Durum wheat (<i>Triticum turgidum</i> L. var. durum, 2n = 4x = 28, AABB genomes) is used predominantly for semolina and pasta products, but there is increasing interest in using durum for bread-making to provide alternative markets during periods of overproduction. The goal of this study was to characterize the bread-making quality of durum wheat cultivars and emmer (<i>Triticum turgidum</i> L. var. dicoccum, 2n = 4x = 28) derived breeding lines derived from crosses of durum wheat with an Emmer land race 97Emmer19 from Iran. Emmer-derived breeding lines were evaluated along with three high quality bread wheat (<i>Triticum aestivum</i> L., 2n = 6x = 42, AABBDD genomes) cultivars and seven durum wheat cultivars across three environments in replicated yield trials in the 2005 and 2006 growing seasons. Four 1AS.1AL-1DL translocation lines which carry the Glu-D1d allele [high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS) pair 1Dx5+1Dy10] from chromosome 1D of bread wheat were also evaluated. In general, durum wheat cultivars with elevated gluten strength and/or increased dough extensibility were noted to have higher loaf volume (LV) than those with weaker gluten. The 1AS.1AL-1DL translocation line L252 carrying the LMW-1 banding pattern had better dough mixing stability and LV than the translocation lines with the LMW-2 banding pattern. The 1AS.1AL-1DL translocation lines had higher grain protein concentrations (GPC), but the lowest loaf volumes of all the lines tested. These translocation lines also exhibited unappealing external loaf quality (loaf shape and appearance) and poor internal loaf quality (crumb structure). Variation in bread-making quality attributes were observed among durum genotypes. 97Emmer19 exhibited higher LV than all the durum wheats evaluated and approached the loaf volume achieved with the bread wheat cultivar AC Superb. Breeding lines derived from crosses of 97Emmer19 to strong gluten durum cultivars (WB881 or AC Navigator) had higher LV than those of the durum checks. 97Emmer19 carried Glu-A1a* (HMW-GS 1Ax1) and the progeny carrying that allele generally exhibited higher loaf volumes. Durum wheat genotypes expressing the Glu-B1d (HMW-GS pair Bx6+By8) allele exhibited better overall bread-making quality compared with those expressing the Glu-B1b (HMW-GS pair Bx7+By8) allele. The durum cultivar Arcola and the emmer-derived breeding line 2000EB4, showed higher alveograph extensibility (L) values than did the bread wheat check AC Barrie. The durum wheat genotypes (with the exception of Stewart-63) and emmer-derived breeding lines exhibited better dough extensibility than the USDA-ARS 1AS.1AL-1DL translocation lines. These results indicate that there is potential to select for genotypes with improved baking quality in durum breeding programs.

Durum wheat (<i>Triticum turgidum</i> L. var. durum, 2n = 4x = 28, AABB genomes) is used predominantly for semolina and pasta products, but there is increasing interest in using durum for bread-making to provide alternative markets during periods of overproduction. The goal of this study was to characterize the bread-making quality of durum wheat cultivars and emmer (<i>Triticum turgidum</i> L. var. dicoccum, 2n = 4x = 28) derived breeding lines derived from crosses of durum wheat with an Emmer land race 97Emmer19 from Iran. Emmer-derived breeding lines were evaluated along with three high quality bread wheat (<i>Triticum aestivum</i> L., 2n = 6x = 42, AABBDD genomes) cultivars and seven durum wheat cultivars across three environments in replicated yield trials in the 2005 and 2006 growing seasons. Four 1AS.1AL-1DL translocation lines which carry the Glu-D1d allele [high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS) pair 1Dx5+1Dy10] from chromosome 1D of bread wheat were also evaluated. In general, durum wheat cultivars with elevated gluten strength and/or increased dough extensibility were noted to have higher loaf volume (LV) than those with weaker gluten. The 1AS.1AL-1DL translocation line L252 carrying the LMW-1 banding pattern had better dough mixing stability and LV than the translocation lines with the LMW-2 banding pattern. The 1AS.1AL-1DL translocation lines had higher grain protein concentrations (GPC), but the lowest loaf volumes of all the lines tested. These translocation lines also exhibited unappealing external loaf quality (loaf shape and appearance) and poor internal loaf quality (crumb structure). Variation in bread-making quality attributes were observed among durum genotypes. 97Emmer19 exhibited higher LV than all the durum wheats evaluated and approached the loaf volume achieved with the bread wheat cultivar AC Superb. Breeding lines derived from crosses of 97Emmer19 to strong gluten durum cultivars (WB881 or AC Navigator) had higher LV than those of the durum checks. 97Emmer19 carried Glu-A1a* (HMW-GS 1Ax1) and the progeny carrying that allele generally exhibited higher loaf volumes. Durum wheat genotypes expressing the Glu-B1d (HMW-GS pair Bx6+By8) allele exhibited better overall bread-making quality compared with those expressing the Glu-B1b (HMW-GS pair Bx7+By8) allele. The durum cultivar Arcola and the emmer-derived breeding line 2000EB4, showed higher alveograph extensibility (L) values than did the bread wheat check AC Barrie. The durum wheat genotypes (with the exception of Stewart-63) and emmer-derived breeding lines exhibited better dough extensibility than the USDA-ARS 1AS.1AL-1DL translocation lines. These results indicate that there is potential to select for genotypes with improved baking quality in durum breeding programs.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2009. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Embargoed. Vita. Bibliography: 91-96.

Morphine is a clinically very important drug from the opioid group that is used for treatment of severe pain because of its strong analgetic effect. Opioid receptors mediating the morphine effect interact with the Gi/o class of trimeric G-proteins. Opioid receptors also occur in heart tissue and morphine can thus potentially exercise its effect on the function of this organ. The major aim of this project was to pursue consequences of long-term treatment with morphine on expression and distribution of selected heterotrimeric G-protein subunits in the rat heart. Potential cardioprotective effects of this drug have also been studied. Laboratory rats of the Wistar strain were treated with morphine (1 mg/kg/day or 10 mg/kg/day) for 10 or 28 days. The control group was treated with saline solution. Prolonged treatment with morphine did not cause any effects on Gs, Gi, Gz, Gq/11, G subunits, but the expression of Go rather decreased. The results of subsequent experiments showed that prolonged administration of high doses of morphine may reduce the area affected by infarction and reduced the frequency of ventricle arrhythmias depending on dose and duration of morphine administration. Key words: morphine, myocardium, opioid receptor, G-protein subunits, infarction.

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο, απολύτως απαραίτητο για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς είναι υπεύθυνο για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των προδρόμων μορίων tRNA. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα και από τις τρεις φυλογενετικές περιοχές (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες), όπως επίσης και από τα ημιαυτόνομα υποκυτταρικά οργανίδια, μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες [Frank και Pace 1998, Xiao et al. 2002]. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μια RNA υπομονάδα απαραίτητη για την κατάλυση ενώ ο αριθμός των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο ποικίλλει από μια στα βακτήρια έως και δέκα στην RNase P του ανθρώπου [Frank και Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. Η RNA υπομονάδα από τα Βακτήρια και ορισμένα Αρχαία παρουσιάζει καταλυτική δραστικότητα απουσία πρωτεϊνών in vitro, σε υψηλή ιοντική ισχύ [Guerrier-Takada et al. 1983, Pannucci et al. 1999]. Παρότι μέχρι στιγμής καμία τέτοια ιδιότητα δεν έχει εντοπιστεί σε ευκαρυωτική RNA υπομονάδα, πιστεύεται ότι στην πραγματικότητα πρόκειται για ένα ριβοένζυμο [Frank et al. 2000]. Η RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες οι οποίες είναι απαραίτητες για την δραστικότητα του ολοενζύμου. Η πυκνότητα επιπολής που υπολογίσθηκε για την RNase P από το D. discoideum είναι πολύ χαμηλή σε σχέση με τα χαρακτηρισμένα ολοένζυμα ευκαρυωτικής προέλευσης και είναι παρόμοια με αυτή ενός πρωτεϊνικού μορίου [Stathopoulos et al. 1995]. Παρότι έχει αποδειχθεί ότι το ολοένζυμο αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ακριβή σύσταση του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Πρόσφατα εντοπίστηκε το γονίδιο της RNA υπομονάδας της RNase P από το D. discoideum μέσω συγκριτικής φυλογενετικής ανάλυσης, μήκους 369 νουκλεοτιδίων [Marquez et al. 2005]. Χρησιμοποιώντας τις πρωτεϊνικές υπομονάδες Rpp20 και Rpp40 της RNase P του ανθρώπου πραγματοποιήθηκε αναζήτηση στη τράπεζα δεδομένων της αλληλούχισης του γενωμικού DNA του D. discoideum. Το αποτέλεσμα της αναζήτησης ήταν η εύρεση δύο ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (drpp20 και drpp40) που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες (DRpp20 και DRpp40) οι οποίες παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με τις υπομονάδες. Η επαγόμενη πρωτεΐνη DRpp20 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 26,4 KD, pI 5,6 και επιδεικνύει σημαντική ομοιότητα με την χαρακτηρισμένη πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp20 του ανθρώπου (34% ταυτότητα, 56% ομοιότητα σε μήκος 140 αμινοξέων). Όμοια, η πρωτεΐνη DRpp40 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 48,2 KD, pI 5,5 και παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με την πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp40 (26% ταυτότητα, 45% ομοιότητα σε μήκος 302 αμινοξέων). Παρά την συνολική ομοιότητα, τα μοριακά βάρη των DRpp20 και DRpp40 διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με αυτά των ομόλογων πρωτεϊνών τους. Η DRpp20 διαθέτει μια περιοχή χαμηλής πολυπλοκότητας, πλούσια σε κατάλοιπα θρεονίνης, γλουταμίνης και λυσίνης που πιθανόν να συνεισφέρει στο επιπλέον μοριακό βάρος όπως φαίνεται από την στοίχιση με το Clustal W. Τόσο οι επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων γενωμικών περιοχών όσο και οι περιοχές χαμηλής πολυπλοκότητας σε επίπεδο πρωτεΐνης υπάρχουν σε αφθονία στο D. discoideum [Eichinger et al. 2005] και παραμένει να αποδειχτεί εάν αυτά τα χαρακτηριστικά συνεισφέρουν δομικά ή λειτουργικά στις DRpp. Από βιοπληροφορική ανάλυση προκύπτει ότι καμία από τις υπομονάδες των Αρχαίων ή τις εννέα υπομονάδες της ζύμης δεν παρουσιάζει ομοιότητα με τις DRpp20 και DRpp40. Επιπρόσθετα, με την βοήθεια του Pfam αλλά και των προγραμμάτων που συνδέονται με τον MetaServer εντοπίσαμε στην περιοχή 56-126 αμινοξέα της πρωτεΐνης DRpp20 το δομικό μοτίβο των Alba πρωτεϊνών. Η μελέτη των δύο πρωτεϊνών με βάση τον αλγόριθμο PSORT υποδεικνύει ότι και οι δύο πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα για χωροθέτηση στον πυρήνα παρά σε οποιοδήποτε άλλο υποκυτταρικό διαμέρισμα. Στην παρούσα εργασία τα υπό μελέτη γονίδια drpp20 και drpp40 κλωνοποιούνται σε φορέα υπερέκφρασης pET-29 και εισάγονται σε δεκτικά κύτταρα BL21(DE3)pLysS. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώνονται από το κυτταρικό εκχύλισμα με χρωματογραφία συγγενείας σε στήλη νικελίου. Οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 με την μέθοδο που απομονώνονται παραλαμβάνονται σχεδόν στην φυσική τους μορφή όπως προκύπτει και από τα φάσματα του κυκλικού διχρωϊσμού. Οι πρωτεΐνες αυτές χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων καθώς επίσης και για λειτουργικές μελέτες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. Όπως αποδεικνύεται οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 αποτελούν τμήματα του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ανιχνεύουν μία ζώνη που συνεκλούεται με την δραστικότητα του ολοενζύμου σε ανάλυση κατά Western. Επιπρόσθετα, η ισχύς αυτής της αλληλεπίδρασης επιτρέπει την κατακρήμνιση καταλυτικά δραστικού ενζύμου με την χρήση των πολυκλωνικών αντισωματών anti-DRpp20 και anti-DRpp40. Μεταξύ των πρωτεϊνών και της RNA υπομονάδας καθώς επίσης του tRNA υποστρώματος αναμένεται να υπάρχουν αλληλεπιδράσεις RNA πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα των πρωτεϊνών DRpp20 και DRpp40 να αλληλεπιδρούν με μόρια RNA και ιδιαίτερα με μόρια tRNA. Σε μία σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν δοκιμάστηκαν μόρια tRNA, ολικό RNA αλλά και πλασμιδιακό DNA χωρίς όμως κάποιο αποτέλεσμα στις συνθήκες που πραγματοποιήθηκε η αντίδραση, παρότι άλλες πρωτεΐνες που φέρουν το μοτίβο των Alba πρωτεϊνών έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μόρια DNA ή δίκλωνα τμήματα RNA. Τέλος, για τις DRpp20, DRpp40 αλλά και το ολοένζυμο, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για δραστικότητα ΑΤΡασης κυρίως εξαιτίας της ομολογίας της πρώτης με την Rpp20 του ανθρώπου που διαθέτει τέτοια ιδιότητα, χωρίς να ανιχνεύεται μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης σημαντική ομολογία με αντίστοιχα ένζυμα. Στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν δεν ανιχνεύτηκε δραστικότητα ΑΤΡασης που να σχετίζεται με κάποια από τις δύο πρωτεΐνες ή το ολοένζυμο. Ο απώτερος στόχος μας είναι ο προσδιορισμός της ελάχιστης λειτουργικής δομής καθώς και η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και RNA-πρωτεΐνης στο ολοένζυμο της RNase P. Η ολοκλήρωση της μελέτης θα συμβάλλει στην κατανόηση του καταλυτικού μηχανισμού και της εξέλιξης της ριβονουκλεάσης Ρ από ένα αρχέγονο ριβοένζυμο σε ένα υψηλά οργανωμένο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous and essential ribonucleoprotein enzyme that matures the 5´ end of all primary tRNA transcripts. It has been studied from a variety of organisms, representing the three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya), as well as from the major subcellular organelles, mitochondria and chloroplasts [Frank and Pace 1998, Xiao et al. 2002]. RNase P enzymes contain a similar in size RNA subunit which is absolutely required for catalysis. However, the size and number of protein subunits of the holoenzyme varies significantly, from one small subunit in bacteria to ten subunits in human RNase P [Frank and Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. The RNA subunit from bacteria and some archaea is catalytically active in vitro in high ionic strength and in the absence of the protein fraction of RNase P [Guerrier-Takada et al.1983, Pannucci et al. 1999]. No such activity has been proven yet for eukaryotic RNA subunit but is still considered to be intrinsically a ribozyme [Frank et al. 2000]. Dictyostelium discoideum RNase P holoenzyme is a ribonucleoprotein complex, consisted of RNA and proteins essential for catalytic activity. Considering its buoyant density, D. discoideum RNase P exhibits one of the most proteinaceous idiosyncrasies, among the characterized holoenzymes of eukaryotic origin [Stathopoulos et al. 1995]. Although it has been established that this enzyme contains both RNA and protein components, very little is known on the exact composition of the ribonucleoprotein complex. A recent report identified a putative RNA subunit of D. discoideum RNase P of length of 369 nucleotides through phylogenetic comparative analysis [Marquez et al. 2005]. Genomic analysis of the available data from D. discoideum sequencing projects, revealed among others the existence of two open reading frames (drpp20 and drpp40) encoding two proteins (DRpp20 and DRpp40) that show significant similarity to previously characterized proteins subunits Rpp20 and Rpp40 from human RNase P. The encoded protein DRpp20 has a predicted molecular mass of 26,4 KD, pI 5,6 and exhibits significant similarity to characterized human RNase P protein subunit, Rpp20 (34% identity, 56% similarity at a length of 140 amino acids). Likewise, the protein DRpp40 of a predicted mass of 48,2 KD and pI 5,5, displays significant similarity to its human counterpart, Rpp40 (26% identity, 45% similarity at a length of 302 amino acids). DRpp20 harbors a region of low complexity (rich in threonine residues) which confers to higher MW in comparison with the human homologue. Such regions have not been encountered so far in proteins of this kind in other organisms. Tandem repeats at the genomic and the protein level, are abundant in D. discoideum [Eichinger et al. 2005] and it remains to be proven if these features contribute to the structure and function of DRpp proteins. To the best of our knowledge no homologues of DRpp20 and DRpp40 have been identified in yeast and archaeal RNase P enzymes. Additionally, pattern search of the D. discoideum protein sequences using MetaServer and Pfam prediction tools identified a DRpp20 region (amino acids 56 to 126) that bears similarity to the Alba domain. PSORT analysis of DRpp20 and DRpp40 predicts that these proteins are likely to localise into the nucleus. In this study the putative ORFs were subcloned into pET-29 expression vector and the recombinant vectors were used for the transformation of BL21(DE3)pLysS. The recombinant polypeptides were purified from the cell extract using Ni2+-nitriloacetic acid agarose column. The purified proteins are isolated in their native form as supported by circular dichroism analysis of the preparations. These preparations were used for the production of polyclonal antibodies as well as functional studies as described below. DRpp20 and DRpp40 are functionally associated with the RNase P ribonucleoprotein catalytic complex. Using anti-DRpp20 and anti-DRpp40 polyclonal antibodies we ascertained the concurrence of DRpp20 and DRpp40 with purified RNase P activity after standard purification schemes. Moreover, the nature of this association permits the precipitation of RNase P activity through antigen-antibody interaction using the same antibodies. RNA-proteins interactions between the protein subunits, the RNA moiety and/or the RNA substrate are expected in the holoenzyme complex, and therefore the ability of DRpp40 and DRpp20 to bind to RNA molecules was investigated. In a series of experiments using a variety of binding partners (plasmids, tRNAs and total RNA), we did not detect any DNA or RNA binding properties for DRpp20 and DRpp40, although other proteins that contain the Alba core interact with DNA or double stranded RNA regions. Although neither DRpp20 nor DRpp40 harbours an ATPase domain, we tested DRpp40 and DRpp20 for ATPase activity mostly due to the latter homology with human Rpp20, which was shown to have ATPase activity. We could not detect any ATPase activity associated with aforementioned proteins or holoenzyme. Our future prospects are the determination of minimal catalytic core and the complete mapping of all protein-protein and RNA-protein interactions within RNase P holoenzyme. The completion of this project will contribute in a decisive manner to the understanding of both the catalytic mechanism and the evolution of RNase P from a primordial ribozyme to a highly organized ribonucleoprotein complex.

No / Trafficking motifs present in the intracellular regions of ion channels affect their subcellular location within neurons. The mechanisms that control trafficking to dendrites of central neurons have been identified, but it is not fully understood how channels are localized to the soma. We have now identified a motif within the calcium-activated potassium channel K(Ca)2.1 (SK1) that results in somatic localization. Transfection of hippocampal neurons with K(Ca)2.1 subunits causes expression of functional channels in only the soma and proximal processes. By contrast, expressed K(Ca)2.3 subunits are located throughout the processes of transfected neurons. Point mutation of K(Ca)2.1 within this novel motif to mimic a sequence present in the C-terminus of K(Ca)2.3 causes expression of K(Ca)2.1 subunits throughout the processes. We also demonstrate that blocking of clathrin-mediated endocytosis causes K(Ca)2.1 subunit expression to mimic that of the mutated subunit. The role of this novel motif is therefore not to directly target trafficking of the channel to subcellular compartments, but to regulate channel location by subjecting it to rapid clathrin-mediated endocytosis.