pré-métaphase avec un fuseau mitotique monoastral caractéristique constitué des deux centrosomes non séparés entourés d'un anneau de chromosomes et de microtubules. Le maintien de ce phénotype peut conduire à la mort cellulaire programmée via l'activation du point de contrôle du fuseau mitotique (transition métaphase-anaphase). HsEg5 est ainsi considérée comme une cible anticancéreuse particulièrement intéressante. <br />Au cours de ces travaux, nous nous sommes intéressés aux interactions entre le domaine moteur d'HsEg5 et plusieurs inhibiteurs. Les zones d'interaction et de modifications conformationnelles ont été étudiées par échanges hydrogène/deutérium–spectrométrie de masse et mutagenèse dirigée. Cette approche expérimentale nous a permis d'identifier un « point chaud » d'inhibition sur le domaine moteur et de caractériser les mécanismes de deux inhibiteurs : le monastrol et le S-trityl-l-cystéine.

Le virus de l'hépatite B (VHB) est un agent pathogène humain, très contagieux, responsable de pathologies hépatiques telles que la cirrhose ou le carcinome hépatocellulaire. A l'heure actuelle, on estime que 2 milliards de personnes ont été infectées par ce virus dans le monde, parmi lesquelles on recense 350 millions de porteurs chroniques. Malgré l'existence d'un vaccin efficace, le nombre de personnes atteintes par la maladie reste élevé. Pour ces dernières, des traitements puissants existent consistant en l'utilisation d'interférons, efficaces dans 30 à 40% des cas, ou d'antiviraux dont l'inconvénient majeur est la sélection de virus résistants au traitement. Le mécanisme d'entrée du VHB dans les hépatocytes est encore inconnu. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été d'étudier ce mécanisme afin, notamment, de contribuer au développement de nouvelles thérapeutiques empêchant l'entrée virale. Une des approches utilisées pour étudier le processus d'entrée d'un virus consiste à étudier l'implication de ses protéines de surface dans ce phénomène. Ainsi, nous avons recherché la présence de motifs indispensables au processus d'infection dans ces protéines. Pour cela, nous y avons introduit des mutations puis nous avons analysé leur impact sur la capacité des virus à infecter des cellules saines. Cette stratégie nous a permis d'identifier, au sein de la grande protéine de surface du VHB, un nouveau déterminant de l'infectivité possiblement impliqué dans un processus de fusion permettant à l'enveloppe lipoprotéique virale de fusionner avec une membrane cellulaire afin qu'elle libère sa nucléocapside, contenant l'ADN viral, dans le cytoplasme de la cellule infectée.

La surexpression de pompes d'efflux par les cellules cancéreuses permet l'élimination d'agents cytotoxiques, induisant alors une résistance à la chimiothérapie. Trois transporteurs ABC sont principalement impliqués dans cette résistance : ABCB1 (aussi appelé P-gp), ABCC1 (ou MRP1) et ABCG2 (ou BCRP, MXR, ABCP). Du fait de leur implication dans le phénotype de " MultiDrug Resistance ", il est essentiel de mieux comprendre le fonctionnement de ces transporteurs. Une étude par mutagenèse dirigée a montré que les boucles intracellulaires, ICL0 et ICL1 sont impliquées dans le transport des substrats. Deux résidus sont particulièrement intéressants : W379 qui agirait comme un filtre des substrats ; et H457 qui participerait à la reconnaissance ou à la fixation des substrats. Par ailleurs, il est important de moduler cette chimiorésistance. Dans ce contexte nous avons développé une nouvelle classe d'inhibiteurs d'ABCB1 et ABCG2 non compétitifs basés sur un motif dipeptidique. Les composés les plus efficaces, CT1347 pour ABCB1 et CT1364 pour ABCG2, s'avèrent, d'une part peu ou pas cytotoxiques à fortes concentrations, abolissent d'autre part la résistance induite par ABCB1 ou ABCG2 et se comportent comme des inhibiteurs non compétitifs du Hoechst 33342 et de la daunorubicine. De plus, CT1364 inhibe l'activité ATPasique d'ABCG2 et induit une diminution rapide de l'expression de la protéine. Enfin, les 1ers tests in vivo de ce composé montrent que l'association avec l'irinotécan ralentit la croissance des xénogreffes de petite taille chez des souris