Ο μυξομύκητας Dictyostelium discoideum είναι εξελικτικά κατώτερος ευκαρυωτικός οργανισμός και η RNase P από αυτόν είναι ένα εξαιρετικά ενδιαφέρον ένζυμο, δεδομένου του ότι, το ένζυμο αυτό προσφέρεται για σύγκριση, τόσο με ένζυμα RNase P ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, όσο και με τα καλύτερα χαρακτηρισμένα βακτηριακά ολοένζυμα. Η RNase P του D. discoideum έχει βρεθεί ότι είναι και αυτή ένα ριβονουκλεοπρωτεΐνικό σύμπλοκο, που αποτελείται από μία RNA υπομονάδα και από οχτώ πρωτεϊνικές υπομονάδες. Στην εργασία αυτή έγινε προσπάθεια να κλωνοποιηθεί και να χαρακτηριστεί μια επιπλέον πρωτεΐνική υπομονάδα, η DPop5, πέραν των τεσσάρων που έχουν ήδη κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί από το εργαστήριο του κ. Δραΐνα (DRpp20, DRpp30, DRpp40, DRpp29), έτσι ώστε να δοθεί επιπλέον πληροφορία για την ολοκλήρωση της αρχιτεκτονικής του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση του γονιδίου και υπερέκφραση αυτής μέσω ενός συστήματος έκφρασης, το οποίο βασίζεται στην παραγωγή χιμαιρικών πρωτεϊνών, αποτελούμενων από την πρωτεΐνη-στόχο και τη βακτηριακή συνοδό πρωτεΐνη, HSP70 ή DnaK. Στη συνέχεια, αφού ακολούθησε καθαρισμός της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της και η παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτής. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της καθώς και η μοντελοποίηση αυτής in silico έδειξαν ότι η πρωτεΐνη αυτή είναι αρνητικά φορτισμένη (pI 5.19) και ότι έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με RNA μόρια, μέσω ενός χαρακτηριστικού μοτίβου πρόσδεσης σ’ αυτά. Περαιτέρω πειραματικές διαδικασίες βρίσκονται σε εξέλιξη έτσι ώστε να αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος της στο ολοένζυμο. / Cloning and characterization of DPop5 protein subunit from Dictyostelium discoideum ribonucleoprotein complex RNase P.

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα πανταχού παρόν ένζυμο, το οποίο είναι απαραίτητο για την ωρίμανση του 5’ άκρου των πρόδρομων tRNA μορίων. Δρα ενδονουκλεολυτικά προκαλώντας θραύση της 5’ επιπρόσθετης οδηγού αλληλουχίας στα πρόδρομα μετάγραφα των tRNA, παράγοντας τα ώριμα μόρια. Η RNase P έχει ανιχνευθεί σε αντιπροσώπους και των τριών φυλογενετικών περιοχών (βακτήρια, αρχαία, ευκαρυώτες), καθώς επίσης σε μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες, με μοναδική εξαίρεση το αρχαίο Nanoarchaeum equitans και το υπερθερμόφιλο βακτήριο Aquifex aeolicus. Σε όλους σχεδόν τους οργανισμούς, η RNase P είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από μία απαραίτητη RNA υπομονάδα και ποικίλο αριθμό πρωτεϊνών. Στη βιβλιογραφία μέχρι τώρα έχουν αναφερθεί μόνο δύο εξαιρέσεις, αυτές των ανθρώπινων μιτοχονδρίων και των πλαστιδίων του φυτού A. thaliana, των οποίων η RNase P είναι αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η RNA υπομονάδα είναι υπεύθυνη για την καταλυτική λειτουργία του ολοενζύμου της RNase P από τα βακτήρια, τα αρχαία και τους ευκαρυώτες. Οι πρωτεϊνικές υπομονάδες είναι απαραίτητες για την κατάλυση in vivo και παίζουν ποικίλους ρόλους στη δομή και λειτουργία του ολοενζύμου. Η παρούσα διπλωματική εργασία έχει ως σκοπό την λειτουργική μελέτη επί των υπομονάδων του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της RNase P από τον μυξομύκητα Dictyostelium discoideum. Η πυρηνική RNase P από το D. discoideum είναι το πιο πλούσιο, σε πρωτεϊνική σύσταση (πυκνότητα επιπολής, 1.23 g/ml), ολοένζυμο ανάμεσα στα ευκαρυωτικά ένζυμα RNase P που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από μια RNA υπομονάδα και οχτώ πρωτεΐνες (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). Αυτές οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν ομοιότητες με τις ομόλογές τους από ανώτερα ευκαρυωτικά ένζυμα, όπως του ανθρώπου, ενώ παράλληλα διατηρούν ιδιοσυγκρασιακά χαρακτηριστικά. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφουμε την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνικών υπομονάδων DRpp30 και DPop5 μεταξύ τους, καθώς και με την RNA υπομονάδα της RNase P του D. discoideum. Συγκεκριμένα μελετήθηκε ο ενδεχόμενος σχηματισμός ενός ελάχιστα καταλυτικού πυρήνα της RNase P με την διεξαγωγή πειραμάτων ομόλογης ανασύστασης με την RNA υπομονάδα παρουσία των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών DRpp30 και DPop5. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA). Ακολούθησαν πειράματα ανάλυσης αποτυπώματος (Footprinting Analysis) αλλά και πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης (co-immunoprecipitation) των πρωτεϊνών, έτσι ώστε να υπάρξουν παραπάνω δεδομένα για τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Τα παραπάνω αποτελέσματα θα συμβάλλουν στην συνολική μελέτη του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της RNase P από τον D. discoideum. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous enzyme, found in representatives of all domains of life (bacteria, archaea, eukarya), as well as in subcellular organelles, that endonucleolytically cleaves all precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. In almost every organism, RNase P is a ribonucleoprotein complex, with one essential RNA and one to ten protein subunits. RNase P from Dictyostelium discoideum is the most proteinaceous holoenzyme among the eukaryal RNase Ps studied so far and is comprised of an RNA and eight probable protein subunits (DPop1, DPop5, DRpp20, DRpp21, DRpp25, DRpp29, DRpp30 and DRpp40) as revealed by sequence similarity. Herein, we present preliminary functional studies in the interaction between the protein subunits DPop5 and DRpp30, as well as with the RNA subunit of RNase P from D. discoideum. Particularly we investigated if these protein subunits with the RNA subunit could form a minimal consensus RNase P core, conducting reconstitution assays with the RNA subunit in the presence of the recombinant proteins DPop5 and DRpp30. Furthermore using Electrophoretic mobility shift assays, EMSAs, footprinting analysis and co-immunoprecipitation assays we studied thoroughly the interactions between the recombinant proteins and with the RNA subunit, in aim to discover possible areas of interaction on the RNA subunit. Our data will give new insights and expand our knowledge about the ribonucleoprotein complex of RNase P from the slime mold Dictyostelium discoideum.