Το ριβοσωματικό RNA (rRNA) παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της ακριβούς αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας. Σύμφωνα με πρόσφατες κρυσταλλικές δομές υψηλής ευκρίνειας της μικρής υπομονάδας του προκαρυωτικού ριβοσώματος, η περιοχή αποκωδικοποίησης αποτελείται κυρίως από rRNA, περιλαμβάνοντας κυρίως τις έλικες 18 και 34, καθώς και τις αδενίνες Α1492 και Α1493 της έλικας 44 του 16S rRNA. Επιπροσθέτως, ο ρόλος του rRNA στην ακριβή αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας έχει αποκαλυφθεί εκτενώς μέσω κατασταλτικών ή αντικατασταλτικών μεταλλάξεων, οι οποίες αυξάνουν ή μειώνουν τη λανθασμένη ανάγνωση του mRNA, αντίστοιχα. Πολλές από τις μεταλλάξεις αυτές αφορούν στο 16S rRNA της Escherichia coli. Μεταξύ αυτών είναι η μετάλλαξη C310G στην έλικα 12, η G1206C στην έλικα 34 και η G517A στην έλικα 18. Στο πρώτο μέρος της παρούσης μελέτης εξετάσθηκε το αντίκτυπο των αντίστοιχων μεταλλάξεων com1 (C310G), com6 (G1206C) και rdn2 (G517A) στο 18S rRNA του Saccharomyces cerevisiae. Τα κύτταρα yeast μετασχηματίστηκαν με rDNA πλασμίδια αγρίου-τύπου (wt) ή μεταλλαγμένα, τα οποία έφεραν τις προαναφερθείσες μεταλλάξεις. Τα κύτταρα που ελέγχθηκαν ήταν το αγρίου τύπου (rdnwt), τα μεταλλάγματα rdn2, com1, καθώς και τα διπλά μεταλλάγματα com1rdn2 και com6rdn2. Το αντίκτυπο της μετάλλαξης com6 εξήγχθη έμμεσα από το διπλό μετάλλαγμα com6rdn2, αφού το μετάλλαγμα com6 δεν ήταν διαθέσιμο στο Εργαστήριο (Τα στελέχη αυτά χορηγήθηκαν από το Εργαστήριο της Dr Susan Liebman, University of Illinois at Chicago, USA). Όσον αφορά στη μελέτη ανάπτυξης των στελεχών αυτών, τα στελέχη com1 παρουσίασαν εξαιρετικά αργή ανάπτυξη παρουσιάζοντας 3 φορές αύξηση του χρόνου διπλασιασμού τους σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt. Αντίθετα, το μετάλλαγμα rdn2 παρουσίασε παρόμοιο φαινότυπο ανάπτυξης με τα rdnwt. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα διπλά μεταλλάγματα com1rdn2 και com6rdn2 παρουσίασαν μικρότερο χρόνο διπλασιασμού από τα κύτταρα rdnwt. Όσον αφορά στη μεταφραστική ακρίβεια, το μετάλλαγμα com1 παρουσίασε 1,5 φορά αύξηση στο ρυθμό λανθασμένης ενσωμάτωσης του αμινοξέος λευκίνη σε μία αυξανόμενη αλυσίδα πολυφαινυλαλανίνης κατά την in vitro μετάφραση ενός poly(U) εκμαγείου, σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt. Αντίθετα, η μετάλλαξη rdn2 οδήγησε σε μεταφραστική υπερακρίβεια, αφού δεν βρέθηκε καμία ενσωμάτωση λανθασμένου αμινοξέος ανά 10.000 κωδικόνια mRNA. Το διπλό μετάλλαγμα com1rdn2 εμφάνισε παρόμοια επίπεδα μεταφραστικής ακρίβειας με κύτταρα rdnwt. Έτσι, οι μεταλλάξεις com1 και rdn2 επηρρεάζουν τη μεταφραστική ακρίβεια σε ίσο βαθμό, αλλά προς αντίθετες κατευθύνσεις. Το άλλο διπλό μετάλλαγμα της παρούσης μελέτης com6rdn2 παρουσίασε επίσης παρόμοια επίπεδα μεταφραστικής ακρίβειας με το rdnwt, αποκαλύπτοντας έτσι πως η μετάλλαξη com6 οδηγεί επίσης σε μείωση της μεταφραστικής πιστότητας. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το αντίκτυπο των μεταλλάξεων com1, com6 και rdn2 στην ακρίβεια της μετάφρασης είναι ανεξάρτητο και προσθετικό και όχι συνεργιστικό. Επιπρόσθετη επιβεβαίωση προήλθε με την in vitro μετάφραση εκμαγείων poly(U) παρουσία παρομομυκίνης (PM), ενός αμινογλυκοζιτικού αντιβιοτικού γνωστού για την αύξηση της ενσωμάτωσης λανθασμένων αμινοξέων στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα τόσο στα προκαρυωτικά, όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το στέλεχος com1 παρουσίασε 3 φορές αύξηση στη συχνότητα λάθους κατά τη μετάφραση σε σχέση με το rdnwt, επιβεβαιώνοντας το χαρακτηρισμό του ώς επιρρεπές σε λάθη μετάλλαγμα. Αντίθετα, το στέλεχος rdn2 εμφάνισε μισή περίπου συχνότητα λαθών κατά τη μετάφραση σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt, σε συμφωνία με το προηγούμενο χαρακτηρισμό του ως υπερακριβές μετάλλαγμα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με in vivo μελέτες ανθεκτικότητας έναντι της PM τόσο σε υγρές όσο και σε στερεές καλλιέργειες (τρυβλία petri). Το μετάλλαγμα com1 βρέθηκε το πιο ευαίσθητο όλων, αφού το 50% αναστολής της ανάπτυξής του παρατηρήθηκε σε μόλις 5 μΜ PM σε σχέση με τα 75 μΜ για το στέλεχος rdnwt. Αντίθετα, η τιμή IC50 της PM για το rdn2μετάλλαγμα βρέθηκε ίσο προς 500 μΜ. Το διπλό μετάλλαγμα com1rdn2 παρουσίασε παρόμοια επίπεδα ευαισθησίας στην PM με rdnwt, ενώ το άλλο διπλό μετάλλαγμα com6rdn2 αποδείχθηκε ως πιο ανθεκτικό (IC50 = 125 μΜ), υποδηλώνοντας ότι η com6 πρέπει να είναι λιγότερο επιρρεπής σε λάθη σε σχέση με την com1 μετάλλαξη. Πειράματα in vivo ανθεκτικότητας στην PM (σε τρυβλία petri) επιβεβαίωσαν τα επίπεδα ευαισθησίας που αποκαλύφθηκαν με τις υγρές καλλιέργειες. Η μελέτη των μεταλλάξεων αυτών ολοκληρώθηκε με πειράματα πρόσδεσης στις θέσεις A και P του ριβοσώματος. Οι μεταλλάξεις που μειώνουν την μεταφραστική πιστότητα οδηγούν και σε αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης μορίων αμινο-ακυλο tRNA (aa-tRNA) στη θέση Α του ριβοσώματος, ενώ αντίθετα οι μεταλλάξεις που αυξάνουν την ακρίβεια της μετάφρασης συνοδεύονται και από μείωση της ικανότητας πρόσδεσης aa-tRNAs στη θέση Α του ριβοσώματος. Με τέτοιες μελέτες βρέθηκε ότι η μετάλλαξη com1 οδήγησε σε αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης στη θέση Α, αντίθετα με την rdn2, όπου διαπιστώθηκε ακόμη μικρότερη ικανότητα πρόσδεσης και σε σχέση με τα ριβοσώματα αγρίου τύπου. Τα διπλά μεταλλάγματα έδειξαν λίγο μεγαλύτερη ικανότητα πρόσδεσης σε σχέση με αυτά του αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωσαν το χαρακτηρισμό των com1 και com6 ως μεταλλάξεις μείωσης της μεταφραστικής ακρίβειας σε αντίθεση με τη μετάλλαξη rdn2, η οποία οδηγεί σε υπερακρίβεια. Όσον αφορά στην ικανότητα πρόσδεσης aa-tRNAs στη θέση P του ριβοσώματος σε σχέση με τα ριβοσώματα αγρίου τύπου (rdnwt), αυτή βρέθηκε μεγαλύτερη στην περίπτωση της com1 μετάλλαξης και μικρότερη στην περίπτωση της rdn2 μετάλλαξης, υποδηλώνοντας ότι η com1 οδηγεί σε μεγαλύτερο ρυθμό πρωτεϊνοσύνθεσης σε σχέση με την υπερακριβή rdn2 μετάλλαξη. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε σε συνεργασία με το Εργαστήριο Βιοχημείας του κ. Χρήστου Γεωργίου (Τμήμα Βιολογίας, Παν. Πατρών), για το άν υπάρχει κάποια συσχέτιση μεταξύ της μεταφραστικής πιστότητας και του οξειδωτικού στρες στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε δύο καλά μελετημένα μεταλλαγμένα στελέχη S. cerevisiae στο Εργαστήριό μας με αντίθετες επιπτώσεις στη μεταφραστική ακρίβεια. Αυτά ήταν το sup45 μετάλλαγμα (επιρρεπές σε λάθη με συχνότητα λάνθασμένης ενσωμάτωσης αμινοξεών ίση προς 0,0166) καθώς και το τριπλό μετάλλαγμα sup45rdn4rdn6 (συχνότητα λάθους: 0,0057), στο οποίο γίνεται η επαναφορά της μεταφραστικής ακρίβειας στα επίπεδα των μορίων αγρίου τύπου (0,0036). Οι μεταλλάξεις rdn4 και rdn6 αφορούν στην έλικα 27 του 18S rRNA, ενώ η μετάλλαξη sup45 πρόκειται για μία κατασταλτική μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί για τον πράγοντα τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης eRF-1. Οι οξειδωτικοί δείκτες που μετρήθηκαν ήταν η μαλονική διαλδεϋδη (MDA: κύριο προϊόν υπεροξείδωσης λιπιδίων), η οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSSG), οξειδωμένα μη πρωτεϊνικά μόρια (NPSSR), καθώς και οξειδωμένα πρωτεϊνικά μόρια (PSSP). Οι αντιοξειδωτικοί δείκτες που μετρήθηκαν ήταν τα ανηγμένα πρωτεϊνικά μόρια που φέρουν ελεύθερες σουλφυδρυλομάδες (PSH), καθώς και το κλάσμα PSH/PSSP μέσα στα κυτταρικά εκχυλίσματα. Εν συντομία, το επιρρεπές σε λάθη κατα τη μετάφραση μετάλλαγμα sup45 μείωσε τα επίπεδα των οξειδωτικών δεικτών σε αντίθεση με το πιο ακριβές τριπλό μετάλλαγμα sup45rdn4rdn6, στο οποίο παρατηρήθηκε αύξηση των δεικτών αυτών. Περαιτέρω επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων αυτών προήλθε με την χρήση παρομομυκίνης κατά την ανάπτυξη των στελεχών αυτών (μειώνει τη μεταφραστική πιστότητα) και τη διεξαγωγή των μετρήσεων αυτών των δεικτών οξειδωτικού στρες εκ νέου. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με χρήση PM έδειξαν στις περισσότερες περιπτώσεις σημαντική μείωση των επιπέδων οξειδωτικού στρες. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα του δεύτερου μέρους της Μεταπτυχιακής αυτής Διατριβής υποδηλώνουν ότι στα ευκαρυωτικά κύτταρα η μείωση της μεταφραστικής πιστότητας οδηγεί σε μείωση του οξειδωτικού στρες σε αυτά και το αντίστροφο. / The ribosomal RNA (rRNA) plays a key role in the process of the accurate decoding of genetic information. According to recently derived high-resolution crystal structures of the prokaryotic small ribosomal subunit, the decoding site is mainly composed of RNA, including helices 18 and 34 as well as adenines A1492 and A1493 of helix 44 of the 16S rRNA. Furthermore, the role of ribosomal RNA in the accurate decoding of genetic information has been largely uncovered by suppressor or antisuppressor mutations that increase or decrease misreading respectively. Many of these mutations are in 16S rRNA of Escherichia coli. Among these are C310G in helix 12, G1206C in helix 34 and G517A in helix 18. In the first part of this study we examined the function of the corresponding mutations com1 (C310G), com6 (G1206C) and rdn2 (G517A) in 18S rRNA of Saccharomyces cerevisiae. Yeast cells were transformed with wild-type or mutant rDNA plasmids carrying the afore-mentioned site-directed mutations. The strains examined were the wild-type (rdnwt), mutants rdn2, com1 and the double mutants com1rdn2 and com6rdn2. The properties of mutation com6 were only deduced from the double mutant com6rdn2, since mutation com6 was not available individually. The mutants were first constructed in Prof. Susan Liebman’s laboratory at the University of Illinois at Chicago, USA. Strains com1 were viable but exhibited an extraordinary slow growth phenotype as they displayed a 3-fold increase of their doubling time over the rdnwt. On the other hand, rdn2 mutants displayed a growth phenotype similar to that of rdnwt cells. Interestingly, the double mutants com1rdn2 and com6rdn2 abolished the slow growth phenotype and grew faster than rdnwt. Regarding translational accuracy, com1 mutant displayed a 1.5-fold increase of the rate of misincorporation of the nearcognate amino acid leucine in a growing polyphenylalanine chain with poly(U) as template over rdnwt. In contrast, mutation rdn2 displayed impressive hyperaccuracy as it was found that none nearcognate aminoacid is added in 10.000 mRNA codons. Moreover, the double mutant com1rdn2 exhibited misreading levels similar to those of the rdnwt. Thus, com1 and rdn2 affect the decoding process to an equal degree but in reverse ways. The other double mutant under study, com6rdn2 also displayed an error frequency similar to that of rdnwt revealing that com6 is an error-prone mutation as well. These results imply that the effects of mutations com1, com6 and rdn2 on translational accuracy are independent and additive rather than synergistic. Additional confirmation came by in vitro translation of poly(U) templates in the presence of paromomycin (PM), which is an aninoglycoside antibiotic known to induce suppression of the genetic code. Strain com1 displayed a 3-fold increase of error frequency over rdnwt, confirming its characterization as an error-prone mutant. In contrast, rdn2 displayed an error frequency about half of that observed for the rdnwt, compatible with its characterization as a hyperaccurate mutant. The previous results were confirmed by in vivo resistance studies toward PM in liquid cultures and on Petri plates. Mutant com1 was the most sensitive of all, as 50% inhibition of its growth was observed at only 5 μΜ PM compared to 75 μΜ for rdnwt. In contrast, the IC50 value of PM for the rdn2 mutant was 500 μΜ. The double mutant com1rdn2 exhibited a resistance to PM similar to rdnwt, and the other double mutant com6rdn2 was more resistant (IC50 = 125 μΜ), implying that com6 should be a less error-prone mutation than com1. In vivo resistance to PM (on petri dishes) confirmed the sensitivity levels found in liquid cultures. The study of these mutations was completed by A- and P-site binding experiments. An increase in A-site binding of aa-tRNA may arise from a higher affinity to accept noncognate tRNAs and is related to error-prone mutations, whereas a decrease is related to error-restrictive mutations. Binding of Phe-tRNA to A-site of com1 mutants was much higher than in rdnwt. In contrast, binding to A-site of rdn2 was much lower than in rdnwt. Finally, the double mutants showed an A-site binding capacity slightly higher than the wild-type. These results confirmed that com1 and com6 are error-prone mutations, whereas rdn2 an error-restrictive mutation. With regards to P-site, com1 displayed a higher binding capacity and rdn2 a lower binding capacity compared to wild-type, indicating that com1 may have a higher protein synthesis activity than rdn2. In the second part of this study, we (in cooperation with Dr Christos Georgiou’s lab; Dept. of Biology, University of Patras) investigated whether any correlation between the translational fidelity and oxidative stress exists in eukaryotic cells. We used mutants already studied in our lab for their effects on translational fidelity and other aspects of protein synthesis. These were the sup45 mutant encoding the eRF-1 release factor and the triple mutant sup45rdn4rdn6 which carries, in addition to sup45, mutations rdn4 and rdn6 in helix 27 of the 18S rRNA. Mutant sup45 is error-prone (E.F. = 0.0166), while rdn4, rdn6 are both error-restrictive. The triple mutant sup45rdn4rdn6 diplays an error frequency of 0.0057, equal to the sum of the error frequencies of the individual mutations. The error frequency of the rdnwt is 0.0036. The oxidative markers measured were malondialdehyde (MDA, the main product of lipid peroxidation), oxidized glutathione (GSSG), oxidized non protein molecules (NPSSR), and oxidized protein molecules (PSSP). On the other hand, the antioxidative markers measured were t reduced protein molecules carrying –SH groups (PSH), as well as the ratio PSH/PSSP in the cell. In brief, the error-prone mutant sup45 was shown to decrease the concentrations of the various oxidative markers, while the comparatively error-restrictive triple mutant sup45rdn4rdn6 was shown to increase them. To further test the hypothesis that the oxidative status of a yeast cell may be related to the level of translational accuracy, we repeated the above experiments using PM. Our results with PM showed in most cases a decrease in the concentrations of the various oxidative markers. This is compatible with the notion that an increase in translational errors causes a decrease in oxidative stress and vice versa.

Το ριβόσωμα παρέχει την πλατφόρμα πάνω στη οποία το mRNA αναγνωρίζεται και αποκωδικοποιείται από τα μεταφορικά RNAs. Δρα καταλυτικά ως ριβοένζυμο και συνθέτει την αντίστοιχη αλληλουχία αμινοξέων. Σημαντικά λειτουργικό κομμάτι του ριβοσώματος αποτελεί το τούνελ εξόδου, το οποίο βρίσκεται στη μεγάλη υπομονάδα του ριβοσώματος και αποτελεί το κανάλι, μέσω του οποίου οι νεοσυντιθέμενες πεπτιδικές αλυσίδες εξέρχονται στο κυτταροδιάλυμα. Νεότερες ερμηνείες προσδίδουν στο τούνελ εξόδου έναν πιο ενεργό ρόλο, καταδεικνύοντας τη σπουδαιότητά του όχι μόνο ως διάδρομος εξόδου της πεπτιδικής αλυσίδας, αλλά και ως λειτουργική περιοχή του ριβοσώματος με σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Το δίκτυο επικοινωνίας μεταξύ τούνελ και πεπτιδυλοτρανσφεράσης δεν έχει ακόμα χαρτογραφηθεί και μελετηθεί πλήρως, υπάρχουν όμως μέχρι στιγμής πολυπληθείς αναφορές που επιβεβαιώνουν ότι μέρος του αποτελούν κυρίως βάσεις του 23S rRNA, συστατικά του τοιχώματος της εισόδου στο τούνελ, και βάσεις ευρισκόμενες στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, συντηρημένες εξελεικτικά, γνωστές από την αλληλεπιδρασή τους με αναστολείς της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και κυρίως με αναστολείς της οικογένειας των μακρολιδίων. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε την αλληλεπίδραση των χαρακτηριστικών αυτών βάσεων που συγκροτούν το δίκτυο επικοινωνίας μεταξύ του τούνελ εξόδου και της πεπτιδυλοτρανσφεράσης με τη βοήθεια νέων μακρολιδίων τρίτης γενιάς, των κετολιδίων, που φέρουν επί πλέον και άτομα φθορίου, παρέχοντας έτσι στο μόριο μεγαλύτερη συγγένεια για φορτισμένες ομάδες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, αποτελούν εξαιρετικά υποσχόμενους αντιμικροβιακούς θεραπευτικούς παράγοντες, και αναστέλλουν ισχυρά την μετάφραση. Παράλληλα καταλαμβάνουν αμοιβαία αποκλειόμενες θέσεις στο ριβόσωμα, στην είσοδο του τούνελ, αλληλεπιδρώντας με τις βάσεις Α2058, Α2059, Α2062 και Α752. Επειδή όλες οι παραπάνω βάσεις αποτελούν μέρος του δικτύου επικοινωνίας τούνελ-πεπτιδυλοτρανσφεράσης, θα μπορούσαμε να συμπληρώσουμε τον ήδη υπάρχοντα μηχανισμό δράσης των μακρολιδίων (drop-off, λόγω αύξησης της koff) με την επικοινωνία του τούνελ με την πεπτιδυλοτρανσφεράση, ώστε να απενεργοποιηθεί η τελευταία με τελική κατάληξη τη διακοπή της πρωτεϊνικής σύνθεσης και την επαγωγή του drop-off. Για την περαιτέρω μελέτη της αλληλεπίδρασης του τούνελ με την νεοσυντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα, σχεδιάσθηκαν νέα πεπτιδυλο παράγωγα της χλωραμφανικόλης, τα οποία προσομοιάζουν πεπτιδυλο-tRNAs προσδεδεμένα στην Α-θέση του ριβοσώματος, με την ολιγοπεπτιδική αλληλουχία να εκτείνεται βαθύτερα στο τούνελ, υιοθετώντας μία ανοικτή διαμόρφωση. Όπως διαπιστώσαμε με συναγωνιστικές μελέτες με ραδιενεργό ερυθρομυκίνη, τα συγκεκριμένα ανάλογα καταλαμβάνουν την Α-θέση στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, ενώ η συγγένεια του κάθε αναλόγου ως αναστολέα της λειτουργίας του ριβοσώματος, είναι απόλυτα ιδιοσυγκρατική, καθώς εξαρτάται από την αλληλουχία των αμινοξέων που συγκροτούν το πεπτίδιο. Μελετώντας το αποτύπωμα των ενώσεων αυτών στο ριβόσωμα, διαπιστώσαμε ότι ενώ η βάση της χλωραμφαινικόλης διατηρεί τη θέση της στη περιοχή Α, το πεπτίδιο εισέρχεται βαθειά στην είσοδο του τούνελ, αλληλεπιδρώντας με την βάση Α752. Συνεπώς τα πεπτιδυλο ανάλογα της χλωραμφαινικόλης, τα οποία συμπεριφέρονται ως ισχυροί αναστολείς της μετάφρασης, αποτελούν κατάλληλα εργαλεία μελέτης της αλληλεπίδρασης μεταξύ της νεοσυντιθέμενης πεπτιδικής αλληλουχίας και στοιχείων του τούνελ εξόδου του ριβοσώματος. / Ribosomes translate the genetic code into proteins in all living cells with extremely high efficiency, owing to their inherent flexibility and to their spectacular architecture. These large ribonucleoprotein particles synthesize proteins in all cells, using messenger RNA as the template, confirming that the ribosome is indeed a ribozyme, and aminoacyl-transfer RNAs as substrates. As the nascent polypeptide chain is being synthesized, it passes through a tunnel within the large ribosomal subunit and emerges at the solvent side where protein folding occurs. New studies indicate that in some cases, the tunnel plays a more active role. Accumulated evidence had definitely concluded that ribosomal tunnel is not only a passive conduit for the nascent chains but a rather functionally important compartment, where specific peptide sequences establish direct interactions with the tunnel, talking back to the ribosome in order to regulate peptide synthesis, leading to translational stalling. In this study, we have investigated functional interactions between distinct locations of the ribosomal tunnel and specific residues of the peptidyltransferase, using new macrolides, known as ketolides, which carry also fluorine attached to the lactone ring either directly or indirectly. According to our results, the new antibiotics exhibited better antimicrobial activity, inhibiting strongly the translational apparatus and could be useful tools in the future for treatment of bacterial infections. Binding studies with radiolabeled erythromycin revealed that these drugs bound competitively with erythromycin at the large ribosomal subunit, with extremely low dissociation constants. In parallel, RNA footprinting indicated that the new ketolides occupy the main macrolide binding site in the ribosome, which is located at the entrance of the exit tunnel adjacent to the peptidyltransferase center. These drugs interact with A2058, A2059 and A2062, as well as their extended heteroaromatic alkyl-aryl side chain penetrates deeper in the tunnel protecting A752 of Helix 35, interacting with basepair A752-U2609. To explore further this interaction, we have synthesized new peptidyl conjugates of chloramphenicol, which resemble nascent peptidyl-tRNA chains bound to the A-site of the ribosome, with their peptide sequence located deeper within tunnel, adopting an extended configuration. According to our data, these compounds did indeed bind to the peptidyl transferase center, competing with radiolabelled- chloramphenicol for binding to the ribosome. The binding of each analog, as well as its inhibitory activity of ribosomal function, is absolutely idiosyncratic, depending on the sequence of amino acid of peptide moiety. Studying the footprinting pattern of these compounds on the ribosome, we confirmed that while the chloramphenicol base maintains its position on the A-site, the peptide moiety penetrates deeper in the entrance of the exit tunnel, interacting with nucleotide A752. Therefore, we believe that these chloramphenicol peptides could be useful tools for probing nascent polypeptide chain interaction with the ribosome.