Bacterial elongation factor P (EF-P) is a poorly understood soluble protein that has been
shown to enhance the first step of peptide bond formation through an interaction with the
ribosome and initiator tRNA. The crystal structure of EF‐P shows that EF‐P mimics the tRNA
shape. Orthologous proteins have been found in both archaeal and eukaryotic systems, known
as aIF5A and eIF5A, respectively. eIF5A, which was recently shown to increase translation
elongation rates, is post-translationally modified at a highly conserved lysine residue (K50)
through the addition of the rare amino acid hypusine. A similar pathway was recently
elucidated for EF-P, in which EF-P is post-translationally modified by the enzymes YjeA and YjeK
at lysine 34, corresponding to a homologous site of hypusylation in a/eIF5A. As a paralog of
class II LysRS, YjeA catalyzes the addition of lysine onto EF-P, but is incapable of modifying
tRNA. YjeK is a 2,3-(β)-lysine aminomutase and is responsible for converting lysine to β-lysine,
which YjeA was recently shown to recognize as a preferred substrate for EF-P modification.
However, fully modified EF-P requires a third enzyme, YfcM, which acts as a hydroxylase and
hydroxylates the C4 or C5 position of K34 of EF-P, but not the added β-lysine.
Based on a complete description of the EF-P modification and pathway, in this project
we focused on further studies to address the mechanism of action of EF-P and especially to
investigate how the different stages of EF-P’s modifications can affect E. coli cells. Using E. coli
Keio knockout collection (Δefp, ΔyjeK, ΔyjeA, ΔyfcM) and E. coli Keio parental strain (wild-type)
as reference, we checked the effect of the deletion strains on the cells under different
environmental stress conditions (varying growth temperatures and nutrition conditions,
susceptibility to antibiotics), showing that Δefp strain has growth defects and that E. coli efp
mutants show sensitivity to non-ribosomal inhibitors, such as ampicillin and rifampicin,
suggesting a possible secondary role of EF-P related to the cell envelope. Moreover, we tested
the ability of deletion strains to restore viability in the presence of the appropriate plasmid and
showed that EF-P is important for cell viability under certain conditions in E. coli. As reported
previously, YjeA and YjeK are important in bacteria virulence. In addition, EF‐P is recognized as
one of the proteins important for bacteria motility in Bacillus subtilis. However, motility and
virulence are often linked together. Here, we tested deletion strains for their ability to produce
flagella. Further, using external fluorescence staining and confocal microscopy we revealed
differences in morphology of the E. coli deletion strains, and we performed Histidine tag
protein purification with Ni-NTA agarose beads and gel filtration, in order to purify YfcM, an
uncharacterized protein, and set initial screens for crystallization. Finally, our future goal is to
clone the following polycistronic construct, “- yjeK - yjeA - yfcM - his-efp -“, overexpress and
crystallize it, so as to see the crystal structure of the whole modification pathway of EF-P and
study better the function of EF-P in translation extracts from different mutants / Ο βακτηριακός παράγοντας επιμήκυνσης EF-P, είναι μια διαλυτή πρωτεΐνη που βοηθά
στο σχηματισμό του πρώτου πεπτιδικού δεσμού, αλληλεπιδρώντας με το ριβόσωμα και το
εναρκτήριο tRNA. Η κρυσταλλική δομή του EF-P δείχνει ότι μιμείται στη μορφή το tRNA.
Ορθόλογες πρωτεΐνες έχουν βρεθεί και στα αρχαία και τα ευκαρυωτικά κύτταρα, γνωστές ως
aIF5A και eIF5A, αντίστοιχα. Ο eIF5A, για τον οποίο αποδείχθηκε πρόσφατα ότι συμμετέχει και
στο στάδιο της επιμήκυνσης της μετάφρασης, υφίσταται μια μοναδική μετα-μεταφραστική
τροποποίηση στη λυσίνη 50 (Κ50), μέσω της προσθήκης σε αυτή ενός σπάνιου αμινοξέος, της
υπουσίνης (hypusine). Μια παρόμοια τροποποίηση αποδείχθηκε ότι υφίσταται ωστόσο και ο
EF-P της Escherichia coli (E. coli), ο οποίος τροποποιείται μετα-μεταφραστικά στη λυσίνη 34
(Κ34) με τη βοήθεια των ενζύμων YjeA και YjeK. Το YjeA αποτελεί παράλογο της δεύτερης
κλάσης των tRNA συνθετασών της λυσίνης (LysRSs: Lysyl-tRNA synthetases), και καταλύει την
προσθήκη της λυσίνης επάνω στον EF-P. Το YjeK είναι μια 2,3 αμινομουτάση της λυσινης (LAM:
Lysine-2-3-aminomutase) και είναι αρμόδια για τη μετατροπή της α-λυσίνης σε β-λυσίνη.
Εντούτοις, πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι ο πλήρως τροποποιημένος EF-P απαιτεί ένα
επιπλέον ένζυμο, το YfcM, το οποίο ενεργεί ως υδροξυλάση και υδροξυλιώνει τον C4 ή C5
άνθρακα της K34 του EF-P.
Στη συγκεκριμένη μελέτη εστιάσαμε στην εξέταση του μηχανισμού δράσης του EF-P και
ειδικότερα στις επιπτώσεις που μπορεί να έχουν τα διαφορετικά στάδια των τροποποιήσεών
του σε κύτταρα E. coli. Χρησιμοποιώντας τα knockout E. coli στελέχη της Keio (Δefp, ΔyjeK,
ΔyjeA, ΔyfcM), ελέγξαμε την επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών συνθηκών στα στελέχη
(διαφορετικές θερμοκρασίες, συνθήκες διατροφής, ευαισθησία σε αντιβιοτικά), δείχνοντας ότι
το Δefp στέλεχος έχει μειωμένη αύξηση και ότι τα μεταλλαγμένα στελέχη παρουσιάζουν
ευαισθησία σε μη-ριβοσωματικούς αναστολείς, όπως για παράδειγμα την αμπικιλίνη και τη
ριφαμπικίνη. Επιπλέον, εξετάσαμε τη δυνατότητα των μεταλλαγμένων στελεχών να
ανακάμπτουν στην ανάπτυξή τους παρουσία του κατάλληλου πλασμιδίου και είδαμε ότι ο EFP
είναι σημαντικός για την in vivo ανάπτυξη της E. coli σε στρεσσογόνες καταστάσεις. Όπως
αναφέρθηκε πρόσφατα, οι YjeA, YjeK και EF-P πρωτεΐνες συμβάλουν στη μείωσης της
τοξικότητας στη Salmonella. Επιπλέον, έχει δειχθεί πως ο EF-P είναι μια από τις πρωτεΐνες,
που παίζουν σημαντικό ρόλο στην κινητικότητα των βακτηρίων στο Bacillus subtilis. Ωστόσο,
έρευνα των Josenhans και Suerbaum το 2002, έδειξε πως η κινιτηκότητα και η τοξικότητα
συχνά συνδέονται μεταξύ τους. Έτσι εξετάσαμε, τα μεταλλαγμένα στελέχη για την ικανότητά
τους να κινούνται, δημιουργώντας μαστίγια, σε semi-solid θρεπτικό υλικό. Περαιτέρω έρευνες
χρησιμοποιώντας external fluorescence staining και confocal microscopy, αποκαλύψε
διαφορές στη μορφολογία των μεταλλαγμένων στελεχών της E. coli. Επίσης, με στόχο τη
μελέτη της πρωτεΐνης YfcM, η λειτουργία της οποίας δεν είναι ακόμη γνωστή, απομονώσαμε
και καθαρίσαμε την YfcM, με Νi-NTA agarose beads και gel filtration για τη μελλοντική
κρυσταλοποίησή της,. Τέλος, μελλοντικός στόχος μας είναι η κλωνοποίηση του ακόλουθου
πολυκιστρονικού γονιδίου “- yjeK - yjeA - yfcM - Ηis-efp - “, με σκοπό την υπερέκφραση και την
κρυσταλλοποίησή του, ώστε να λάβουμε μια εικόνα του πως μοιάζει ολοκληρωμένο το
μονοπάτι της τροποποίησης του EF-P, και επιπλέον, να μελετήσουμε καλύτερα τη λειτουργία
του EF-P σε εκχυλίσματα της μετάφρασης από διαφορετικές μεταλλάξεις..
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/5444 |
| Date | 17 September 2012 |
| Creators | Σταυροπούλου, Μαρία |
| Contributors | Ντίνος, Γεώργιος, Stavropoulou, Maria, Καλπαξής, Δημήτριος, Wilson, Daniel, Ντίνος, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | English |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0022 seconds