Diss. (sammanfattning) Göteborg : Göteborgs universitet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Univ., 2002. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (M.S.)--University of Missouri--Columbia, 2003. / "December 2003." Typescript. Includes bibliographical references (leaves 37-38). Also issued on the Internet.

Ο μυξομύκητας Dictyostelium discoideum είναι εξελικτικά κατώτερος ευκαρυωτικός οργανισμός και η RNase P από αυτόν είναι ένα εξαιρετικά ενδιαφέρον ένζυμο, δεδομένου του ότι, το ένζυμο αυτό προσφέρεται για σύγκριση, τόσο με ένζυμα RNase P ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, όσο και με τα καλύτερα χαρακτηρισμένα βακτηριακά ολοένζυμα. Η RNase P του D. discoideum έχει βρεθεί ότι είναι και αυτή ένα ριβονουκλεοπρωτεΐνικό σύμπλοκο, που αποτελείται από μία RNA υπομονάδα και από οχτώ πρωτεϊνικές υπομονάδες. Στην εργασία αυτή έγινε προσπάθεια να κλωνοποιηθεί και να χαρακτηριστεί μια επιπλέον πρωτεΐνική υπομονάδα, η DPop5, πέραν των τεσσάρων που έχουν ήδη κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί από το εργαστήριο του κ. Δραΐνα (DRpp20, DRpp30, DRpp40, DRpp29), έτσι ώστε να δοθεί επιπλέον πληροφορία για την ολοκλήρωση της αρχιτεκτονικής του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση του γονιδίου και υπερέκφραση αυτής μέσω ενός συστήματος έκφρασης, το οποίο βασίζεται στην παραγωγή χιμαιρικών πρωτεϊνών, αποτελούμενων από την πρωτεΐνη-στόχο και τη βακτηριακή συνοδό πρωτεΐνη, HSP70 ή DnaK. Στη συνέχεια, αφού ακολούθησε καθαρισμός της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της και η παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτής. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της καθώς και η μοντελοποίηση αυτής in silico έδειξαν ότι η πρωτεΐνη αυτή είναι αρνητικά φορτισμένη (pI 5.19) και ότι έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με RNA μόρια, μέσω ενός χαρακτηριστικού μοτίβου πρόσδεσης σ’ αυτά. Περαιτέρω πειραματικές διαδικασίες βρίσκονται σε εξέλιξη έτσι ώστε να αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος της στο ολοένζυμο. / Cloning and characterization of DPop5 protein subunit from Dictyostelium discoideum ribonucleoprotein complex RNase P.

No description available.

Η ριβονουκλεάση P (RNase P) είναι το ένζυμο που ευθύνεται για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των πρόδρομων μορίων tRNA συμμετέχοντας έτσι στην πρωτεΐνοσύνθεση. H RNase P καταλύει την ενδονουκλεολυτική θραύση ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού παρουσία ιόντων Mg2+ παράγοντας προϊόντα με 3΄ υδροξυλικά και 5΄ φωσφορικά άκρα. Η πλειοψηφία των RNase P ενζύμων που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα είναι ριβονουκλεοπρωτεΐνες αποτελούμενες από μια RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες. Η RNA υπομονάδα της βακτηριακής RNase P είναι ένα από τα πρώτα καταλυτικά RNA που μελετήθηκαν. Η RNase P και το ριβόσωμα είναι τα μόνα γνωστά ριβοένζυμα που είναι συντηρημένα και στις τρείς φυλογεννετικές περιοχές. Δεδομένης της ζωτικής σημασίας των λεμφοκυττάρων στην ακεραιότητα του ανοσολογικού συστήματος και στην παθογένεια ευρέος φάσματος δερματολογικών και μη νοσημάτων, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την απομόνωση και τον καθαρισμό της RNase P από περιφερικά λεμφοκύτταρα υγιών μαρτύρων, ο προσδιορισμός της ενζυμικής της δραστικότητας, καθώς και η μελέτη της in vitro επιδράσεως δυο συνθετικών ρετινοειδών, του 13-cis ρετινοϊκού οξέος και της ασιτρετίνης, της αμινογλυκοσίδης νεομυκίνης Β, όπως και της διφωσφορικής χλωροκίνης στην δραστικότητα της λεμφοκυτταρικής RNase P. Το ένζυμο καθαρίστηκε με τη χρήση κατιοντοανταλλακτικής χρωματογραφίας φωσφοκυτταρίνης και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες δραστικότητάς του.Μετά από μελέτη της επίδρασης των συνθετικών ρετινοϊδών και της νεομυκίνης Β στην δραστικότητα της RNase P, προέκυψε ότι και τα τρία προκαλούν μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της δραστικότητας της RNase Ρ των ανθρωπίνων λεμφοκυττάρων. Η διφωσφορική χλωροκίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της λεμφοκυτταρικής RNase P. Λεπτομερής κινητική ανάλυση έδειξε πως η αναστολή που προκαλείται από την ασιτρετίνη είναι συναγωνιστικού τύπου, ενώ αυτή από την νεομυκίνη Β είναι μη συναγωνιστικού τύπου.Η κινητική σταθερά Km της λεμφοκυτταρικής RNase P βρέθηκε ότι ισούται με 245 nM και η Vmax με 0.42 pmol/min. Συμπερασματικά, η απομόνωση της RNase P από ανθρώπινα περιφερικά λεμφοκύτταρα καθιστά δυνατή τη μελέτη της πιθανής ανάμιξης αυτού του ριβοενζύμου στους παθογενετικούς μηχανισμούς διαφόρων αυτοάνοσων, φλεγμονωδών και νεοπλασματικών δερματοπαθειών και μπορεί να διευκολύνει τη περαιτέρω ανάπτυξη της βασιζομένης στην RNase P τεχνολογίας για τη γονιδιακή θεραπεία δερματικών και μη παθήσεων. / Ribonuclease P (RNase P) is the enzyme responsible for the 5΄ maturation of the precursor tRNA molecules, participating in tRNA biogenesis and therefore in protein synthesis. It catalyses the endonucleolytic cleavage of a phosphodiester bond in the presence of Mg2+ and results in the production of molecules that bear 3΄ hydroxyl and 5΄ phosphoric ends. Most forms of RNase P are ribonucleoproteins consisting of an essential RNA and protein subunits. The RNA component of the bacterial RNase P was one of the first identified catalytic RNAs. So far, RNase P and the ribosome are the only ribozymes known to be conserved in all kingdoms of life (bacteria, archaea and eucarya). In view of the vital importance of lymphocytes for an effective immune system, we proceeded to the RNase P isolation from human peripheral lymphocytes. The enzyme was purified with cation exchange phosphocellulose chromatography and the optimal conditions were determined. Herein, it was investigated the effect of the synthetic retinoids (cis-retinoic acid and acitretin), neomycin B, as well as chloroquine diphosphate, on the RNase P activity. Cis-retinoic acid, acitretin and neomycin B exerted a dose-dependent inhibitory effect on RNase P activity from human lymphocytes, wlile the activity was not affected in the presence of chloroquine diphosphate. A detailed kinetic analysis showed that the inhibition caused by acitretin was of competitive type, whereas that caused by neomycin B was of noncompetitive type. The kinetic constant Km of RNase P activity isolated from lymphocytes for the tRNA maturation reaction has been estimated equal to 245 nM and the Vmax value has been estimated equal to 0.42 pmol/min. Finally, the isolation of RNase P from human peripheral lymphocytes will enable the study of the possible involvement of this ribozyme in the pathogenetic mechanisms of diverse autoimmune, inflammatory and neoplastic cutaneous disorders and may facilitate the further development of RNase P-based technology for gene therapy of infectious and neoplastic dermatoses.

Στην παρούσα εργασία, εξετάσαμε λεπτομερώς την κινητική της ενεργοποίησης της δραστικότητας της RNase P του E. coli από τη σπιραμυκίνη. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η σπιραμυκίνη δρα σαν μικτού τύπου «μη απαραίτητος» ενεργοποιητής . Η κινητική συμπεριφορά του ενεργοποιητή που εξετάστηκε, μπορεί να εξηγηθεί μ’ ένα κινητικό σχήμα ανάλογο αυτού που περιγράφεται στο Segel (1993). Σε κορεσμένη συγκέντρωση σπιραμυκίνης η τιμή της φαινομενικής Vmax (Vmax,app) για το ανασχηματισμένο ολοένζυμο αυξάνεται κατά 2,5 φορές και τιμή της φαινομενικής K(Ks s,app) μειώνεται κατά 7,1 φορές. Ομοίως, σε κορεσμένη συγκέντρωση σπιραμυκίνης, η τιμή της φαινομενικής Vmax για το M1 RNA αυξάνεται κατά 2,4 φορές και η τιμή της φαινομενικής K μειώνεται κατά 5 φορές. / -

No description available.

Η RNase P είναι το ένζυμο που ωριμάζει το 5΄ άκρο των πρόδρομων μορίων tRNA, ενώ έχει βρεθεί και στις τρεις φυλογενετικές περιοχές, καθώς και σε υποκυτταρικά οργανίδια. Είναι ριβονουκλεοπρωτεϊνικής φύσεως στις περισσότερες περιπτώσεις, ενώ έχουν βρεθεί και ένζυμα RNase P αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η υπομονάδα RNA των βακτηριακών ολοενζύμων είναι καταλυτικά ενεργή απουσία πρωτεϊνικών παραγόντων in vitro, καθιστώντας την ένα πραγματικό ριβοένζυμο. Η ικανότητα της RNase P να αναγνωρίζει συγκεκριμένες δομές στα μόρια των υποστρωμάτων της και όχι αλληλουχίες, δημιούργησε τη δυνατότητα χρήσης αυτού του ενζύμου ως ενός μοριακού εργαλείου για τη στόχευση πολλών ιικών και παθολογικών μορίων RNA in vitro και in vivo, καταστέλλοντας την έκφραση των μορίων αυτών, μέσω της τεχνολογίας των μορίων EGS (external guide sequence) και των ριβοενζύμων M1GS. Η RNase P, σύμφωνα με πολλές μελέτες, έχει δειχθεί ότι αποτελεί στόχο πολλών φαρμακευτικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων πολλών γνωστών αντιβιοτικών, οι οποίοι κατά κύριο λόγο αναστέλλουν τη δραστικότητα του ενζύμου. Πρόσφατα δείχτηκε, μέσω αναλυτικής κινητικής μελέτης, ότι ένα μακρολίδιο, η σπιραμυκίνη, ενεργοποιεί σημαντικά τη δραστικότητα της βακτηριακής RNase P και του M1 RNA κατά ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, λειτουργώντας έτσι ως μη-ειδικός ενεργοποιητής μικτού τύπου. Μέχρι σήμερα, στη διεθνή βιβλιογραφία, δεν έχει αναφερθεί άλλη ουσία η οποία προκαλεί θετική επίδραση στη δραστικότητα της RNase P. Στην παρούσα μελέτη, αρχικά μελετήθηκε η ενεργοποίηση της δραστικότητας της βακτηριακής RNase P και αποκαλύφθηκε ότι η σπιραμυκίνη δεν αλληλεπιδρά με ιοντικούς δεσμούς με το μόριο Μ1 RNA, αλλά προκαλεί αλλαγή διαμόρφωσης στο δομικό στοιχείο P10/11 του ριβοενζύμου. Το δομικό αυτό στοιχείο εμπλέκεται στην αναγνώριση του υποστρώματος, αποτέλεσμα το οποίο έρχεται σε συμφωνία με τις τιμές KD που προσδιορίστηκαν για το σύμπλοκο ριβοενζύμου–υποστρώματος, απουσία και παρουσία σπιραμυκίνης. Με δεδομένο ότι η σπιραμυκίνη δεν επηρεάζει την πρωτεϊνοσύνθεση ή τη δραστικότητα της RNase P των ευκαρυωτικών κυττάρων, κατασκευάστηκε ένα ριβοένζυμο M1GS, ώστε να ελεγχθεί η επίδραση του αντιβιοτικού στη δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, σε καλλιεργούμενα ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ293. Ως στόχος του συγκεκριμένου M1GS, επιλέχτηκε ο μεταγραφικός παράγοντας Ets2 λόγω της μεγάλης κλινικής σημασίας του, εφόσον έχει συσχετιστεί με αρκετούς τύπους καρκίνου και παθολογικές καταστάσεις, καθώς και με διαδικασίες διαφοροποίησης. Ο σπουδαίος ρόλος του Ets2, σε συνδυασμό με τα ελλιπή δεδομένα σχετικά με την έκφρασή του, είχαν αποτρέψει μέχρι σήμερα την αποτελεσματική στόχευσή του με τη χρήση των υπαρχουσών μεθοδολογιών που βασίζονται στο RNA, όπως το RNAi. Μετά από ανάλυση της δευτεροταγούς δομής του Ets2 mRNA, σχεδιάστηκαν δύο οδηγοί αλληλουχίες. Οι αλληλουχίες αυτές, αρχικά, δοκιμάστηκαν ως εξωτερικές οδηγοί αλληλουχίες (EGS) σε συνδυασμό με το βακτηριακό ολοένζυμο της RNase P. Η EGS303 (το νούμερο υποδεικνύει το νουκλεοτιδικό κατάλοιπο του στόχου που δρα η RNase P), εμφάνισε τη μεγαλύτερη ικανότητα να επάγει τη δράση της RNase P in vitro. Η οδηγός αυτή αλληλουχία, στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στο 3΄ άκρο του M1 RNA, παράγοντας το ριβοένζυμο M1GS303, το οποίο είναι δραστικό έναντι του μορίου–στόχου του in vitro. Η δραστικότητα του συγκεκριμένου ριβοενζύμου ενεργοποιείται εντυπωσιακά κατά 160% παρουσία σπιραμυκίνης. Προκειμένου να ελεγχθεί η δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, το μόριο–στόχος και το ριβοένζυμο εκφράστηκαν ελεγχόμενα σε κύτταρα E. coli, προκαλώντας μείωση της έκφρασης του μορίου–στόχου από το M1GS303 κατά 95% μετά από 12 ώρες έκφρασης των μορίων. Μείωση στα ίδια επίπεδα ανιχνεύτηκε μόλις μετά από 4 ώρες έκφρασης εφόσον στα κύτταρα είχε προστεθεί σπιραμυκίνη, γεγονός που υποστηρίζει την εντυπωσιακά θετική επίδραση της σπιραμυκίνης επί της δραστικότητας του ριβοενζύμου. Η ίδια σειρά πειραμάτων επαναλήφθηκε σε ευκαρυωτικά κύτταρα, με έκφραση του ριβοενζύμου σε HEK293 κύτταρα. Η δραστικότητα του ριβοενζύμου προσδιορίστηκε ποιοτικά και ποσοτικά, από την έκφραση της χιμαιρικής φθορίζουσας πρωτεΐνης Ets2–EGFP (μόριο–στόχος), σε διαφορετικούς χρόνους έκφρασης. Παρατηρήθηκε ότι το M1GS δρα αποτελεσματικά έναντι του μορίου–στόχου του και σε ευκαρυωτικά κύτταρα in vivo, προκαλώντας μείωση στην έκφραση του Ets2, η οποία αυξάνεται επιπλέον παρουσία σπιραμυκίνης. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν τη σημαντική ενεργοποίηση της δραστικότητας του M1GS σε ανθρώπινα κύτταρα και καθιστούν τη σπιραμυκίνη ένα σημαντικό ενεργοποιητή στη χρήση των ριβοενζύμων M1GS ως εργαλεία γονιδιακής αποσιώπησης. Ο συνδυασμός βελτιωμένων ριβοενζύμων M1GS με την παρουσία σπιραμυκίνης αυξάνει ακόμα περισσότερο την πρακτική χρήση της συγκεκριμένης τεχνολογίας τόσο in vitro όσο και in vivo, επιτυγχάνοντας ακόμα πιο αποτελεσματική αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης. / RNase P is the enzyme that endonucleolytically cleaves the precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. It has been found in all three phylogenetic domains of life, as well as in subcellular organelles. In most cases, it has been described as a ribonucleoprotein complex. However, few RNase P enzymes that are exclusively proteinaceous have been also reported recentrly. The RNA subunit of bacterial holoenzyme is catalytically active in the absence of protein factors in vitro, making it a true ribozyme. The ability of RNase P to recognize specific structures in its substrate molecules instead of specific sequences, allowed the use of this enzyme as a molecular tool for targeting pathological and viral RNA molecules in vitro and in vivo, by suppressing gene expression through the technology of EGS (external guide sequence) and M1GS ribozymes. RNase P, according to numerous studies, has been the target of several pharmaceutical agents, including most of the mainstream antibiotics. It has been shown recently, through analytical kinetic studies that the macrolide spiramycin significantly enhances the activity of bacterial RNase P and M1 in a dose dependent manner, acting as a non-specific mixed-type activator. Until now, no other compound has been reported to induce a positive effect on RNase P activity. In the present study, the enhancement of bacterial RNase P activity by spiramycin was tested initially, and it was revealed that spiramycin does not interact with the M1 RNA molecule through ionic bonds. On the contrary, it induces a conformational change of the P10/11 structural element of M1 RNA, which is mainly responsible for substrate recognition. The above results are in agreement with the KD values determined for the ribozyme-substrate complex, in the absence or in the presence of spiramycin. Since spiramycin does not affect eucaryotic protein synthesis or eucaryotic RNase P activity, an M1GS ribozyme was constructed, in order to examine the effect of spiramycin on the ribozyme activity in vivo, using human HEK293 cells. The target of this M1GS was the transcription factor Ets2, a factor with great clinical importance, since it has been associated with several types of cancer and disease, as well as essential processes during differentiation. The important role of Ets2 in combination with the lack of data on Ets2 expression, had hitherto prevented its effective targeting by using the existing methodologies based on RNA, such as RNAi. After analysis of the secondary structure of Ets2 mRNA, two guide sequences were designed. These sequences were originally tested in trans as external guide sequences (EGS), in combination with the bacterial RNase P. The EGS303 (the number indicates the nucleotide residue cleaved by RNase P), showed an ability to induce RNase P activity in vitro. The guide sequence was then cloned and fused into the 3' end of M1 RNA ribozyme, thus producing the M1GS303 ribozyme, which was found to be effective against the target molecule. The activity of this specific ribozyme is impressively enhanced by 160% in the presence of spiramycin. In order to examine the activity of this ribozyme in vivo, the expression of the target molecule and the ribozyme were induced in E. coli cells. After 12 hours of expression, a reduced level of the target molecule was detected, because of the M1GS303 activity (about 95%). Reduction to similar levels was observed after only 4 hours from the induction of both molecules expression, in the presence of spiramycin. This observation strongly supports spiramycin’s striking positive effect on the ribozyme activity. The same set of experiments was repeated in human HEK293 cells. The activity of the ribozyme was determined qualitatively and quantitatively, by the determination of the expression of the chimeric fluorescent protein Ets2-EGFP (target molecule) at different times of expression. The M1GS ribozyme cleaves efficiently the target molecule in human cells as well in vivo, resulting in a reduction in the expression of Ets2, which is further increased in the presence of spiramycin. This result indicates the significant activation of M1GS activity in human cells, making spiramycin an important activator in using M1GS ribozymes as tools in gene silencing. The combination of improved M1GS ribozymes in the presence of spiramycin, further increases the practical utilization of this technology both in vitro and in vivo, thus achieving an even more effective suppression in gene expression.

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο, απολύτως απαραίτητο για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς είναι υπεύθυνο για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των προδρόμων μορίων tRNA. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα και από τις τρεις φυλογενετικές περιοχές (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες), όπως επίσης και από τα ημιαυτόνομα υποκυτταρικά οργανίδια, μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες [Frank και Pace 1998, Xiao et al. 2002]. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μια RNA υπομονάδα απαραίτητη για την κατάλυση ενώ ο αριθμός των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο ποικίλλει από μια στα βακτήρια έως και δέκα στην RNase P του ανθρώπου [Frank και Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. Η RNA υπομονάδα από τα Βακτήρια και ορισμένα Αρχαία παρουσιάζει καταλυτική δραστικότητα απουσία πρωτεϊνών in vitro, σε υψηλή ιοντική ισχύ [Guerrier-Takada et al. 1983, Pannucci et al. 1999]. Παρότι μέχρι στιγμής καμία τέτοια ιδιότητα δεν έχει εντοπιστεί σε ευκαρυωτική RNA υπομονάδα, πιστεύεται ότι στην πραγματικότητα πρόκειται για ένα ριβοένζυμο [Frank et al. 2000]. Η RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες οι οποίες είναι απαραίτητες για την δραστικότητα του ολοενζύμου. Η πυκνότητα επιπολής που υπολογίσθηκε για την RNase P από το D. discoideum είναι πολύ χαμηλή σε σχέση με τα χαρακτηρισμένα ολοένζυμα ευκαρυωτικής προέλευσης και είναι παρόμοια με αυτή ενός πρωτεϊνικού μορίου [Stathopoulos et al. 1995]. Παρότι έχει αποδειχθεί ότι το ολοένζυμο αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ακριβή σύσταση του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Πρόσφατα εντοπίστηκε το γονίδιο της RNA υπομονάδας της RNase P από το D. discoideum μέσω συγκριτικής φυλογενετικής ανάλυσης, μήκους 369 νουκλεοτιδίων [Marquez et al. 2005]. Χρησιμοποιώντας τις πρωτεϊνικές υπομονάδες Rpp20 και Rpp40 της RNase P του ανθρώπου πραγματοποιήθηκε αναζήτηση στη τράπεζα δεδομένων της αλληλούχισης του γενωμικού DNA του D. discoideum. Το αποτέλεσμα της αναζήτησης ήταν η εύρεση δύο ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (drpp20 και drpp40) που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες (DRpp20 και DRpp40) οι οποίες παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με τις υπομονάδες. Η επαγόμενη πρωτεΐνη DRpp20 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 26,4 KD, pI 5,6 και επιδεικνύει σημαντική ομοιότητα με την χαρακτηρισμένη πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp20 του ανθρώπου (34% ταυτότητα, 56% ομοιότητα σε μήκος 140 αμινοξέων). Όμοια, η πρωτεΐνη DRpp40 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 48,2 KD, pI 5,5 και παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με την πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp40 (26% ταυτότητα, 45% ομοιότητα σε μήκος 302 αμινοξέων). Παρά την συνολική ομοιότητα, τα μοριακά βάρη των DRpp20 και DRpp40 διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με αυτά των ομόλογων πρωτεϊνών τους. Η DRpp20 διαθέτει μια περιοχή χαμηλής πολυπλοκότητας, πλούσια σε κατάλοιπα θρεονίνης, γλουταμίνης και λυσίνης που πιθανόν να συνεισφέρει στο επιπλέον μοριακό βάρος όπως φαίνεται από την στοίχιση με το Clustal W. Τόσο οι επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων γενωμικών περιοχών όσο και οι περιοχές χαμηλής πολυπλοκότητας σε επίπεδο πρωτεΐνης υπάρχουν σε αφθονία στο D. discoideum [Eichinger et al. 2005] και παραμένει να αποδειχτεί εάν αυτά τα χαρακτηριστικά συνεισφέρουν δομικά ή λειτουργικά στις DRpp. Από βιοπληροφορική ανάλυση προκύπτει ότι καμία από τις υπομονάδες των Αρχαίων ή τις εννέα υπομονάδες της ζύμης δεν παρουσιάζει ομοιότητα με τις DRpp20 και DRpp40. Επιπρόσθετα, με την βοήθεια του Pfam αλλά και των προγραμμάτων που συνδέονται με τον MetaServer εντοπίσαμε στην περιοχή 56-126 αμινοξέα της πρωτεΐνης DRpp20 το δομικό μοτίβο των Alba πρωτεϊνών. Η μελέτη των δύο πρωτεϊνών με βάση τον αλγόριθμο PSORT υποδεικνύει ότι και οι δύο πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα για χωροθέτηση στον πυρήνα παρά σε οποιοδήποτε άλλο υποκυτταρικό διαμέρισμα. Στην παρούσα εργασία τα υπό μελέτη γονίδια drpp20 και drpp40 κλωνοποιούνται σε φορέα υπερέκφρασης pET-29 και εισάγονται σε δεκτικά κύτταρα BL21(DE3)pLysS. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώνονται από το κυτταρικό εκχύλισμα με χρωματογραφία συγγενείας σε στήλη νικελίου. Οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 με την μέθοδο που απομονώνονται παραλαμβάνονται σχεδόν στην φυσική τους μορφή όπως προκύπτει και από τα φάσματα του κυκλικού διχρωϊσμού. Οι πρωτεΐνες αυτές χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων καθώς επίσης και για λειτουργικές μελέτες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. Όπως αποδεικνύεται οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 αποτελούν τμήματα του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ανιχνεύουν μία ζώνη που συνεκλούεται με την δραστικότητα του ολοενζύμου σε ανάλυση κατά Western. Επιπρόσθετα, η ισχύς αυτής της αλληλεπίδρασης επιτρέπει την κατακρήμνιση καταλυτικά δραστικού ενζύμου με την χρήση των πολυκλωνικών αντισωματών anti-DRpp20 και anti-DRpp40. Μεταξύ των πρωτεϊνών και της RNA υπομονάδας καθώς επίσης του tRNA υποστρώματος αναμένεται να υπάρχουν αλληλεπιδράσεις RNA πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα των πρωτεϊνών DRpp20 και DRpp40 να αλληλεπιδρούν με μόρια RNA και ιδιαίτερα με μόρια tRNA. Σε μία σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν δοκιμάστηκαν μόρια tRNA, ολικό RNA αλλά και πλασμιδιακό DNA χωρίς όμως κάποιο αποτέλεσμα στις συνθήκες που πραγματοποιήθηκε η αντίδραση, παρότι άλλες πρωτεΐνες που φέρουν το μοτίβο των Alba πρωτεϊνών έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μόρια DNA ή δίκλωνα τμήματα RNA. Τέλος, για τις DRpp20, DRpp40 αλλά και το ολοένζυμο, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για δραστικότητα ΑΤΡασης κυρίως εξαιτίας της ομολογίας της πρώτης με την Rpp20 του ανθρώπου που διαθέτει τέτοια ιδιότητα, χωρίς να ανιχνεύεται μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης σημαντική ομολογία με αντίστοιχα ένζυμα. Στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν δεν ανιχνεύτηκε δραστικότητα ΑΤΡασης που να σχετίζεται με κάποια από τις δύο πρωτεΐνες ή το ολοένζυμο. Ο απώτερος στόχος μας είναι ο προσδιορισμός της ελάχιστης λειτουργικής δομής καθώς και η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και RNA-πρωτεΐνης στο ολοένζυμο της RNase P. Η ολοκλήρωση της μελέτης θα συμβάλλει στην κατανόηση του καταλυτικού μηχανισμού και της εξέλιξης της ριβονουκλεάσης Ρ από ένα αρχέγονο ριβοένζυμο σε ένα υψηλά οργανωμένο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous and essential ribonucleoprotein enzyme that matures the 5´ end of all primary tRNA transcripts. It has been studied from a variety of organisms, representing the three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya), as well as from the major subcellular organelles, mitochondria and chloroplasts [Frank and Pace 1998, Xiao et al. 2002]. RNase P enzymes contain a similar in size RNA subunit which is absolutely required for catalysis. However, the size and number of protein subunits of the holoenzyme varies significantly, from one small subunit in bacteria to ten subunits in human RNase P [Frank and Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. The RNA subunit from bacteria and some archaea is catalytically active in vitro in high ionic strength and in the absence of the protein fraction of RNase P [Guerrier-Takada et al.1983, Pannucci et al. 1999]. No such activity has been proven yet for eukaryotic RNA subunit but is still considered to be intrinsically a ribozyme [Frank et al. 2000]. Dictyostelium discoideum RNase P holoenzyme is a ribonucleoprotein complex, consisted of RNA and proteins essential for catalytic activity. Considering its buoyant density, D. discoideum RNase P exhibits one of the most proteinaceous idiosyncrasies, among the characterized holoenzymes of eukaryotic origin [Stathopoulos et al. 1995]. Although it has been established that this enzyme contains both RNA and protein components, very little is known on the exact composition of the ribonucleoprotein complex. A recent report identified a putative RNA subunit of D. discoideum RNase P of length of 369 nucleotides through phylogenetic comparative analysis [Marquez et al. 2005]. Genomic analysis of the available data from D. discoideum sequencing projects, revealed among others the existence of two open reading frames (drpp20 and drpp40) encoding two proteins (DRpp20 and DRpp40) that show significant similarity to previously characterized proteins subunits Rpp20 and Rpp40 from human RNase P. The encoded protein DRpp20 has a predicted molecular mass of 26,4 KD, pI 5,6 and exhibits significant similarity to characterized human RNase P protein subunit, Rpp20 (34% identity, 56% similarity at a length of 140 amino acids). Likewise, the protein DRpp40 of a predicted mass of 48,2 KD and pI 5,5, displays significant similarity to its human counterpart, Rpp40 (26% identity, 45% similarity at a length of 302 amino acids). DRpp20 harbors a region of low complexity (rich in threonine residues) which confers to higher MW in comparison with the human homologue. Such regions have not been encountered so far in proteins of this kind in other organisms. Tandem repeats at the genomic and the protein level, are abundant in D. discoideum [Eichinger et al. 2005] and it remains to be proven if these features contribute to the structure and function of DRpp proteins. To the best of our knowledge no homologues of DRpp20 and DRpp40 have been identified in yeast and archaeal RNase P enzymes. Additionally, pattern search of the D. discoideum protein sequences using MetaServer and Pfam prediction tools identified a DRpp20 region (amino acids 56 to 126) that bears similarity to the Alba domain. PSORT analysis of DRpp20 and DRpp40 predicts that these proteins are likely to localise into the nucleus. In this study the putative ORFs were subcloned into pET-29 expression vector and the recombinant vectors were used for the transformation of BL21(DE3)pLysS. The recombinant polypeptides were purified from the cell extract using Ni2+-nitriloacetic acid agarose column. The purified proteins are isolated in their native form as supported by circular dichroism analysis of the preparations. These preparations were used for the production of polyclonal antibodies as well as functional studies as described below. DRpp20 and DRpp40 are functionally associated with the RNase P ribonucleoprotein catalytic complex. Using anti-DRpp20 and anti-DRpp40 polyclonal antibodies we ascertained the concurrence of DRpp20 and DRpp40 with purified RNase P activity after standard purification schemes. Moreover, the nature of this association permits the precipitation of RNase P activity through antigen-antibody interaction using the same antibodies. RNA-proteins interactions between the protein subunits, the RNA moiety and/or the RNA substrate are expected in the holoenzyme complex, and therefore the ability of DRpp40 and DRpp20 to bind to RNA molecules was investigated. In a series of experiments using a variety of binding partners (plasmids, tRNAs and total RNA), we did not detect any DNA or RNA binding properties for DRpp20 and DRpp40, although other proteins that contain the Alba core interact with DNA or double stranded RNA regions. Although neither DRpp20 nor DRpp40 harbours an ATPase domain, we tested DRpp40 and DRpp20 for ATPase activity mostly due to the latter homology with human Rpp20, which was shown to have ATPase activity. We could not detect any ATPase activity associated with aforementioned proteins or holoenzyme. Our future prospects are the determination of minimal catalytic core and the complete mapping of all protein-protein and RNA-protein interactions within RNase P holoenzyme. The completion of this project will contribute in a decisive manner to the understanding of both the catalytic mechanism and the evolution of RNase P from a primordial ribozyme to a highly organized ribonucleoprotein complex.