H παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση της σχέσης του οξειδωτικού στρες με τη σκληρωτιακή διαφοροποίηση και την παραγωγή αφλατοξίνης του μύκητα Aspergillus flavus. Ο μύκητας αυτός έχει σπουδαία αγροτική σημασία διότι μπορεί να επιμολύνει αποθηκευμένους καρπούς. Επίσης μπορεί να αποτελεί παθογόνο μικροοργανισμό για τον άνθρωπο που σχετίζεται με ασπεργιλλώσεις των πνευμόνων και άλλες λοιμώξεις. Πολλά στελέχη παράγουν μεγάλες ποσότητες αφλατοξίνης, μιας καρκινογόνου και εξαιρετικά τοξικής ένωσης. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε ο ρόλος κεντρικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες όπως η λιπιδική και πρωτεϊνική υπεροξείδωση, η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση αλλά και συγκεκριμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων, καθώς και η επίδραση συγκεκριμένων αντιοξειδωτών στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση ενός στελέχους αγρίου τύπου σε σύγκριση με ένα μεταλλαγμένο μη σκληρωτιογόνο και μη αφλατοξινογόνο στέλεχος (ΔveA). Για την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής χρειάστηκε η ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών για την ποσοτικοποίηση στους μύκητες της ολικής πρωτεΐνης, και εξειδικευμένων θειολικών και λιπιδικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν μια σαφή συσχέτιση του οξειδωτικού στρες με τη διαφοροποίηση των σκληρωτιογόνων μυκήτων, αφού το αγρίου τύπου στέλεχος εμφανίζεται περισσότερο στρεσαρισμένο οξειδωτικά σε σύγκριση με το αδιαφοροποίητο μεταλλαγμένο στέλεχος. Η χορήγηση αντιοξειδωτών ανέστειλε πλήρως (με εξαίρεση το ασκορβικό οξύ) τη σκληρωτιογένεση του αγρίου τύπου στελέχους επιδρώντας διαφορετικά στις παραμέτρους του οξειδωτικού στρες, ενώ μείωσε έως ανέστειλε πλήρως τη βιοσύνθεση αφλατοξίνης, αποκαλύπτοντας τη συμμετοχή του οξειδωτικού στρες σε αυτές τις διαδικασίες. Τα αποτελέσματα της διατριβής εκτός από επιστημονικό ενδιαφέρον έχουν και πρακτική σημασία εξαιτίας της παθογένειας του συγκεκριμένου μύκητα τόσο στον άνθρωπο όσο και στα φυτά. / The present thesis aims to elucidate the relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation and aflatoxin production of the fungus Aspergillus flavus. This fungus has great agricultural importance because it can infect stored grains. It can also be a human pathogen, associated with aspergillosis of the lungs and other infections. Many strains produce significant quantities of aflatoxin, a carcinogenic and acutely toxic compound. In particular, the role of central parameters of oxidative stress such as lipid and protein peroxidation, thiol redox state and antioxidant enzymes, and the influence of certain related exogenous antioxidants were studied on the biosynthesis of aflatoxin, on the biogenesis of sclerotia in a wild type in comparative relationship with a non-sclerotiogenic and non-aflatoxigenic mutant strain (ΔveA). The experimental needs of this thesis necessitates the development of new methodologies for the precise quantification of certain thiol and lipid markers of oxidative stress and protein concentration. The results show a clear relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation since the wild type strain is more oxidatively stressed than the mutant non-differentiating strain. Administration of certain antioxidants completely inhibited sclerotiogenesis in the wild type strain (with the exception of ascorbic acid), and decreased or even halted the biosynthesis of aflatoxin, thus revealing an implication of oxidative stress on these processes. The results besides having scientific interest, have also practical importance since this fungi is both human and plant pathogen.

Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων». Σκοπός αυτής της έρευνας ήταν η διερεύνηση της επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου τόσο στην αύξηση όσο και στην αποτελεσματικότητα των εντομοπαθογόνων μυκήτων επί των προνυμφών του λεπιδοπτέρου Sesamia nonangrioides. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι εντομοπαθογόνοι μύκητες Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) και Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae) από την συλλογή του Μπενακείου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου των οποίων η διατήρηση έγινε στο εργαστήριο Φυσιολογίας Φυτών του τμήματος Βιολογίας με την μέθοδο των ημιεκλεκτικών υποστρωμάτων (Strasser et al. 1996). Στύλοι του καλλιεργούμενου Crocus sativus εκχυλίστηκαν με διάλυμα 50% v/v μεθανόλης σε νερό (3 mL/50 mg ξηρής δρόγης) για 4 h απουσία φωτός. Οι παραπάνω εντομοπαθογόνοι μύκητες καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία petri με θρεπτικό υλικό Sabouraud Dextrose Agar (S.D.A.) για διάστημα 5 ημερών παρουσία (3,0% v/v) και απουσία (100% S.D.A. αλλά και 98,5% S.D.A. - 1,5% μεθανόλης) εκχυλίσματος. Μετά το πέρας, διαπιστώθηκε ότι η παρουσία της μεθανόλης σε αυτήν τη συγκέντρωση δεν επηρέασε την ανάπτυξη κανενός μύκητα. Περαιτέρω, οι εντομοπαθογόνοι μύκητες B. bassiana και I. fumosorosea δεν επηρεάστηκαν από την παρουσία του εκχυλίσματος κρόκου στο υπόστρωμα ανάπτυξης, ενώ ο εντομοπαθογόνος μύκητας M. robertsii επηρεάστηκε θετικά (P<0,05, τεστ Bonferoni) από την παρουσία του εκχυλίσματος. Επιπροσθέτως μελετήθηκε η επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου στην αποτελεσματικότητα των εντομοπαθογόνων μυκήτων επί των προνυμφών του εντόμου S. nonangrioides.. Για κάθε εντομοπαθογόνο μύκητα παρασκευάστηκαν τρεις συγκεντρώσεις (106, 107, 108 κονίδια/mL) ενώ η θνησιμότητα των προνυμφών καταγραφόταν καθημερινά για 7 ημέρες. Oι εντομοπαθογόνοι μύκητες προκάλεσαν υψηλά ποσοστά θνησιμότητας στις προνύμφες του εντόμου ιδιαίτερα ο I. fumosorosea (υπόστρωμα μόνο S.D.A) προκάλεσε θνησιμότητα του S. nonangrioides που κυμάνθηκε από 80 έως 93%. Η παρουσία του εκχυλίσματος κρόκου στο υπόστρωμα αύξησε σημαντικά (P<0,05, test Bonferoni) τη θνησιμότητα του εντόμου (80-96%) ένεκα του εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii. Η σημαντική θετική επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου στην αύξηση και την αποτελεσματικότητα του εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii επί των προνυμφών του S. nonangrioides χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης ως προς τους μηχανισμούς με τους οποίους επετεύχθη αλλά και ανοίγουν νέους δρόμους ως προς την ανάπτυξη νέων μεθόδων βιολογικής καλλιέργεια. / This thesis was produced as part of the Interdepartmental Graduate Program entitled “Medicinal Chemistry: Design and Development of Medicinal Products”. The intention of this thesis was to study the effect of saffron extract at the growth of entomopathogenic fungi in semi selective substrates and at the efficacy of entomopathogenic fungi on larvae of the insect S. nonangrioides. This study used Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae) from the collection of the Benaki Phytopathological Institute and maintain with the selective medium method in laboratory of Plant Physiology at the Department of Biology (Strasser et al. 1996). Saffron (stigmas of Crocus sativus) was extracted with methanol:water 1:1, v/v (3 mL/50 mg dry plant material) for 4 h in the absence of light. Entomopathogenic fungi were cultured in petri dishes with Sabouraud Dextrose Agar (S.D.A.) for 5 days in the presence (3.0%, v/v) and absence (100% S.D.A. and 98,5% S.D.A. -1,5% methanol) of saffron extract. Methanol in the culture medium did not affect fungal growth at the particular concentration. After the five days, entomopathogenic fungi B. bassiana and I. fumosorosea were not affected by the presence of saffron extract in the growing medium, whereas M. robertsii growth was influenced positively (P<0.05, Bonferoni test) by the presence of saffron extract. In addition, the effect of saffron extract on the efficacy of entomopathogenic fungi on larvae of S. nonangrioides was studied. For each entomopathogenic fungus three concentrations (106, 107, 108 conidia/mL) were used, while the mortality of larvae was recorded daily for 7 days. Entomopathogenic fungi caused high mortality in larvae of the insect; particularly I. fumosorosea (substrate SDA) induced mortality ranging from 80 to 93%. Saffron in the culture medium of M. robertsii significantly (P<0.05, Bonferoni test) increased insect mortality (80 to 96%). The significant positive effect of saffron in the semi-selective substrate on the growth and effectiveness of M. robertsii on S. nonangrioides larvae demand further investigation of the mechanisms of action and pose new dimension in the use of biological agents.

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η επίδραση των εντομοπαθογόνων μυκήτων Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) και Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae), πουαπομονώθηκαν από ελληνικά εδάφη, επί του κυριότερου και πιο επιβλαβούς εχθρού της καλλιέργειας του γλυκού σόργου, του λεπιδόπτερου Sesamia nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera: Noctuidae). Μελετήθηκε στο εργαστήριο η επίδραση έξι στελεχών των παραπάνω μυκήτων στην επιβίωση των προνυμφών του εντόμου. Τα στελέχη των μυκήτων προκάλεσαν υψηλή θνησιμότητα στις προνύμφες του εντόμου, που κυμάνθηκε σε ποσοστά από 78%-98%. Αποτελεσματικότερα στελέχη ήταν τα B. bassiana (ΙΓΕ3), M. robertsii (Elateridae) και I. fumosorosea (Άγιος Στέφανος). Αυτές οι τρείς απομονώσεις επιλέχθηκαν προκειμένου να εξεταστεί η επίδραση της πυκνότητας των κονιδιακών εναιωρημάτων στη θνησιμότητα των προνυμφών. Καταγράφηκαν ποσοστά θνησιμότητας 7%-93% σε σχέση με την πυκνότητα των κονιδιακών εναιωρημάτων επί των προνυμφών. Διαπιστώθηκε ότι η ικανότητα που παρουσιάζουν οι εντομοπαθογόνοι μύκητες στον έλεγχο της επιβίωσης προνυμφών του εντόμου ήταν ανάλογη της χρησιμοποιημένης πυκνότητας των κονιδιακών εναιωρημάτων. Επίσης, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana (ΙΓΕ3) και M. robertsii (Elateridae) με εμπορικό σκεύασμα Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki όσον αφορά τη θανάτωση προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides. Η θνησιμότητα των προνυμφών καταγράφηκε καθημερινά για δεκαέξι ημέρες και κυμάνθηκε από 56-100% για τον M robertsii μαζί με το B thuringiensis subsp. kurstaki και 54-100% για τον B. bassiana μαζί με το βάκιλο. Επίσης, η συνδυασμένη δράση των μικροοργανισμών υπολογίστηκε για την όγδοη, δέκατη τρίτη και τη δέκατη έκτη μέρα και βρέθηκε προσθετική στους περισσότερους συνδιασμούς για την δέκατη τρίτη και δέκατη έκτη μέρα ενώ την όγδοη μέρα η συνδυαστική δράση των παθογόνων βρέθηκε αρνητική στους περισσότερους συνδιασμούς και χαρακτηρίζεται ως ανταγωνιστική. Η ανάπτυξη των εντομοπαθογόνων μυκήτων όταν καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα που περιείχε υδατικό διάλυμα B. thuringiensis subsp. kurstaki, δεν επηρεάστηκε από την παρουσία του βακτηρίου. Ο συνδυασμός του B. thuringiensis subsp. kurstaki με τους εντομοπαθογόνους μύκητες που εξετάσαμε είχε ως αποτέλεσμα να αυξηθεί η θνησιμότητα των προνυμφών του S. nonagrioides. Τα στελέχη ΙΓΕ3, Elateridae και Άγιος Στέφανος των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea αντίστοιχα, δοκιμάστηκαν επί των προνυμφών του S. nonagrioides σε τρεις κονιδιακές συγκεντρώσεις και μελετήθηκε η επίδρασή τους στην πρόσληψη τροφής, στην κατανάλωση τροφής και στην ανάπτυξη των προνυμφών. Παρατηρήθηκε μείωση της πρόσληψης τροφής από προνύμφες 3ης προνυμφικής ηλικίας σε ποσοστά 41-81%, μείωση του βάρους τους κατά 29-45% και μείωση των απορριμάτων κατά 46-81%. Παρατηρήθηκε επίσης ελάττωση της σχετικής ταχύτητας ανάπτυξης των προνυμφών κατά 31-72% και της σχετικής ταχύτητας κατανάλωσης τροφής κατά 12-35%. Τέλος, ο δείκτης πεπτικότητας, ο δείκτης μετατροπής της προσληφθείσας τροφής και ο δείκτης μετατροπής της αφομοιωμένης τροφής ήταν υψηλότεροι σε σχέση με τους αντίστοιχους του μάρτυρα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ενδεχομένως ότι η μόλυνση από τους εντομοπαθογόνους μύκητες προκαλεί επιδείνωση σε ορισμένες τροφικές διεργασίες της προνύμφης που θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην υπονόμευσή της από ασιτία. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα στο πεδίο προκείμενου να μελετηθεί η επίδραση της ενδοφυτικής παρουσίας των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea στις προνύμφες του εντόμου S. nonagrioides in planta. Kαι οι τρείς μύκητες έδρασαν αποτρεπτικά απέναντι στην προσπάθεια των προνυμφών να εισέλθουν στο στέλεχος του φυτού. Οι προνύμφες της 4ης προνυμφικής ηλικίας που πέτυχαν να εγκατασταθούν στο στέλεχος των φυτών δημιούργησαν στοές μικρότερου μήκους παρουσία των μυκήτων, και η θνησιμότητά τους ήταν μεγαλύτερη, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα των in vitro πειραμάτων. Ως προς τις επιπτώσεις της παρουσίας των ενδοφύτων στο φυτό ξενιστή, η επίδραση της παρουσίας των μυκήτων στην ανάπτυξη, την τελική βιομάζα και την κατανομή της βιομάζας σε υπέργειους ή υπόγειους ιστούς των φυτών καταγράφηκε ως ουδέτερη. Η συγκέντρωση της χλωροφύλλης και η περιεκτικότητα σε νερό δεν παρουσίασαν μεταβολές που μπορούν να αποδοθούν στην παρουσία των ενδοφύτων. Ωστόσο, ορισμένες παράμετροι της φωτοσυνθετικής διαδικασίας (καθαρή φωτοσύνθεση, ταχύτητα ροής ηλεκτρονίων, η πιθανότητα μετατροπής της συλληφθείσας ενέργειας σε ροή ηλεκτρονίων, η πιθανότητα μεταφοράς ηλεκτρονίων από τους ενδιάμεσους φορείς μέχρι την αναγωγή των τελικών υποδοχέων στο PSI και ο δείκτης ζωτικότητας της φωτοσυνθετικής συσκευής PItotal) επηρεάστηκαν αρνητικά μετά την προσβολή των στελεχών του σόργου από τις προνύμφες του εντόμου. Η ενδοφυτική παρουσία των μυκήτων B. bassiana και M. robertsii απέτρεψε τις παραπάνω αρνητικές επιδράσεις. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προσφέρουν ισχυρές ενδείξεις για επιτυχή χρησιμοποίηση ορισμένων στελεχών των εντομοπαθογόνων μυκήτων στον έλεγχο των προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides τόσο στο εργαστήριο όσο και στο πεδίο. Επίσης, θα ήταν ενδιαφέρουσα η περαιτέρω μελέτη της χρήσης αυτών τωνεντομοπαθογόνων μυκήτων κάτω από συνθήκες μειωμένης διαθεσιμότητας νερού. / The aim of this study was to investigate the effect of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae), isolated from Greek soils against the main and most damaging pest of sweet sorghum, Mediterranean corn borer Sesamia nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera: Noctuidae). Laboratory studies were performed to determine the effect of six strains of the above fungi on survival of larvae of S. nonagrioides. All strains of fungi causing high mortality among larvae, killed 78 - 98% of exposed larvae. The most effective were B. bassiana (IGE3), M. robertsii (Elateridae) and I. fumosorosea (Agios Stefanos). These three isolates were selected to examine the effect several conidial suspensions on the mortality of larvae. Recorded mortality was from 7% - 93% depending on the density of conidial suspensions used on larvae. From the above results was found that the capability provided by the entomopathogenic fungi to control the insect was according by the density of the conidial suspensions. Also, the interactions between commercial B. thuringiensis subsp. kurstaki and two entomopathogenic fungi were examined on larvae of S. nonagrioides in 8, 13 and 16 days post-treatment intervals. An overall positive interaction between the pathogens was observed and larval mortality at 16 days was 56–100% exposed to M. robertsii combined with B. thuringiensis subsp. kurstaki, whereas B. bassiana combined with B. thuringiensis subsp. kurstaki killed 54–100 % of exposed larvae. After 8 days, in 6 of the combinations, we found an additive relationship between the pathogens, whereas, a negative interaction was observed in 10 of them. In contrast, after 13 days, we observed a positive interaction in two combinations, which could be considered as synergistic, additive in ten combinations and negative in only four combinations. Finally, after 16 days, in eleven combinations we found an additive interaction, whereas negative interaction was recorded in five of them. We conclude that application of combined pathogens may be more effective for S.nonagrioides control. The strains IGE3, Elateridae and Agios Stefanos of B. bassiana, M. robertsii and I. fumosorosea respectively, were tested for their effectiveness on larval food intake, food consumption and larvae growth at three conidial concentrations. We observed a decrease in food intake by the larvae ranged between 41 and 81%, reduced larvae weight from 29 to 45% and reduced production of wastes from 46 to 81%. We also recorded significant differences in the relative growth rate of larvae, the relative consumption rate of larvae, the index digestibility, the conversion ratio of ingested food and the conversion ratio of assimilated food between infected and control individuals. Therefore, it is possible that infection of larvae by the fungi has an adverse effect on physiological and metabolic processes, which results in larva starvation. Subsequently, we performed experiments in the field, in order to investigate the plant–endophyte association behavior using B. bassiana, M. robertsii and I. fumosorosea, as well as the impact of these associations on larva activity when in planta and under environmental conditions. All three fungal species significantly prevented larvae from entering into plants’ stalk. Statistically significant differences were also observed in the length of tunnels created by larvae in the stem of the plant and in their mortality for individuals infected by the entomopathogenic fungi. These results confirm our findings of the in vitro experiments. Regarding the effect of endophytes on the host plant, a neutral impact was recorded for the development, final biomass and distribution of biomass to the aboveground and underground plant tissues. Temporary changes of chlorophyll concentration and leaf water content stability throughout the experimental period should not be attributed to the presence of endophytes. However, some aspects of the photosynthetic process (net photosynthesis, electron transport rate, as well as parameters of the photosynthetic machinery relative to electron flow round the two photosystems) negatively affected after infection of plants by the larvae. The presence of B. bassiana and M. robertsii ameliorated these adverse effects. The results of this study are strongly indicative of successful usage of certain fungi strains for biological control of S. nonagrioides larvae both in laboratory conditions and in the field.

Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης όπως εκφράζεται στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum και S. minor σε σχέση με τη θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ), αλλά και με το οξειδωτικό στρες, στo πλαίσιο της θεωρίας της οξειδωτικώς επαγόμενης σκληρωτικής διαφοροποίησης (που προτάθηκε από το εργαστήριό μας το 1997). Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Στη διαμόρφωση της ΘΟΚ συμμετέχουν πολλά μη πρωτεϊνικά, πρωτεϊνικά και μεικτά θειολικά και δισουλφιδικά συστατικά, ανάμεσα στα οποία η γλουταθειόνη θεωρείται ο κύριος συνδετικός κρίκος. Επειδή στη διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον υπολογισμό όλων των παραγόντων της ΘΟΚ για την εκπλήρωση του στόχου της μελέτης, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες σε όλους τους οργανισμούς. Παράλληλα, αναπτύχθηκε και μια νέα μέθοδος για την εξειδικευμένη ποσοτικοποίηση του μικρο-κατακερματισμένου DNA, καθώς στη διεθνή βιβλιογραφία οι περισσότερες υπάρχουσες μέθοδοι ήταν ποιοτικές και όχι εξειδικευμένες ως προς το μέγεθος των θραυσμάτων DNA. Επιπρόσθετα, η εκτίμηση των οξειδωτικών βλαβών στο DNA έγινε και με τη μέτρηση ενός γενικού δείκτη αυτών των βλαβών (εγκοπές και σπασίματα) με υπάρχουσα μέθοδο ύστερα από σημαντική τροποποίησή της. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της ειδικής ενεργότητας των βασικών ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ και της σχετιζόμενης με τη ΘΟΚ ενδογενούς βιταμίνης C, καθώς και η ποσοτικοποίηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένοι εξωγενείς τροποποιητές της ΘΟΚ. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης των νέων μεθόδων για την ποσοτικοποίηση των παραμέτρων της ΘΟΚ και των οξειδωτικών βλαβών στο DNA ως προς την εξαγωγή πιο ασφαλών συμπερασμάτων για τη συσχέτιση της ΘΟΚ με το οξειδωτικό στρες. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι η σχετιζόμενη με αυτό ΘΟΚ μεταβάλλεται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Το συμπέρασμα αυτό βασίστηκε στη διαπίστωση (α) της ύπαρξης διαφορετικών για κάθε μορφή διαφοροποίησης ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και αντιοξειδωτικών ενζύμων και (β) διαφορετικών προφίλ-διαβαθμίσεων των συγκεντρώσεων των παραμέτρων της ΘΟΚ και των δεικτών οξειδωτικού στρες. Επιπρόσθετα, ο άμεσος αντιοξειδωτικός ρόλος των ενδογενών μη πρωτεϊνικών θειολικών (με –SH ομάδα) παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση επιβεβαιώθηκε και από τη μείωση της τελευταίας κατά την τεχνητή αύξηση αυτών των παραμέτρων ύστερα από τη χορήγηση τροποποιητών της ΘΟΚ, γεγονός που θα μπορούσε να αποδοθεί στην εξ αυτών αύξηση της ενδογενούς γλουταθειόνης και της κυστεΐνης. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύεται και από την ανάλογη αντιοξειδωτική επίδραση των χορηγούμενων θειολών-τροποποιητών της ΘΟΚ Ν-ακετυλοκυστεΐνη (που ανιχνεύτηκε και ενδοκυτταρίως) και γλουταθειόνη και της μη πρωτεϊνικής θειολικής ουσίας-μάρτυρα διθειοθρεϊτόλη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόλο που τα επίπεδα της ενδογενούς γλουταθειόνης και του δισουλφιδίου της καθώς και η μεταξύ τους αναλογία συσχετίζονται συνήθως με το οξειδωτικό στρες στη διεθνή βιβλιογραφία, στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι δεν συμβαδίζουν με τους αποδεδειγμένους δείκτες του οξειδωτικού στρες υπεροξείδωση των λιπιδίων και οξειδωτικές βλάβες του DNA. Έτσι, ο ρόλος των ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση αποδεικνύεται περίπλοκος, ένεκα του ότι δεν δρουν μόνο ως άμεσοι αντιοξειδωτές αλλά και ως υποστρώματα των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ΘΟΚ. Τέλος, και στους τέσσερις τύπους σκληρωτίων ανιχνεύθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και βιταμίνης C, καθώς και ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ, υποδηλώνοντας ότι ο πιθανός στόχος της συσσώρευσης όλων των παραπάνω παραμέτρων της ΘΟΚ στα σκληρώτια είναι η αξιοποίησή τους για αντιοξειδωτική προστασία των υφών του μυελού του πυρήνα τους κατά το χρονικό διάστημα της αναπτυξιακής τους στασιμότητας, μέχρι να βρεθούν σε κατάλληλες συνθήκες για βλάστηση. / The aim of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to thiol redox state (TRS) and oxidative stress under the theory of the oxidative induction of sclerotiogenesis (proposed by our lab in 1997). Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. TRS is known to be comprised of many non-protein, protein and mixed thiol and disulfide components, with glutathione being the central component. Since there was not available any appropriate method for the determination of all TRS components, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. Additionally, another new method was developed for the quantification of small-sized fragmented DNA, since the existing methods were qualitative and not discriminating DNA size. Complementarily, oxidative damage of DNA was also estimated by a general DNA damage (nicks and fragments) marker by a published method that was significantly modified. TRS was also evaluated by the measurement of the specific activity of certain enzymes that regulate it, by the quantification of the TRS-related antioxidant vitamin C, as well as by the determination of oxidative damage on membrane lipids. Certain exogenous TRS modulators were also used. The results of this study verified the need for the development of the new methods for the determination of TRS parameters and oxidative damage of DNA, since their use allowed a more accurate estimation of the relation of TRS with oxidative stress. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that TRS components are variously formed and dependent on the type of sclerotial differentiation. This conclusion was based on (a) the existence of different (for each type of sclerotial differentiation) endogenous TRS thiol parameters and TRS-related antioxidant enzymes and (b) the different profiles-concentration gradients of TRS parameters and oxidative markers. Moreover, the direct antioxidant role of the endogenous TRS non-protein thiol parameters in sclerotial differentiation was verified by the decrease of the latter during the endogenous increase of those parameters after administration of the specified TRS-modulating substances. This could be attributed to the resulting by those substances increase of the endogenous glutathione and cysteine. This result was also supported by the antioxidant effect of the administered TRS-modulating thiol substances N-acetylcysteine (which was traced also intracellularly) and glutathione, and of the non-protein control-thiol dithiothreitol. It is worth noting that in spite of the fact that endogenous glutathione, its disulfide, and their resulting ratio are usually considered as oxidative stress markers, it was found that in this study these markers are not in accordance with the specific markers of oxidative stress lipid peroxidation and DNA damage in the evaluation of the role of oxidative stress and TRS in sclerotial differentiation. Thus, the role of the thiol parameters of TRS in sclerotial differentiation is very complicated in light of the fact that they do not act only as direct antioxidants but also as substrates of the studied TRS-related enzymes. Finally, in all sclerotial types have been found high levels of intracellular thiol parameters of TRS and vitamin C as well as enzymes that participate to TRS regulation, implying that their possible role is to provide antioxidant protection of the hyphae of the sclerotial medulla until the environmental conditions become appropriate for their germination.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, S. sclerotiorum, R. solani και S. minor σε σχέση με το οξειδωτικό στρες. Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Τα πιο σημαντικά υπεροξείδια που συμβάλλουν στην δημιουργία οξειδωτικού στρες είναι: α) η ρίζα του σουπεροξειδίου (O2•-), που είναι το πρωταρχικό αίτιο του οξειδωτικού στρες, β) το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), που κυρίως προκύπτει από την ένωση δύο μορίων O2•- (αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής) και γ) τα λιπιδικά υδροϋπεροξείδια (LOOH), που είναι από τα πρώιμα αποτελέσματα του οξειδωτικού στρες, λόγω της προσβολής των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Επειδή λοιπόν στην διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον προσδιορισμό του O2•-, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες, σε όλους τους οργανισμούς. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης των βασικών ενζύμων που σχετίζονται με τα προαναφερθέντα υπεροξείδια τα οποία είναι: α) η δισμουτάση του O2•- (SOD), που επιταχύνει την αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής, β) η καταλάση (CAT), που καταναλώνει το H2O2, γ) οι μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (NSPX) που χρησιμοποιούν το H2O2 και τα LOOH σαν υπόστρωμα για να οξειδώνουν άλλα μόρια και δ) η οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ), που ανιχνεύεται για πρώτη φορά σε μύκητες και είναι υπεύθυνη μεταξύ άλλων και για την παραγωγή του O2•- και H2O2 στους οργανισμούς. Ακόμη, έγινε εκτίμηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων με τη μέτρηση των αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (MDA). Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εξωγενείς τροποποιητές των παραπάνω μορίων: α) μιμητές της SOD β) H2O2 γ) υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου (λιπιδικό υδροϋπεροξείδιο) και δ) αμινοτριαζόλη (αναστολέας της CAT). Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης της νέας μεθόδου ποσοτικοποίησης του O2•-. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι οι σχετιζόμενοι με αυτό παράγοντες που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη μεταβάλλονται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Τα βασικότερα συμπεράσματα αυτής της μελέτης είναι: α) το O2•- φαίνεται ότι παίζει έμμεσο ρόλο στην έναρξη της σκληρωτιογένεσης των μυκήτων S. rolfsii και S. sclerotiorum και άμεσο στων μυκήτων R. solani και S. minor και κύρια πηγή παραγωγής του O2•- είναι τα μιτοχόνδρια και δευτερευόντως η ΧΟ β) η SOD που υπάρχει σε όλους τους μύκητες χρησιμοποιείται από αυτούς για τη μετατροπή του O2•- σε H2O2 γ) η ΧΟ που μέχρι σήμερα δεν ήταν γνωστή η ύπαρξή της στους μύκητες, καθώς και η EC-SOD αλλά και το EC-H2O2, δεν σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και ως γνωστόν μπορεί να εμπλέκονται στην προσβολή των φυτών ξενιστών από τους μύκητες αυτούς δ) το H2O2 επάγει την έναρξη της σκληρωτιογένεσης δρώντας σαν παράγοντας σημειακού κυτταρικού πολλαπλασιασμού ε) η CAT που υπάρχει σε όλους τους μύκητες στο αδιαφοροποίητο μόνο στάδιο, μάλλον χρησιμοποιείται από αυτούς ώστε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός να μην γίνεται σε μεγάλη ένταση και αναστείλλει την σημειακή διαφοροποίηση ζ) οι NSPX που εντοπίζονται σε όλους τους μύκητες φαίνεται ότι ελέγχουν τα επίπεδα του H2O2 κυρίως στο διαφοροποιημένο στάδιο η) τα LOOH φαίνεται να δρουν στις μεμβράνες των μυκήτων και σχετίζονται με διαδικασίες μεταβίβασης κυτταρικών μηνυμάτων που επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο θ) οι μιμητές της SOD Tiron και Tempol, που είχαν ανασταλτική δράση στην διαφοροποίηση θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μη τοξικά αντιμυκητιακά παρασκευάσματα. / The purpose of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to oxidative stress. Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. The most important peroxides that are responsible for oxidative stress are: a) superoxide radical (O2•-), the primary cause element of oxidative stress, b) hydrogen peroxide (H2O2), produced by the reaction between two O2•- (dismutation reaction), and c) lipid hydroperoxides (LOOH), the primary consequences of oxidative destruction due to free radical attack to polyunsaturated fatty acids. Since there was not available any appropriate method for the quantification of O2•-, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. In addition, the estimation of the concentration of certain enzymes that regulate the levels of the peroxides mentioned above was also used. These enzymes are a) superoxide dismutase (SOD), which catalyzes the dismutation reaction, b) catalase (CAT), which destroys H2O2, c) non-specific peroxidases (NSPX), which use either H2O2 or LOOH as substrates in order to oxidize other molecules and d) xanthine oxidase (XO), which was detected for the first time in fungi and is responsible, among other functions, for the production of O2•- in organisms. Furthermore, the aldehydic adducts of lipid peroxidation (MDA) were measured in order to evaluate the oxidative destruction of membrane lipids. Finally, specific externally added modulators of the above molecules were used, like: a) SOD mimetics b) H2O2 c) cumene hydroperoxide (lipid hydroperoxide) and d) aminotriazole (CAT inhibitor). The results of this study verified the need for the development of the new method for the quantification of O2•-. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that its components, tested in this study, are formed and changed variously, depending on the type of sclerotial differentiation. The most important conclusions of this study are: a) O2•- plays an indirect role in the initiation of sclerotiogenesis in fungi S. rolfsii and S. sclerotiorum, while in R. solani and S. minor its role is direct, and the main source that produces it in all four fungi are mitochondria and secondarily the ΧΟ enzyme, b) SOD is used by these fungi in order to convert O2•- to H2O2 via the dismutation reaction, c) ΧΟ which was found for the first time in fungi as well as EC-SOD and EC-H2O2, are not related with differentiation and possibly they are involved in tha attack of target plants by these fungi, d) H2O2 induces the initiation of sclerotiogenesis acting as a cell proliferating factor, e) CAT which was found in all fungi only in the undifferentiated stage, is probably used by them in order to control cell proliferation so as to avoid inhibition of sclerotiogenesis, f) NSPX are possibly used by these fungi in order to control H2O2 concentration mainly in the differentiated stage, g) LOOH appear to act on cell membrane and are related to signal transduction processes which affect cell cycle and h) SOD mimetics Tiron and Tempol, which reduced differentiation could be used as non-toxic fungicides.

Τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου (ΥΑΕ) παράγονται κατά την εξαγωγή του ελαιόλαδου από τα παραδοσιακά και τα φυγοκεντρικά ελαιοτριβεία τριών φάσεων. Τα ΥΑΕ έχουν διαφορετικά χαρακτηριστικά τα οποία εξαρτώνται από τη διαδικασία παραγωγής και τον τύπο των ελιών που χρησιμοποιούνται. Τα περισσότερα ελαιοτριβεία στην Ελλάδα χρησιμοποιούν την τριφασική διαδικασία εξαγωγής του ελαιόλαδου. Παρόλα αυτά, κάποια καινούρια χρησιμοποιούν τη διφασική διαδικασία εξαγωγής του ελαιολάδου. Παραδοσιακά ελαιοτριβεία συνεχίζουν να υπάρχουν, αλλά σε μικρότερη έκταση. Τα ΥΑΕ αποτελούν ένα σημαντικό πρόβλημα για την περιοχή της Μεσογείου, όπου παράγεται το 95 % της παγκόσμιας παραγωγής ελαιολάδου, εξαιτίας της υψηλής τους συγκέντρωσης σε χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (ΧΑΟ) και της ικανότητάς τους να αντιστέκονται στη βιοαποδόμηση εξαιτίας της υψηλής τους περιεκτικότητας σε φαινολικές ενώσεις. Αυτές οι ενώσεις οφείλονται για το μαύρο χρώμα και τις φυτοτοξικές και αντιβακτηριδιακές ιδιότητες των ΥΑΕ. Διάφορες φυσικοχημικές μέθοδοι έχουν προταθεί για την επεξεργασία των ΥΑΕ, συμπεριλαμβανομένων της απλής συμπύκνωσης, της επίπλευσης και καθίζησης, της εξάτμισης και της χρήσης επιλεγμένων μεμβρανών, της ουδετεροποίησης με την προσθήκη H2SO4, της οξείδωσης με O3 και αντιδραστήριο Fenton, καθώς επίσης και την επαναχρησιμοποίηση των ΥΑΕ με διασκορπισμό σε αγροτικά εδάφη σαν λίπασμα. Σε ότι αφορά τις βιολογικές μεθόδους, οι αναερόβιες βιολογικές διεργασίες είναι ιδιαίτερα αποδοτικές εξαιτίας των γνωστών πλεονεκτημάτων που εμφανίζουν και σχετίζονται με την εξοικονόμηση ενέργειας και χημικών και της μικρής παραγωγής λάσπης, ειδικότερα όταν αφορά την επεξεργασία αποβλήτων με υψηλή συγκέντρωση ΧΑΟ. Η εποχιακή λειτουργία των ελαιοτριβείων (Νοέμβριος – Φεβρουάριος) δεν αποτελεί μειονέκτημα για τις αναερόβιες διεργασίες εξαιτίας των χαμηλών παρατηρούμενων ρυθμών αποδόμησης των μεθανογόνων μικροοργανισμών και της εύκολης επαναλειτουργίας των αναερόβιων χωνευτήρων μετά από αρκετούς μήνες μη λειτουργίας. Παρόλο που η αναερόβια χώνευση χρησιμοποιείται κατά κύριο λόγο για τη μείωση του υψηλού οργανικού φορτίου των ΥΑΕ, η παρουσία ενώσεων στα ΥΑΕ τοξικών προς τους μεθανογόνους φαίνεται να είναι ένα σημαντικό πρόβλημα για την αναερόβια επεξεργασία των ΥΑΕ. Μία προσέγγιση στο πρόβλημα θα ήταν η αραίωση του αποβλήτου ώστε να μειωθεί η συγκέντρωση των φαινολικών ενώσεων και των λιπαρών οξέων. Σε αυτή την περίπτωση εξετάζεται και η απομάκρυνση των στερών του αποβλήτου πριν την αναερόβια χώνευση. Μία δεύτερη προσέγγιση θα ήταν η εφαρμογή αερόβιας προεπεξεργασίας του αποβλήτου ώστε να απομακρυνθούν ενώσεις που είναι τοξικές για τα μεθανογόνα βακτήρια. Πιο συγκεκριμένα, ένα πρώτο στάδιο αερόβιας προεπεξεργασίας του ΥΑΕ με μύκητα λευκής σήψης, έχει προταθεί ως η πιο κατάλληλη μικροβιακή διεργασία προεπεξεργασίας για την επιλεκτική απομάκρυνση των φαινολικών. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθεί η ικανότητα του μύκητα λευκής σήψης Pleurotus ostreatus κάτω από άσηπτες ή μη συνθήκες να λειτουργήσει σε έναν καινοτόμο βιοαντιδραστήρα καθοδικής ροής και να διευρενηθεί η αποδοτικότητα εναλλακτικά της αραίωσης ή/και της προεπεξεργασίας στην αναερόβια χώνευση ΥΑΕ σε αναδευόμενο μεσόφιλο αντιδραστήρα. Επίσης, μελετήθηκε η αναερόβια χώνευση ΥΑΕ σε αντιδραστήρα τύπου ASBR και αντιδραστήρα PABR, αντίστοιχα. Μία καινοτόμος μέθοδος ακινητοποίησης των μυκήτων αποδείχτηκε κατάλληλη για την ανάπτυξη μιας αποδοτικής διεργασίας προεπεξεργασίας για την απομάκρυνση των φαινολικών. Η αναερόβια χώνευση είναι η πιο αποδοτική διεργασία για την επεξεργασία υγρών αποβλήτων ελαιοτριβείου. Παρόλα αυτά, αραίωση ή/και κάποιου τύπου προεπεξεργασία είναι απαραίτητη για την αποφυγή τοξικότητας των φαινολικών στους μεθανογόνους. Θερμική προεπεξεργασία ακολουθούμενη από καθίζηση ώστε να απομακρυνθεί το στερεό περιεχόμενο, από την άλλη, αποδείχτηκε ένας μη επιθυμητός τρόπος προεπεξεργασίας. Επιπλέον, αραιωμένο ΥΑΕ 1:1, χωρίς την απομάκρυνση των στερεών μπορεί να υποστεί επεξεργασία αποδοτικά σε υδραυλικό χρόνο παραμονής 30 ημέρες, εξασφαλίζοντας σταθερή παραγωγή βιοαερίου. Βιολογική προεπεξεργασία με μύκητα μπορεί να οδηγήσει σε σταθερή διεργασία σε υδραυλικό χρόνο παραμονής 30 ημέρες. Η αναερόβια επεξεργασία του αποβλήτου σε αντιδραστήρα ASBR είναι εφικτή με ισοδύναμο χρόνο παραμονής 30 ημερών χωρίς να αραιωθεί το απόβλητο. Η επεξεργασία σε αντιδραστήρα PABR είναι ωστόσο πιο αποδοτική εξαιτίας του σχεδόν κατά μία τάξη μεγέθους μικρότερο υδραυλικού χρόνου παραμονής (3.75 ημέρες), που αυτός μπορεί να λειτουργήσει και της μεγαλύτερης απόδοσης του σε βιοαέριο. Το αναερόβια επεξεργασμένο απόβλητο μπορεί να καταστεί κατάλληλο για διάθεση μετά από κατάλληλη επεξεργασία μεμβρανών (συνδυασμός υπερδιήθησης και αντίστροφης όσμωσης). / Olive mill wastewater (OMW) is produced during the extraction of oil from the olive fruit by the traditional mill and press process. ΟΜW has a wide range of characteristics depending on the type of the mill and the type of olive and equipment employed. Most of the mills in Greece use a 3-phase extraction process. However, some of the newer ones use the 2-phase extraction process. Traditional mills are still present but to a limited extent. OΜW treatment and disposal has become a critical environmental problem in the Mediterranean area that accounts for approximately 95% of the world olive oil production. This is because of its high organic chemical oxygen demand (COD) concentration, and because of its resistance to biodegradation due to its high content in phenolic compounds. These compounds are responsible for its dark color, and its phytotoxic and antibacterial properties. Various physico-chemical methods have been proposed for treating OMW, including simple evaporation, flotation and settling, vaporization and use of selected membranes, neutralization with addition of H2SO4, oxidation by O3 and Fenton reagent, as well as reuse of the OMW by spreading onto agricultural soil as an organic fertilizer. As far as biological processes are concerned, anaerobic biological processes are particularly suitable because of their well known advantages related to energy and chemicals saving and to the low production of sludge, especially when it comes to treatment of high COD wastewaters. The seasonal nature of the operation of olive mills (typically November to February) is not a disadvantage for anaerobic processes because the observed decay rates for methanogens are very low and a digester can be easily restarted following several months of shut-down. Although anaerobic digestion may be in principle used for reducing the high organic content of OMW, the presence of compounds toxic to methanogens in OMW appears to be a significant problem for the anaerobic digestion of OMW. One approach to the problem has been to sufficiently dilute the OMW to reduce the concentration of phenolics and fatty acids. In this case, the possibility of prior solids removal needs to be examined. A second approach has been the use of aerobic pretreatment of OMW to remove compounds that are toxic to methanogenic consortia. In particular, a preceding aerobic treatment of OMW with white-rot fungi, has been proposed as the most suitable microbial pretreatment process for the selective removal of phenolics. The aim of the present study was to study the ability of the white rot fungus Pleurotus ostreatus under aseptic or non aseptic conditions to function in a novel trickling filter immobilized fungi bioreactor and to investigate the feasibility of alternative dilution and/or pretreatment processes for the anaerobic digestion of olive-mill wastewater in a stirred tank mesophilic digester. The anaerobic digestion of OMW in an anaerobic sequencing batch reactor (ASBR) and in a periodic anaerobic baffled reactor (PABR) was also studied. A novel fungi immobilization method proved very suitable for the development of an efficient pretreatment process for phenolics removal. Anaerobic digestion is the most effective process for the treatment of olive mill wastewater. However, dilution and/or some type of pretreatment are necessary to avoid toxicity of the phenolics on the methanogens. Thermal pretreatment followed by sedimentation to remove the solids content, on the other hand proved to be an undesirable type of pretreatment. Diluted 1:1 raw OMW on the other hand, without any solids removal, can be effectively treated at an HRT of 30d, securing a stable high biogas yielding operation. Biological pre-treatment with fungi may lead to a stable process at an HRT of 30d. Anaerobic digestion of OMW using an ASBR (anaerobic sequencing batch reactor) is feasible at an equivalent HRT of 30d with the advantage that it can treat nondiluted wastewater. Treatment in a PABR, however, is much more effective as it requires an order-of –magnitude lower HRT ( 3.75 d) and yields large amounts of biogas. The anaerobically treated effluent is still not suitable for disposal. A membrane process such as reverse osmosis may be effectively used to render the anaerobically treated wastewater readily disposable.