Τα τελευταία χρόνια, πολλά εργαστήρια έχουν επικεντρώσει το ενδιαφέρον τους στο 5S rRNA, το μικρότερο RNA συστατικό του ριβοσώματος. Ο ακριβής ρόλος του 5S rRNA στο ριβόσωμα, την πρωτεϊνική βιοσυνθετική μηχανή, δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Αποτελέσματα δομικών μελετών τοποθετούν το 5S rRNA στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Ευρήματα που αφορούν σχέσεις δομής και λειτουργίας οδηγούν στην υπόθεση, ότι σταθεροποιεί τη δομή του ριβοσώματος και λειτουργεί ως φυσικός μεταδότης πληροφοριών μεταξύ λειτουργικών κέντρων. Από την άλλη πλευρά, το ιοντικό περιβάλλον επηρεάζει άμεσα τη ριβοσωματική λειτουργία. Μονοσθενή και δισθενή κατιόντα, καθώς και πολυκατιόντα, όπως οι πολυαμίνες, παρεμβαίνουν στη ριβοσωματική διαμόρφωση και συνεπώς εμπλέκονται άμεσα στη λειτουργία του ριβοσώματος. Προκαρτατικές μελέτες στο εργαστήριό μας έχουν δείξει ότι οι πολυαμίνες, και συγκεκριμένα η σπερμίνη, σταθεροποιούν την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του 5S rRNA, οδηγώντας σε μια πιο συνεκτική διαμόρφωση του μορίου.
Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της διαμόρφωσης του 5S rRNA στην πρωτεϊνική σύνθεση του εντεροβακτηρίου E.coli. Παράλληλος στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης των πολυαμινών στη δομή και λειτουργία τόσο του 5S rRNA, όσο και ολοκλήρου του ριβοσωματικού συμπλόκου.
Η πρόσδεση των πολυαμινών στο 5S rRNA μελετήθηκε με τη μέθοδο της φωτοσήμανσης συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως μοριακό ανιχνευτή ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την ΑΒΑ-σπερμίνη. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της πρόσδεσης και προσδιορίστηκαν οι θέσεις δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA, είτε αυτό ήταν ελεύθερο, είτε ενσωματωμένο σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες ή 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα από E.coli. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι σε ελεύθερο 5S rRNA, η σπερμίνη προσδένεται κυρίως σε νουκλεοτίδια των ελίκων III και V και στις θηλιές Α, C, D και E. Ενσωμάτωση του 5S rRNA σε 50S υπομονάδες ή 70S poly(U)-προγραμματισμένα ριβοσώματα, είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της επιδεκτικότητας των νουκλεοτιδίων του στην ΑΒΑ-σπερμίνη. Ακολούθησε διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης του φωτοαναλόγου στη δομή του 5S rRNA. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα χημικής τροποποίησης, τα οποία αποκάλυψαν ότι ανεξάρτητα από το αν το 5S rRNA είναι ελεύθερο ή συναρμολογημένο σε 50S υπομονάδες ή σε 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα, η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνης προκαλεί σημαντικές αλλαγές στη διαμόρφωση του μορίου. Η θηλιά Α υιοθετεί μια πιο χαλαρή δομή, ενώ οι θηλιές C, D και E και η έλικα III μια πιο συνεκτική δομή.
Με την διαπίστωση των αλλαγών της διαμόρφωσης του 5S rRNA λόγω της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης, κρίθηκε ενδιαφέρον να μελετηθεί αν αυτές οι διαμορφωτικές αλλαγές επηρεάζουν θεμελιώδεις λειτουργίες του ριβοσώματος. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα του να συναρμολογείται σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνη στο 5S rRNA, δεν καταργεί την διαδικασία συναρμολόγησης των 50S υπομονάδων, παρεμποδίζει όμως τις απαιτούμενες δομικές αλλαγές με το να σταθεροποιεί μια πιο συνεκτική δομή του 5S rRNA, θερμοδυναμικά λιγότερο ευνοϊκή για την πορεία. Παρά το γεγονός ότι η πρόσδεση της σπερμίνης στο 5S rRNA επιφέρει στο μόριο δομικές αλλαγές που εμποδίζουν την συναρμολόγηση του σε 50S υπομονάδες, όταν αυτές σχηματιστούν, αποκτούν δομή τέτοια που επιτρέπει την αλληλεπίδρασή τους με τις 30S υπομονάδες. Ωστόσο, η παρουσία του 5S rRNA φαίνεται να είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό ενεργών 50S υπομονάδων, αφού η απουσία του 5S rRNA δεν επιτρέπει ούτε το σχηματισμό ακέραιων υπομονάδων, ούτε την σύζευξη των υπομονάδων προς ακέραια ριβοσωματικά σύμπλοκα.
Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rRNA, αρχικά στην ικανότητα των ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα και στη συνέχεια, στην καταλυτική δράση αυτών. Φωτοσήμανση του 5S rRNA με ΑΒΑ-σπερμίνη προκάλεσε μικρή, αλλά σαφή ενεργοποίηση της πρόσδεσης υποστρώματος στην Ρ-θέση, σε αντίθεση με την πρόσδεση στην Α-θέση, η οποία δε φαίνεται να επηρεάζεται. Σαφής ήταν, επίσης, η επίδραση στην ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης: Παρατηρήθηκε αύξηση μέχρι και 30% στη δραστικότητα της ΡΤασης. Ιδιαίτερης σημασίας είναι το εύρημα, ότι ριβοσώματα ελλιπή σε 5S διατηρούν ~10% της δράσης της ΡΤασης, γεγονός που οδηγεί στη υπόθεση ότι το 5S rRNA δεν είναι απολύτως απαραίτητο για τη κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού.
Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην μετατόπιση υποστρωμάτων, αρχικά στην αυθόρμητη (μη ενζυμική) και στη συνέχεια στην EF-G-καταλυόμενη μετατόπιση. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την υπόθεση, ότι η μετατόπιση υποστρωμάτων είναι έμφυτη ιδιότητα του ριβοσώματος. Παράλληλα, κατέδειξαν ότι η πρόσδεση σπερμίνης στο 5S rRNA διεγείρει την μη ενζυμική μετατόπιση, πιθανόν μέσω αλλαγών στην αναδίπλωση του rRNA, οι οποίες μεταδίδονται στα ριβοσωματικά κέντρα που είναι υπεύθυνα για αυτή τη λειτουργία. Περαιτέρω, η παρουσία σπερμίνης στο 5S rRNA, μείωσε τις απαιτήσεις για EF-G. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγηθεί είτε με μια πιθανή ευεργετική δράση της σπερμίνης στην δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, είτε με την επίδρασή της στο στάδιο της υδρόλυσης του GTP. Για να διευκρινίσουμε ποια από τις δυο εκδοχές ευσταθεί, μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G και στη συνέχεια στην ικανότητα τους να ενεργοποιούν την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση. Βρέθηκε ότι, η παρουσία σπερμίνης στο μόριο του 5S rRNA, ευνοεί τη δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα. ¨Όσο αφορά την ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης δεν επηρεάζεται από την παρουσία σπερμίνης, αποτέλεσμα που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rRNA δεν επηρεάζει την GTP υδρόλυση. Απουσία του 5S rRNA, τα ριβοσώματα διατηρούν κάποια δραστικότητα GTPασης, αλλά δεν είναι ικανά να δεσμεύουν αποτελεσματικά τον EF-G, ακόμη και παρουσία σπερμίνης. Λαμβάνοντας υπόψη, ότι η θέση δέσμευσης του EF-G στο ριβόσωμα βρίσκεται στα domain II και VI του 23S rRNA και ότι απευθείας επαφές του 5S rRNA με αυτές τις περιοχές ή με τον EF-G δεν έχουν βρεθεί, οδηγούμαστε στην υπόθεση ότι, το 5S rRNA, μέσω αλλοστερικών σημάτων, επηρεάζει την EF-G-GTP δέσμευση στο ριβόσωμα, όχι όμως και την GTP υδρόλυση.
Για να επιβεβαιώσουμε τα παραπάνω, μελετήθηκε η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rRNA, στη διαμορφωτική κατάσταση θεμελιωδών λειτουργικών κέντρων του ριβοσώματος. Η μελέτη εστιάστηκε στην ικανότητα του 5S rRNA να επηρεάζει τα κέντρα πρόσδεσης του EF-G στο ριβόσωμα, καθώς και τις θέσεις Α- και Ρ- του ριβοσωμικού συμπλόκου. Διαπιστώθηκε ότι η αλληλεπίδραση ελεύθερης σπερμίνης με το ριβόσωμα ενισχύει το αποτύπωμα (footprinting) χημικής προστασίας νουκλεοτιδίων υπευθύνων για την πρόσδεση του ΕF-G και τη συγκρότηση της Ρ-θέσης, όχι όμως και της Α-θέσης. Παρόμοια, αλλά μικρότερου βαθμού, ήταν και η επίδραση της προσδενομένης επιλεκτικά ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA.
Συμπερασματικά, το 5S rRNA περιέχει θέσεις εξειδικευμένης πρόσδεσης πολυαμινών, οι οποίες επηρεάζουν την τριτοταγή του διαμόρφωση. Η δέσμευση της σπερμίνης στο 5S rRNA φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά την ικανότητα της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας να δεσμεύει υπόστρωμα, βελτιώνει όμως την καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος και την ικανότητα του να μετατοπίζει τα υποστρώματα. Οι πολυαμίνες ενεργοποιούν την δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, αλλά ελάχιστα επηρεάζουν την υδρόλυση του GTP από τον EF-G. Εν κατακλείδι, το 5S rRNA φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγωγή σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου και της περιοχής πρόσδεσης EFG. / In recent years, many research groups have focused their interest on 5S rRNA, the smallest RNA component of the ribosome that is preserved in almost all organisms. Its precise role in the ribosome, the protein “biosynthetic machine”, has not been fully clarified. The results of structural studies place 5S rRNA in the large ribosomal subunit. Findings concerning relations between structure and function lead to the assumption that 5S rRNA stabilises the structure of the ribosome and acts as natural transmitter of information between functional centres.
On the other hand, the ionic environment directly affects ribosome function. Monovalent and divalent ions as well as polycations, such as polyamines, influence the ribosomal conformation, and therefore are involved in the function of the ribosome. Preliminary studies in our laboratory have shown that polyamines, namely spermine, stabilize the secondary and tertiary structure of 5S rRNA, leading to a more cohesive configuration of the molecule.
The aim of this thesis was to investigate the role of 5S rRNA configuration in protein synthesis of the enterobacterium E.coli. At the same time, the biological activity of polyamines in the structure and functioning of both 5S rRNA and the whole ribosomal complex was studied.
Polyamine binding to 5S rRNA was investigated by photoaffinity labeling, using a photoreactive analogue of spermine, ABA-spermine, as a molecular probe. Kinetic study was performed and the number of cross-linking sites of ABA-spermine in free 5S rRNA, or 5S rRNA incorporated into 50S subunits or 70S ribosomal complexes from E.coli ribosomes was determined. The results revealed that in free 5S rRNA spermine binds mainly to nucleotides of helices III and V and loops A, C, D and E. Integration of 5S rRNA into 50S subunits or 70S poly (U) – programmed ribosomes results in a great reduction of the susceptibility of 5S rRNA to ABA-spermine. The impact of the ABA-spermine photo-incorporation into the 5S rRNA molecule was then investigated. Chemical modification experiments revealed that, regardless of whether 5S rRNA is free or assembled in 50S subunits or 70S ribosomal complexes, binding of ABA-spermine causes significant changes in the conformation of the molecule. Loop A adopts a “looser” structure, while loops C, D, E and helices III and V achieve a more compact folding.
With the discovery of changes in the configuration of 5S rRNA, due to ABA-spermine’s binding, it was interesting to study whether these conformational changes influence fundamental functions of the ribosome. Initially, the effect of changing the configuration of 5S rRNA on 50S subunit and 70S ribosomal complex assembly was investigated. The results showed that binding of ABA-spermine to 5S rRNA does not eliminate the process of 50S subunit assembly, but impedes the necessary structural changes by stabilising a more coherent structure of 5S rRNA, thermodynamically less favourable for the process. Despite the fact that binding of ABA-spermine to 5S rRNA results in structural changes that reduce the assembly of 50S subunits, when the later are formed they acquire such a structure that allows their interaction with 30S subunits. Nevertheless, the presence of 5S rRNA seems to be necessary for the formation of active 50S subunits, since 5S RNA-depleted ribosomal subunits do not associate with 30S subunits to functional 70S ribosomes.
Next, the effect of photolabeling 5S rRNA was studied, initially on the ability of ribosomes to bind substrate, and then on their catalytic activity. Photolabeling of 5S rRNA with ABA-spermine caused a small but obvious activation in AcPhe-tRNA binding to the P-site. In contrast, binding to the A-site did not appear to be affected. Of great importance was the effect on the activity of peptidyl-transferase; in the presence of spermine, an increase of up to 30% on the activity of PTase was observed. Interestedly, ribosomes that lack 5S rRNA maintained ~ 10% of PTase activity, which leads to the assumption that 5S rRNA is not absolutely necessary for the formation of peptide bonds.
The study of the effect of 5S rRNA conformational changes on ribosome's ability to translocate substrates followed. Spontaneous (non-enzymatic) translocation was studied first, and then, EF-G-catalyzed translocation. The results confirmed the assumption that translocation of substrates is an inherent property of the ribosome itself, even though extremely slow. At the same time, it was shown that binding of spermine to 5S rRNA, stimulates non-enzymatic translocation, possibly through changes in the folding of ribosomal RNA, that are beneficial in translocating tRNAs. Further, the presence of spermine in 5S rRNA reduced the requirements for EF-G. This result can be explained either by a possible beneficial effect of spermine to the binding of EF-G to the ribosome, either through its impact in the process of hydrolysis of GTP. To clarify which of the two versions is accurate, we studied the effect of 5S rRNA conformational changes on the ribosomal ability to bind EF-G, and then on their ability to trigger EF-G-dependent GTP hydrolysis. It was found that the presence of spermine in 5S rRNA promotes EF-G binding to ribosomes. In contrast, the results of the study showed that the initial rate of GTP hydrolysis was not influenced by the presence of spermine. Ribosomes depleted of 5S rRNA retained some GTP activity, but were unable to effectively bind EF-G even in the presence of spermine. Taking into account that EF-G binds in domain II and VI of 23S rRNA, but direct contacts of 5S rRNA with these areas or with EF-G have not been found, we are led to the conclusion that 5S rRNA affects EF-G-GTP binding to ribosomes, through allosteric signals, without affecting the EF-G-mediated GTP hydrolysis.
To confirm the above, we studied the effect of the ionic environment and the changes in the tertiary structure of 5S rRNA on the conformational state of fundamental functional centres in the ribosome. Specifically, the study was focused on the ability of free spermine or photolabeling 5S rRNA with ABA-spermine to affect the SRL and GAC regions of the ribosome as well as the A-and P-sites. It was found that interaction of free spermine with ribosomes intensifies the footprint of EF-G within the ribosome and induces the AcPhe-tRNA binding to the P-site, but not to the A-site. Similar, but of lower degree, was the effect 5S rRNA labelling by ABA-spermine.
In summary, a comprehensive view of the 5S rRNA nucleotide residues involved in spermine binding is gained by the present study. The results further suggest that binding of spermine to 5S rRNA causes conformational changes in certain regions of the molecule. These changes, although not of the extreme amplitude, enabled us to investigate the functional role of 5S rRNA. In light of this role, it seems that PTase center and EF-G binding center are able to coordinate their functions by transmission of allosteric signals through 5S rRNA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/2547 |
| Date | 19 January 2010 |
| Creators | Κούβελα, Αικατερίνη |
| Contributors | Καλπαξής, Δημήτριος, Kouvela, Ekaterini, Καλπαξής, Δημήτριος, Δραΐνας, Διονύσιος, Ντίνος, Γεώργιος, Συνετός, Διονύσιος, Φλωρδέλλης, Χριστόδουλος, Ζαρκάδης, Ιωάννης, Βύνιος, Δημήτριος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0134 seconds