H παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση της σχέσης του οξειδωτικού στρες με τη σκληρωτιακή διαφοροποίηση και την παραγωγή αφλατοξίνης του μύκητα Aspergillus flavus. Ο μύκητας αυτός έχει σπουδαία αγροτική σημασία διότι μπορεί να επιμολύνει αποθηκευμένους καρπούς. Επίσης μπορεί να αποτελεί παθογόνο μικροοργανισμό για τον άνθρωπο που σχετίζεται με ασπεργιλλώσεις των πνευμόνων και άλλες λοιμώξεις. Πολλά στελέχη παράγουν μεγάλες ποσότητες αφλατοξίνης, μιας καρκινογόνου και εξαιρετικά τοξικής ένωσης. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε ο ρόλος κεντρικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες όπως η λιπιδική και πρωτεϊνική υπεροξείδωση, η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση αλλά και συγκεκριμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων, καθώς και η επίδραση συγκεκριμένων αντιοξειδωτών στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση ενός στελέχους αγρίου τύπου σε σύγκριση με ένα μεταλλαγμένο μη σκληρωτιογόνο και μη αφλατοξινογόνο στέλεχος (ΔveA). Για την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής χρειάστηκε η ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών για την ποσοτικοποίηση στους μύκητες της ολικής πρωτεΐνης, και εξειδικευμένων θειολικών και λιπιδικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν μια σαφή συσχέτιση του οξειδωτικού στρες με τη διαφοροποίηση των σκληρωτιογόνων μυκήτων, αφού το αγρίου τύπου στέλεχος εμφανίζεται περισσότερο στρεσαρισμένο οξειδωτικά σε σύγκριση με το αδιαφοροποίητο μεταλλαγμένο στέλεχος. Η χορήγηση αντιοξειδωτών ανέστειλε πλήρως (με εξαίρεση το ασκορβικό οξύ) τη σκληρωτιογένεση του αγρίου τύπου στελέχους επιδρώντας διαφορετικά στις παραμέτρους του οξειδωτικού στρες, ενώ μείωσε έως ανέστειλε πλήρως τη βιοσύνθεση αφλατοξίνης, αποκαλύπτοντας τη συμμετοχή του οξειδωτικού στρες σε αυτές τις διαδικασίες. Τα αποτελέσματα της διατριβής εκτός από επιστημονικό ενδιαφέρον έχουν και πρακτική σημασία εξαιτίας της παθογένειας του συγκεκριμένου μύκητα τόσο στον άνθρωπο όσο και στα φυτά. / The present thesis aims to elucidate the relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation and aflatoxin production of the fungus Aspergillus flavus. This fungus has great agricultural importance because it can infect stored grains. It can also be a human pathogen, associated with aspergillosis of the lungs and other infections. Many strains produce significant quantities of aflatoxin, a carcinogenic and acutely toxic compound. In particular, the role of central parameters of oxidative stress such as lipid and protein peroxidation, thiol redox state and antioxidant enzymes, and the influence of certain related exogenous antioxidants were studied on the biosynthesis of aflatoxin, on the biogenesis of sclerotia in a wild type in comparative relationship with a non-sclerotiogenic and non-aflatoxigenic mutant strain (ΔveA). The experimental needs of this thesis necessitates the development of new methodologies for the precise quantification of certain thiol and lipid markers of oxidative stress and protein concentration. The results show a clear relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation since the wild type strain is more oxidatively stressed than the mutant non-differentiating strain. Administration of certain antioxidants completely inhibited sclerotiogenesis in the wild type strain (with the exception of ascorbic acid), and decreased or even halted the biosynthesis of aflatoxin, thus revealing an implication of oxidative stress on these processes. The results besides having scientific interest, have also practical importance since this fungi is both human and plant pathogen.

Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης όπως εκφράζεται στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum και S. minor σε σχέση με τη θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ), αλλά και με το οξειδωτικό στρες, στo πλαίσιο της θεωρίας της οξειδωτικώς επαγόμενης σκληρωτικής διαφοροποίησης (που προτάθηκε από το εργαστήριό μας το 1997). Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Στη διαμόρφωση της ΘΟΚ συμμετέχουν πολλά μη πρωτεϊνικά, πρωτεϊνικά και μεικτά θειολικά και δισουλφιδικά συστατικά, ανάμεσα στα οποία η γλουταθειόνη θεωρείται ο κύριος συνδετικός κρίκος. Επειδή στη διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον υπολογισμό όλων των παραγόντων της ΘΟΚ για την εκπλήρωση του στόχου της μελέτης, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες σε όλους τους οργανισμούς. Παράλληλα, αναπτύχθηκε και μια νέα μέθοδος για την εξειδικευμένη ποσοτικοποίηση του μικρο-κατακερματισμένου DNA, καθώς στη διεθνή βιβλιογραφία οι περισσότερες υπάρχουσες μέθοδοι ήταν ποιοτικές και όχι εξειδικευμένες ως προς το μέγεθος των θραυσμάτων DNA. Επιπρόσθετα, η εκτίμηση των οξειδωτικών βλαβών στο DNA έγινε και με τη μέτρηση ενός γενικού δείκτη αυτών των βλαβών (εγκοπές και σπασίματα) με υπάρχουσα μέθοδο ύστερα από σημαντική τροποποίησή της. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της ειδικής ενεργότητας των βασικών ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ και της σχετιζόμενης με τη ΘΟΚ ενδογενούς βιταμίνης C, καθώς και η ποσοτικοποίηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένοι εξωγενείς τροποποιητές της ΘΟΚ. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης των νέων μεθόδων για την ποσοτικοποίηση των παραμέτρων της ΘΟΚ και των οξειδωτικών βλαβών στο DNA ως προς την εξαγωγή πιο ασφαλών συμπερασμάτων για τη συσχέτιση της ΘΟΚ με το οξειδωτικό στρες. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι η σχετιζόμενη με αυτό ΘΟΚ μεταβάλλεται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Το συμπέρασμα αυτό βασίστηκε στη διαπίστωση (α) της ύπαρξης διαφορετικών για κάθε μορφή διαφοροποίησης ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και αντιοξειδωτικών ενζύμων και (β) διαφορετικών προφίλ-διαβαθμίσεων των συγκεντρώσεων των παραμέτρων της ΘΟΚ και των δεικτών οξειδωτικού στρες. Επιπρόσθετα, ο άμεσος αντιοξειδωτικός ρόλος των ενδογενών μη πρωτεϊνικών θειολικών (με –SH ομάδα) παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση επιβεβαιώθηκε και από τη μείωση της τελευταίας κατά την τεχνητή αύξηση αυτών των παραμέτρων ύστερα από τη χορήγηση τροποποιητών της ΘΟΚ, γεγονός που θα μπορούσε να αποδοθεί στην εξ αυτών αύξηση της ενδογενούς γλουταθειόνης και της κυστεΐνης. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύεται και από την ανάλογη αντιοξειδωτική επίδραση των χορηγούμενων θειολών-τροποποιητών της ΘΟΚ Ν-ακετυλοκυστεΐνη (που ανιχνεύτηκε και ενδοκυτταρίως) και γλουταθειόνη και της μη πρωτεϊνικής θειολικής ουσίας-μάρτυρα διθειοθρεϊτόλη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόλο που τα επίπεδα της ενδογενούς γλουταθειόνης και του δισουλφιδίου της καθώς και η μεταξύ τους αναλογία συσχετίζονται συνήθως με το οξειδωτικό στρες στη διεθνή βιβλιογραφία, στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι δεν συμβαδίζουν με τους αποδεδειγμένους δείκτες του οξειδωτικού στρες υπεροξείδωση των λιπιδίων και οξειδωτικές βλάβες του DNA. Έτσι, ο ρόλος των ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση αποδεικνύεται περίπλοκος, ένεκα του ότι δεν δρουν μόνο ως άμεσοι αντιοξειδωτές αλλά και ως υποστρώματα των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ΘΟΚ. Τέλος, και στους τέσσερις τύπους σκληρωτίων ανιχνεύθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και βιταμίνης C, καθώς και ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ, υποδηλώνοντας ότι ο πιθανός στόχος της συσσώρευσης όλων των παραπάνω παραμέτρων της ΘΟΚ στα σκληρώτια είναι η αξιοποίησή τους για αντιοξειδωτική προστασία των υφών του μυελού του πυρήνα τους κατά το χρονικό διάστημα της αναπτυξιακής τους στασιμότητας, μέχρι να βρεθούν σε κατάλληλες συνθήκες για βλάστηση. / The aim of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to thiol redox state (TRS) and oxidative stress under the theory of the oxidative induction of sclerotiogenesis (proposed by our lab in 1997). Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. TRS is known to be comprised of many non-protein, protein and mixed thiol and disulfide components, with glutathione being the central component. Since there was not available any appropriate method for the determination of all TRS components, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. Additionally, another new method was developed for the quantification of small-sized fragmented DNA, since the existing methods were qualitative and not discriminating DNA size. Complementarily, oxidative damage of DNA was also estimated by a general DNA damage (nicks and fragments) marker by a published method that was significantly modified. TRS was also evaluated by the measurement of the specific activity of certain enzymes that regulate it, by the quantification of the TRS-related antioxidant vitamin C, as well as by the determination of oxidative damage on membrane lipids. Certain exogenous TRS modulators were also used. The results of this study verified the need for the development of the new methods for the determination of TRS parameters and oxidative damage of DNA, since their use allowed a more accurate estimation of the relation of TRS with oxidative stress. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that TRS components are variously formed and dependent on the type of sclerotial differentiation. This conclusion was based on (a) the existence of different (for each type of sclerotial differentiation) endogenous TRS thiol parameters and TRS-related antioxidant enzymes and (b) the different profiles-concentration gradients of TRS parameters and oxidative markers. Moreover, the direct antioxidant role of the endogenous TRS non-protein thiol parameters in sclerotial differentiation was verified by the decrease of the latter during the endogenous increase of those parameters after administration of the specified TRS-modulating substances. This could be attributed to the resulting by those substances increase of the endogenous glutathione and cysteine. This result was also supported by the antioxidant effect of the administered TRS-modulating thiol substances N-acetylcysteine (which was traced also intracellularly) and glutathione, and of the non-protein control-thiol dithiothreitol. It is worth noting that in spite of the fact that endogenous glutathione, its disulfide, and their resulting ratio are usually considered as oxidative stress markers, it was found that in this study these markers are not in accordance with the specific markers of oxidative stress lipid peroxidation and DNA damage in the evaluation of the role of oxidative stress and TRS in sclerotial differentiation. Thus, the role of the thiol parameters of TRS in sclerotial differentiation is very complicated in light of the fact that they do not act only as direct antioxidants but also as substrates of the studied TRS-related enzymes. Finally, in all sclerotial types have been found high levels of intracellular thiol parameters of TRS and vitamin C as well as enzymes that participate to TRS regulation, implying that their possible role is to provide antioxidant protection of the hyphae of the sclerotial medulla until the environmental conditions become appropriate for their germination.