Το οξειδωτικό στρες είναι μια κατάσταση στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα όταν σε αυτά οι αντιοξειδωτική άμυνα υπερκεράζεται έναντι των οξειδωτικών εκθέσεων των κυττάρων και χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση ελευθέρων ριζών οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν καταστροφές στα βιομόρια του κυττάρου (λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες). Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να εμπλέκεται στους μηχανισμούς τόσο φυσιολογικών (διαφοροποίηση, γήρανση), όσο και παθολογικών καταστάσεων (νευροεκφυλιστικές παθήσεις). Σε περίπτωση έντονου οξειδωτικού στρες εξαιτίας φυσιολογικών ή παθολογικών ερεθισμάτων στα κύτταρα επέρχονται βλάβες σε μόρια, όπως οι πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου η ακριβής ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής υπεροξείδωσης με μεθόδους που εξειδικευμένα ποσοτικοποιούν συγκεκριμένες αλλαγές, όπως τη δημιουργία των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, είναι χρήσιμες για την εκτίμηση της έκτασης της βλάβης. Οι καρβονυλομάδες δημιουργούνται σε συγκεκριμένα αμινοξέα των πρωτεϊνών (λυσίνη, αργινίνη, προλίνη και θρεονίνη [1]), ύστερα από έκθεση των κυττάρων/οργανισμών σε συνθήκες υψηλού οξειδωτικού στρες. Για την ποσοτικοποίησή τους, η κλασική φωτομετρική μέθοδος, που στηρίζεται στην αντίδραση των καρβονυλομάδων με το αντιδραστήριο 2,4,-dinitrophenylhydrazine (DNPH) παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα. Τα βασικότερα είναι: (1) η μη φωτομετρική διάκριση της προκύπτουσας υδραζόνης από το ελεύθερο DNPH, σε συνδυασμό με την απομόνωσή του μέσω πρωτεϊνικής καταβύθισης και αναποτελεσματικού πλυσίματος του πρωτεϊνικού ιζήματος για την απομάκρυνση του μη ειδικά συνδεδεμένου DNPH στην πρωτεΐνη, και (2) η υδρόλυση του δεσμού της υδραζόνης σε όξινο pH. Ως εκ τούτου, η κλασική μέθοδος του DNPH παρουσιάζει προβλήματα επαναληψιμότητας και ακρίβειας. H παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας νέας ευαίσθητης και απλής μεθοδολογίας με βάση το αντιδραστήριο DNPH για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε δείγματα ιστών, η οποία θα αντιμετωπίζει τα προαναφερθέντα μειονεκτήματα της κλασικής φωτομετρικής μεθόδου. Τα αποτελέσματα της διατριβής έχουν ευρεία βιολογική σημασία εξαιτίας του ότι η νέα μέθοδος (αλκαλική DNPH μέθοδος) μπορεί να εφαρμοστεί σε ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δειγμάτων, κάνοντας τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες έναν αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού στρες. / Oxidative stress is a condition where the cells are characterized by low antioxidant defense, which leads to the generation of oxygen/nitrogen free radicals that damage the central molecules of the cell (lipids, nucleic acids, proteins). Oxidative stress is involved in both physiological (e.g. differentiation, aging) and pathological conditions (e.g. neurodegenerative diseases). In case of severe oxidative stress due to physiological or pathological parameters in the cells, proteins and other macromolecules are damaged. Therefore, the accurate quantification of protein peroxidation with assays for specific oxidative modifications such as protein carbonyls is very important for the evaluation of the extent of damage. Carbonyl groups are formed in certain amino acids of proteins (lysine, arginine, proline, and threonine residues [1]), following the exposure of cells/organisms to high oxidative stress conditions. For their quantification, the standard photometric method, based on the reaction of carbonyl groups with the reagent 2,4,-dinitrophenylhydrazine (DNPH) presents several disadvantages. The main disadvantages are: (1) the non-photometric differentiation of the protein-DNPH hydrazone from free DNPH, coupled with its isolation via protein precipitation and ineffective washing of the protein precipitate to remove non-specifically bound DNPH to the protein, and (2) the hydrolysis of the hydrazone bond at acidic pH. Therefore, the standard DNPH assay cannot be used accurately. The present study aims to develop a novel sensitive and simple DNPH-based methodology for the quantification of the protein carbonyls in tissue samples, which overcomes all the aforementioned disadvantages. The findings presented here are very important because the new assay (alkaline DNPH assay) is applicable to a wide spectrum of biological samples, making protein carbonyls a very reliable marker of oxidative stress.

Το οξειδωτικό στρες είναι μια κατάσταση στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα όταν σε αυτά η αντιοξειδωτική άμυνα υπερκεράζεται έναντι των οξειδωτικών εκθέσεων των κυττάρων και χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση ελευθέρων ριζών οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν καταστροφές στα βιομόρια του κυττάρου (λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες). Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να εμπλέκεται στους μηχανισμούς τόσο φυσιολογικών (διαφοροποίηση, γήρανση), όσο και παθολογικών καταστάσεων (νευροεκφυλιστικές παθήσεις). Σε περίπτωση έντονου οξειδωτικού στρες εξαιτίας φυσιολογικών ή παθολογικών ερεθισμάτων στα κύτταρα επέρχονται βλάβες σε μόρια, όπως οι πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου η ακριβής ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής υπεροξείδωσης με μεθόδους που εξειδικευμένα ποσοτικοποιούν συγκεκριμένες αλλαγές, όπως τη δημιουργία των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, είναι χρήσιμες για την εκτίμηση της έκτασης της βλάβης. Οι καρβονυλομάδες υπερισχύουν ποσοτικά ως προϊόντα οξείδωσης των πρωτεϊνών και δημιουργούνται σε συγκεκριμένα αμινοξέα των πρωτεϊνών (λυσίνη, αργινίνη, προλίνη και θρεονίνη [1]) ύστερα από έκθεση των κυττάρων/οργανισμών σε συνθήκες υψηλού οξειδωτικού στρες. Για την ποσοτικοποίησή τους, η κλασική φθορισμομετρική μέθοδος, που στηρίζεται στην αντίδραση των καρβονυλομάδων με το αντιδραστήριο fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTC) παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα. Τα βασικότερα είναι: (1) η μη φθορισμομετρική διάκριση της προκύπτουσας υδραζόνης από το ελεύθερο FTC, σε συνδυασμό με την απομόνωσή του μέσω πρωτεϊνικής καταβύθισης και αναποτελεσματικού πλυσίματος του πρωτεϊνικού ιζήματος για την απομάκρυνση του μη ειδικά συνδεδεμένου FTC στην πρωτεΐνη, και (2) η υδρόλυση του δεσμού της υδραζόνης σε σύντομο χρονικό διάστημα. Ως εκ τούτου, η κλασική φθορισμομετρική μέθοδος του FTC παρουσιάζει προβλήματα επαναληψιμότητας και ακρίβειας. H παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας νέας ευαίσθητης και απλής φθορισμομετρικής μεθοδολογίας με βάση ένα νέο αντιδραστήριο, το Rhodamine B Hydrazine (RBH) για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε δείγματα ιστών, η οποία θα αντιμετωπίζει τα προαναφερθέντα μειονεκτήματα της κλασικής φθορισμομετρικής μεθόδου και επιπλέον θα στοχεύει σε μεγαλύτερη ευαισθησία (λιγότερη ποσότητα πρωτεΐνης). Τα αποτελέσματα της διατριβής έχουν ευρεία βιολογική σημασία εξαιτίας του ότι η νέα μέθοδος (φθορισμομετρική RBH μέθοδος) μπορεί να εφαρμοστεί σε ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δειγμάτων, κάνοντας τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες έναν αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού στρες. / Oxidative stress is a condition where the cells are characterized by low antioxidant defense, which leads to the generation of oxygen/nitrogen free radicals that damage the central molecules of the cell (lipids, nucleic acids, proteins). Oxidative stress is involved in both physiological (e.g. differentiation, aging) and pathological conditions (e.g. neurodegenerative diseases). In case of severe oxidative stress due to physiological or pathological parameters in the cells, proteins and other macromolecules are damaged. Therefore, the accurate quantification of protein peroxidation with assays for specific oxidative modifications such as protein carbonyls is very important for the evaluation of the extent of damage. Carbonyl groups are quantitatively the major type of oxidative modification of proteins, and are formed in certain amino acids of proteins (lysine, arginine, proline, and threonine residues [1]), following the exposure of cells/organisms to high oxidative stress conditions. For their quantification, the standard fluorometric method, based on the reaction of carbonyl groups with the reagent fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTC) presents several disadvantages. The main disadvantages are: (1) the non-fluorometric differentiation of the protein-FTC hydrazone from free FTC, coupled with its isolation via protein precipitation and ineffective washing of the protein precipitate to remove non-specifically bound FTC to the protein, and (2) the hydrolysis of the hydrazone bond at acidic pH. Therefore, the standard FTC assay cannot be used accurately. The present study aims to develop a novel sensitive and simple fluorometric assay based on a novel reagent, Rhodamine B Hydrazine (RBH), for the quantification of protein carbonyls in tissue samples, which overcomes all the aforementioned disadvantages. The findings presented here are very important because the new assay (fluorometric RBH assay) is applicable to a wide spectrum of biological samples, making protein carbonyls a very reliable marker of oxidative stress.

Οι μεταλλαγμένοι μύες weaver αποτελούν ένα μοναδικό γενετικό μοντέλο της νόσου Πάρκινσον. Πρόκειται για μια νευροβιολογική μετάλλαξη η οποία συμβολίζεται ως wv και περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Lane (1964). Πρόκειται για μετάλλαξη με λάθος νόημα στο γονίδιο Girk 2 που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 16 του ποντικού σε μια περιοχή ανάλογη με την περιοχή του 21 χρωμοσώματος του ανθρώπου που ευθύνεται για το σύνδρομο Down και οδηγεί σε τροποποίηση της λειτουργίας ενός διαύλου καλίου. Επειδή ο εγκέφαλος των θηλαστικών είναι από τους πιο ευαίσθητους ιστούς πολλές μελέτες έχουν γίνει για τις επιδράσεις των φαρμάκων (νευροστεροειδών), στην παθογένεια και στην αντιμετώπιση των νευροεκφυλιστικών νόσων. Ο παράγοντας BNN 50 είναι ένα νευροστεροειδές που έχει συνώνυμο το BNN 20. Παράγεται από το ανδρογόνο νευροστεροειδές δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) με εποξείδωση της 17-κετομάδας του με χρήση trimethylsulfonium methylide (τριμεθυλοσούλφωνο-μεθυλίδιο). Έχει το πλεονέκτημα ότι δεν μεταβολίζεται σε οιστρογόνα ενδογενώς, όπως το DHEA, κι επομένως ενδέχεται να είναι καταλληλότερο για φαρμακευτική χρήση. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η επίδραση στο οξειδωτικό στρες του νευροστεροειδούς BNN 50 σε εγκεφάλους μυών κατά την 21 ημέρα με ταυτόχρονο προσδιορισμό των επιπέδων υπεροξείδωσης λιπιδίων και πρωτεϊνών στις ακόλουθες περιοχές: α) CE (παρεγκεφαλίδα), β) HIP (ιππόκαμπος), γ) CX (εγκεφαλικός φλοιός). Για το σκοπό αυτό τα πειραματόζωα χωρίστηκαν στις ακόλουθες 4 ομάδες: 1) φυσιολογικοί μύες (control) χωρίς BNN 50, με saline 2) control με BNN 50, 3) weaver χωρίς BNN 50 με saline και 4) weaver με ΒΝΝ 50. Οι μύες (control-weaver) δέχονταν BNN 50 (100 mg/kg σωματικού βάρους) ημερησίως από την πρώτη μέρα της ζωής (με ενδοπεριτοναϊκή ένεση) και για διάστημα 18 ημερών. Μετά την τελευταία ένεση, οι μύες θανατώθηκαν και οι εγκεφαλικοί ιστοί απομονώθηκαν σε ειδικό αντιοξειδωτικό ρυθμιστικό διάλυμα. Για τον προσδιορισμό του βαθμού λιπιδικής υπεροξείδωσης στα ομογενοποιήματα των ιστών χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης η MDA (μηλονική δυαλδεύδη), σε ελεύθερη μορφή και συνδεδεμένη με πρωτεΐνες (FrMDA και PrMDA, αντιστοίχως). Επίσης, ποσοτικοποιήθηκαν και τα υδροϋπεροξείδια των λιπιδίων και των πρωτεϊνών (LOOH και PrOOH, αντιστοίχως). Όσον αφορά τα αποτελέσματα βρέθηκε ότι: (1) το νευροστεροειδές BNN 50 δρα αντιοξειδωτικά στις δυο από τις τρεις περιοχές εγκεφάλου που μελετήθηκαν (ιππόκαμπος και παρεγκεφαλίδα), και (2) οι μύες weaver στους οποίους είχε χορηγηθεί το φάρμακο είχαν χαμηλότερες τιμές σε τρεις από τους τέσσερις δείκτες ελέγχου για λιπιδική και πρωτεϊνική υπεροξείδωση εκτός από τα πρωτεϊνικά υπεροξείδια. Συνεπώς η αντιοξειδωτική δράση των νευροστεροειδών ενδέχεται να συντελέσει στην ανάπτυξη νέων μεθόδων θεραπείας για την αντιμετώπιση των νευροεκφυλιστικών νόσων. / The mutant mouse weaver constitutes a unique genetic model of Parkinson's disease. It is a neurobiological mutation denoted wv and first described by Lane (1964). This mutation in the wrong sense Girk 2 gene located on chromosome 16 of the mouse in a region similar to the region of human chromosome 21 that is responsible for the syndrome Down and leads to modulation of the function of a potassium channel. Because the brain of mammals is among the most sensitive tissues many studies have been done on the effects of drugs (neurosteroids) in the pathogenesis and treatment of neurodegenerative diseases. The agent BNN 50 is a neuroactive steroids having synonymous BNN 20. Produced by neuroactive steroids androgen dehydroepiandrosterone (DHEA) by epoxidation of 17- keto group of using trimethylsulfonium methylide (trimethylsulfonium - methylide). It has the advantage that it is metabolized to endogenous estrogens, such as DHEA, and therefore may be suitable for pharmaceutical use. The purpose of this study is to investigate the effect of oxidative stress neurosteroid BNN 50 in brains muscle at day 21 with simultaneous determination of the levels of lipid peroxidation and protein in the following areas: a) CE (cerebellum), b) HIP (hippocampus) c) CX (cerebral cortex). For this purpose, the animals were divided in the following four groups: 1) normal muscles (control) without BNN 50, with saline 2) control with BNN 50, 3) weaver without BNN 50 with saline and 4) weaver with BNN 50. Muscles accept BNN 50 (100 mg / kg body weight) per day from the first day of life (by intraperitoneal injection) and for 18 days. After the last injection, the mice were sacrificed and brain tissues were isolated in a special antioxidant buffer. For determining the degree of lipid peroxidation in tissue homogenates was used as the index of MDA (dyaldefdi malonate), in free form and bound protein (FrMDA and PrMDA, respectively). Also quantitated and hydroperoxides of lipids and proteins (LOOH and PrOOH, respectively). Regarding the results found that: (1) the neuroactive steroids BNN 50 acts antioxidants in two of the three brain regions studied (hippocampus and cerebellum), and (2) the weaver mice dosed with the drug were lower in three of four indicators for monitoring lipid peroxidation and protein than the protein peroxides. Therefore, the antioxidant activity of neurosteroids may contribute to the development of new therapies for the treatment of neurodegenerative diseases.

Τις τελευταίες δεκαετίες υπάρχει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για το ρόλο των ROS στην πειραματική και κλινική ιατρική (Alexandre et al., 2007; Zheleva et al., 2007; Videla et al., 2007). Οι ROS, όπως το ανιόν του υπεροξειδίου, το υπεροξείδιο του υδρογόνου (ΗΡ) και η υδροξυλική ρίζα, είναι γνωστό ότι διαδραματίζουν ένα διττό ρόλο στα βιολογικά συστήματα, όπου είναι επιβλαβείς στις υψηλές και ευεργετικές στις χαμηλές συγκεντρώσεις (Valko et al., 2004). Στις υψηλές συγκεντρώσεις οι ROS φαίνεται να διαμεσολαβούν την απόπτωση. Ενδογενή ή εξωγενή ερεθίσματα οδηγούν στη συσσώρευση των ROS, το λεγόμενο «οξειδωτικό στρες», που χαρακτηρίζεται από βλάβη των κυτταρικών δομών, των λιπιδίων, των μεμβρανών, των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων (Poli et al., 2004). Αντίθετα, οι χαμηλές συγκεντρώσεις των ROS μέσα στα κύτταρα δρούν ως δεύτεροι αγγελιοφόροι σε αρκετά ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια που οδηγούν στην ενεργοποίηση κινασών τυροσίνης, των ΜΑΡ κινασών, της πρωτεϊνικής κινάσης C, του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, πρωτεϊνικών φωσφατασών, των καναλιών καλίου και των μεταγραφικών παραγόντων AP-1 και NF-κB (Droge, 2002). Πρόσφατα έχουμε δείξει ότι υπό φυσιολογικές, μη-στρεσογόνες συνθήκες, το ΗΡ επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση στα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη LNCaP, μέσω ενεργοποίησης της έκφρασης του αυξητικού παράγοντα HARP (Polytarchou et al., 2005). Η HARP ή πλειοτροπίνη είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας 18 kDa που παρουσιάζει υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Η HARP είναι υψηλά συντηρημένη μεταξύ των διαφόρων ειδών, όπως ο άνθρωπος, το ποντίκι, ο αρουραίος, τα βοειδή, τα ψάρια, ο βάτραχος και τα έντομα, και το γονίδιό της εκφράζεται σε ένα ιδιαίτερα περιορισμένο χρονικό και χωρικό μοτίβο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Φαίνεται ότι η HARP είναι μια σημαντική πρωτεΐνη που συμβάλλει ενδεχομένως στη λειτουργία διαφόρων ρυθμιστικών συστημάτων. Αρκετά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η HARP εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις διάφορες κυτταρικές διαδικασίες (Kadomatsu and Muramatsu, 2004; Papadimitriou et al., 2004). Επιπλέον, η HARP ανιχνεύεται σε μια πληθώρα καρκινωμάτων λειτουργώντας ως πρωτο-ογκογονίδιο και φαίνεται να παίζει κύριο ρόλο στη φυσιολογική και την επαγόμενη από καρκινικούς όγκους αγγειογένεση (Kadomatsu and Muramatsu, 2004; Papadimitriou et al., 2004; Hatziapostolou et al., 2005;2006; Polykratis et al., 2005; Christman et al., 2005; Zhang et al., 2006). Είναι πλέον γνωστό ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις ROS ενεργοποιούν ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια που οδηγούν σε ενισχυμένη αγγειογένεση in vivo (Maulik and Das, 2002; Polytarchou and Papadimitriou, 2004; Ushio-Fukai, 2006; Kim et al., 2006; Chen et al., 2007) και ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro (Lelkes et al., 1998; Maulik and Das, 2002; Stone and Collins, 2002; Yasuda et al., 1999; Polytarchou and Papadimitriou, 2004; Ushio-Fukai, 2006; Kim et al., 2006; Chen et al., 2007; Guo et al., 2007). Επίσης, οι ROS, όπως το ανιόν του υπεροξειδίου και το ΗΡ, φαίνεται να διαμεσολαβούν τα αγγειογενετικά σήματα που ξεκινούν από αυξητικούς παράγοντες, όπως ο VEGF (Lin et al., 2003 Ushio-Fukai et al., 2002). Προηγούμενη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας έδειξε ότι το ανιόν του υπεροξειδίου και το ΗΡ είναι πιθανοί επαγωγείς των λειτουργιών των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro, ενδεχομένως μέσω επαγωγής της ενεργοποίησης της ενδοθηλιακής συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου (eNOS), που οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή του ενδογενούς μονοξειδίου του αζώτου (NO) και επακόλουθη ενεργοποίηση της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης (sGC) (Polytarchou and Papadimitriou, 2005). Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η πιθανή εμπλοκή της eNOS στην επαγωγή της παραγωγής της HARP από χαμηλές συγκεντρώσεις ΗΡ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του ανθρώπινου γονιδίου της HARP επάγεται από το ΗΡ μέσω ενεργοποίησης της eNOS στα κύτταρα HUVEC και LNCaP. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, περίσσεια ROS σε συνδυασμό με ανεπάρκεια των κυτταρικών αντιοξειδωτικών συστημάτων οδηγεί σε οξειδωτικό στρες (Halliwell and Whiteman, 2004) και ενεργοποίηση μονοπατιών απόπτωσης και νέκρωσης (Paraskevas et al., 2000; Fleury et al., 2002; Nakano et al., 2004). Ένα δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας ασχολείται με τον τρόπο που οι υψηλές συγκεντρώσεις ΗΡ επηρεάζουν την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων από στεφανιαία φλέβα βοός (CVEC). / -

Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης όπως εκφράζεται στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum και S. minor σε σχέση με τη θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ), αλλά και με το οξειδωτικό στρες, στo πλαίσιο της θεωρίας της οξειδωτικώς επαγόμενης σκληρωτικής διαφοροποίησης (που προτάθηκε από το εργαστήριό μας το 1997). Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Στη διαμόρφωση της ΘΟΚ συμμετέχουν πολλά μη πρωτεϊνικά, πρωτεϊνικά και μεικτά θειολικά και δισουλφιδικά συστατικά, ανάμεσα στα οποία η γλουταθειόνη θεωρείται ο κύριος συνδετικός κρίκος. Επειδή στη διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον υπολογισμό όλων των παραγόντων της ΘΟΚ για την εκπλήρωση του στόχου της μελέτης, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες σε όλους τους οργανισμούς. Παράλληλα, αναπτύχθηκε και μια νέα μέθοδος για την εξειδικευμένη ποσοτικοποίηση του μικρο-κατακερματισμένου DNA, καθώς στη διεθνή βιβλιογραφία οι περισσότερες υπάρχουσες μέθοδοι ήταν ποιοτικές και όχι εξειδικευμένες ως προς το μέγεθος των θραυσμάτων DNA. Επιπρόσθετα, η εκτίμηση των οξειδωτικών βλαβών στο DNA έγινε και με τη μέτρηση ενός γενικού δείκτη αυτών των βλαβών (εγκοπές και σπασίματα) με υπάρχουσα μέθοδο ύστερα από σημαντική τροποποίησή της. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της ειδικής ενεργότητας των βασικών ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ και της σχετιζόμενης με τη ΘΟΚ ενδογενούς βιταμίνης C, καθώς και η ποσοτικοποίηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένοι εξωγενείς τροποποιητές της ΘΟΚ. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης των νέων μεθόδων για την ποσοτικοποίηση των παραμέτρων της ΘΟΚ και των οξειδωτικών βλαβών στο DNA ως προς την εξαγωγή πιο ασφαλών συμπερασμάτων για τη συσχέτιση της ΘΟΚ με το οξειδωτικό στρες. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι η σχετιζόμενη με αυτό ΘΟΚ μεταβάλλεται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Το συμπέρασμα αυτό βασίστηκε στη διαπίστωση (α) της ύπαρξης διαφορετικών για κάθε μορφή διαφοροποίησης ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και αντιοξειδωτικών ενζύμων και (β) διαφορετικών προφίλ-διαβαθμίσεων των συγκεντρώσεων των παραμέτρων της ΘΟΚ και των δεικτών οξειδωτικού στρες. Επιπρόσθετα, ο άμεσος αντιοξειδωτικός ρόλος των ενδογενών μη πρωτεϊνικών θειολικών (με –SH ομάδα) παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση επιβεβαιώθηκε και από τη μείωση της τελευταίας κατά την τεχνητή αύξηση αυτών των παραμέτρων ύστερα από τη χορήγηση τροποποιητών της ΘΟΚ, γεγονός που θα μπορούσε να αποδοθεί στην εξ αυτών αύξηση της ενδογενούς γλουταθειόνης και της κυστεΐνης. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύεται και από την ανάλογη αντιοξειδωτική επίδραση των χορηγούμενων θειολών-τροποποιητών της ΘΟΚ Ν-ακετυλοκυστεΐνη (που ανιχνεύτηκε και ενδοκυτταρίως) και γλουταθειόνη και της μη πρωτεϊνικής θειολικής ουσίας-μάρτυρα διθειοθρεϊτόλη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόλο που τα επίπεδα της ενδογενούς γλουταθειόνης και του δισουλφιδίου της καθώς και η μεταξύ τους αναλογία συσχετίζονται συνήθως με το οξειδωτικό στρες στη διεθνή βιβλιογραφία, στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι δεν συμβαδίζουν με τους αποδεδειγμένους δείκτες του οξειδωτικού στρες υπεροξείδωση των λιπιδίων και οξειδωτικές βλάβες του DNA. Έτσι, ο ρόλος των ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση αποδεικνύεται περίπλοκος, ένεκα του ότι δεν δρουν μόνο ως άμεσοι αντιοξειδωτές αλλά και ως υποστρώματα των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ΘΟΚ. Τέλος, και στους τέσσερις τύπους σκληρωτίων ανιχνεύθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και βιταμίνης C, καθώς και ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ, υποδηλώνοντας ότι ο πιθανός στόχος της συσσώρευσης όλων των παραπάνω παραμέτρων της ΘΟΚ στα σκληρώτια είναι η αξιοποίησή τους για αντιοξειδωτική προστασία των υφών του μυελού του πυρήνα τους κατά το χρονικό διάστημα της αναπτυξιακής τους στασιμότητας, μέχρι να βρεθούν σε κατάλληλες συνθήκες για βλάστηση. / The aim of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to thiol redox state (TRS) and oxidative stress under the theory of the oxidative induction of sclerotiogenesis (proposed by our lab in 1997). Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. TRS is known to be comprised of many non-protein, protein and mixed thiol and disulfide components, with glutathione being the central component. Since there was not available any appropriate method for the determination of all TRS components, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. Additionally, another new method was developed for the quantification of small-sized fragmented DNA, since the existing methods were qualitative and not discriminating DNA size. Complementarily, oxidative damage of DNA was also estimated by a general DNA damage (nicks and fragments) marker by a published method that was significantly modified. TRS was also evaluated by the measurement of the specific activity of certain enzymes that regulate it, by the quantification of the TRS-related antioxidant vitamin C, as well as by the determination of oxidative damage on membrane lipids. Certain exogenous TRS modulators were also used. The results of this study verified the need for the development of the new methods for the determination of TRS parameters and oxidative damage of DNA, since their use allowed a more accurate estimation of the relation of TRS with oxidative stress. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that TRS components are variously formed and dependent on the type of sclerotial differentiation. This conclusion was based on (a) the existence of different (for each type of sclerotial differentiation) endogenous TRS thiol parameters and TRS-related antioxidant enzymes and (b) the different profiles-concentration gradients of TRS parameters and oxidative markers. Moreover, the direct antioxidant role of the endogenous TRS non-protein thiol parameters in sclerotial differentiation was verified by the decrease of the latter during the endogenous increase of those parameters after administration of the specified TRS-modulating substances. This could be attributed to the resulting by those substances increase of the endogenous glutathione and cysteine. This result was also supported by the antioxidant effect of the administered TRS-modulating thiol substances N-acetylcysteine (which was traced also intracellularly) and glutathione, and of the non-protein control-thiol dithiothreitol. It is worth noting that in spite of the fact that endogenous glutathione, its disulfide, and their resulting ratio are usually considered as oxidative stress markers, it was found that in this study these markers are not in accordance with the specific markers of oxidative stress lipid peroxidation and DNA damage in the evaluation of the role of oxidative stress and TRS in sclerotial differentiation. Thus, the role of the thiol parameters of TRS in sclerotial differentiation is very complicated in light of the fact that they do not act only as direct antioxidants but also as substrates of the studied TRS-related enzymes. Finally, in all sclerotial types have been found high levels of intracellular thiol parameters of TRS and vitamin C as well as enzymes that participate to TRS regulation, implying that their possible role is to provide antioxidant protection of the hyphae of the sclerotial medulla until the environmental conditions become appropriate for their germination.

Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ του οξειδωτικού στρες και του ικτέρου στα θηλαστικά in vivo, χρησιμοποιώντας ένα πειραματικό μοντέλο αποφρακτικού ικτέρου στους αρουραίους, καθώς επίσης και στο αίμα ανθρώπων με τον αποφρακτικό ίκτερο κακοήθους προέλευσης. Ειδικότερα, το οξειδωτικό στρες αξιολογήθηκε άμεσα με τη μέτρηση του σχηματισμού της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου (του κεντρικού παράγοντα του οξειδωτικού στρες) και έμμεσα από την υπεροξείδωση λιπιδίων στις διαφορετικές περιοχές εγκεφάλου και σε ορισμένα εσωτερικά όργανα των αρουραίων (έντερο, συκώτι, καρδιά και νεφρό) και στο πλάσμα των ανθρώπων με τον αποφρακτικό ίκτερο. Διαπιστώθηκε ότι η ελεύθερη ρίζα του σουπεροξειδίου αυξάνεται στον εγκεφαλικό φλοιό 67%, τον μεσεγκέφαλο 37%, το συκώτι 75%, το νεφρό 87%, το έντερο 124% και στο ανθρώπινο αίμα 33%, ενώ τα λιπιδικά υπεροξείδια αυξήθηκαν στο νεφρό 30%, το έντερο 15% και το αίμα 128%. Η αύξηση στην ελεύθερη ρίζα του σουπεροξειδίου στο ανθρώπινο αίμα αποδόθηκε στην οξειδάση της ξανθίνης επειδή μειώθηκε στα επίπεδα των μαρτύρων όταν προεπωάστηκε με τον ειδικό αναστολέα της, την αλλοπουρινόλη. Η μελέτη είναι σημαντική όχι μόνο επειδή αποκαλύπτει τον κεντρικό ρόλο της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου στους παθολογικές καταστάσεις όπως ο ίκτερος, αλλά και επειδή εισάγει την ελεύθερη ρίζα του σουπεροξειδίου ως έναν νέο κλινικό δείκτη στους ανθρώπους. / The aim of the present study is to investigate the relationship between oxidative stress and jaundice in mamals in vivo, using an experimental obstructive jaundice model in rats, as well as in the blood of humans with obstructive jaundice of malignant origin. In particular, oxidative stress was assessed directly by measuring the rate of formation of superoxide radical (the central factor of oxidative stress), and indirectly by lipid peroxidation in different brain areas and in certain internal organs of rats (gut, liver, heart and kidney) and in plasma of humans with obstructive jaundice. It was found that superoxide radical was elevated in the cerebral cortex 67%, midbrain 37%, liver 75%, kidney 87%, gut 124% and in human blood 33%, while lipid peroxides were elevated in kidney 30%, gut 15% and blood 128%. The increase of superoxide radical in human blood was attributed to xanthine oxidase because it was decreased to control levels by its specific inhibitor allopurinol. The study is important not only because it uncovers the central role of superoxide radical in pathological conditions such as jaundice, but also because it introduces superoxide radical as a new clinical marker in humans.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, S. sclerotiorum, R. solani και S. minor σε σχέση με το οξειδωτικό στρες. Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Τα πιο σημαντικά υπεροξείδια που συμβάλλουν στην δημιουργία οξειδωτικού στρες είναι: α) η ρίζα του σουπεροξειδίου (O2•-), που είναι το πρωταρχικό αίτιο του οξειδωτικού στρες, β) το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), που κυρίως προκύπτει από την ένωση δύο μορίων O2•- (αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής) και γ) τα λιπιδικά υδροϋπεροξείδια (LOOH), που είναι από τα πρώιμα αποτελέσματα του οξειδωτικού στρες, λόγω της προσβολής των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Επειδή λοιπόν στην διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον προσδιορισμό του O2•-, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες, σε όλους τους οργανισμούς. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης των βασικών ενζύμων που σχετίζονται με τα προαναφερθέντα υπεροξείδια τα οποία είναι: α) η δισμουτάση του O2•- (SOD), που επιταχύνει την αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής, β) η καταλάση (CAT), που καταναλώνει το H2O2, γ) οι μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (NSPX) που χρησιμοποιούν το H2O2 και τα LOOH σαν υπόστρωμα για να οξειδώνουν άλλα μόρια και δ) η οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ), που ανιχνεύεται για πρώτη φορά σε μύκητες και είναι υπεύθυνη μεταξύ άλλων και για την παραγωγή του O2•- και H2O2 στους οργανισμούς. Ακόμη, έγινε εκτίμηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων με τη μέτρηση των αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (MDA). Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εξωγενείς τροποποιητές των παραπάνω μορίων: α) μιμητές της SOD β) H2O2 γ) υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου (λιπιδικό υδροϋπεροξείδιο) και δ) αμινοτριαζόλη (αναστολέας της CAT). Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης της νέας μεθόδου ποσοτικοποίησης του O2•-. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι οι σχετιζόμενοι με αυτό παράγοντες που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη μεταβάλλονται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Τα βασικότερα συμπεράσματα αυτής της μελέτης είναι: α) το O2•- φαίνεται ότι παίζει έμμεσο ρόλο στην έναρξη της σκληρωτιογένεσης των μυκήτων S. rolfsii και S. sclerotiorum και άμεσο στων μυκήτων R. solani και S. minor και κύρια πηγή παραγωγής του O2•- είναι τα μιτοχόνδρια και δευτερευόντως η ΧΟ β) η SOD που υπάρχει σε όλους τους μύκητες χρησιμοποιείται από αυτούς για τη μετατροπή του O2•- σε H2O2 γ) η ΧΟ που μέχρι σήμερα δεν ήταν γνωστή η ύπαρξή της στους μύκητες, καθώς και η EC-SOD αλλά και το EC-H2O2, δεν σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και ως γνωστόν μπορεί να εμπλέκονται στην προσβολή των φυτών ξενιστών από τους μύκητες αυτούς δ) το H2O2 επάγει την έναρξη της σκληρωτιογένεσης δρώντας σαν παράγοντας σημειακού κυτταρικού πολλαπλασιασμού ε) η CAT που υπάρχει σε όλους τους μύκητες στο αδιαφοροποίητο μόνο στάδιο, μάλλον χρησιμοποιείται από αυτούς ώστε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός να μην γίνεται σε μεγάλη ένταση και αναστείλλει την σημειακή διαφοροποίηση ζ) οι NSPX που εντοπίζονται σε όλους τους μύκητες φαίνεται ότι ελέγχουν τα επίπεδα του H2O2 κυρίως στο διαφοροποιημένο στάδιο η) τα LOOH φαίνεται να δρουν στις μεμβράνες των μυκήτων και σχετίζονται με διαδικασίες μεταβίβασης κυτταρικών μηνυμάτων που επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο θ) οι μιμητές της SOD Tiron και Tempol, που είχαν ανασταλτική δράση στην διαφοροποίηση θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μη τοξικά αντιμυκητιακά παρασκευάσματα. / The purpose of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to oxidative stress. Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. The most important peroxides that are responsible for oxidative stress are: a) superoxide radical (O2•-), the primary cause element of oxidative stress, b) hydrogen peroxide (H2O2), produced by the reaction between two O2•- (dismutation reaction), and c) lipid hydroperoxides (LOOH), the primary consequences of oxidative destruction due to free radical attack to polyunsaturated fatty acids. Since there was not available any appropriate method for the quantification of O2•-, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. In addition, the estimation of the concentration of certain enzymes that regulate the levels of the peroxides mentioned above was also used. These enzymes are a) superoxide dismutase (SOD), which catalyzes the dismutation reaction, b) catalase (CAT), which destroys H2O2, c) non-specific peroxidases (NSPX), which use either H2O2 or LOOH as substrates in order to oxidize other molecules and d) xanthine oxidase (XO), which was detected for the first time in fungi and is responsible, among other functions, for the production of O2•- in organisms. Furthermore, the aldehydic adducts of lipid peroxidation (MDA) were measured in order to evaluate the oxidative destruction of membrane lipids. Finally, specific externally added modulators of the above molecules were used, like: a) SOD mimetics b) H2O2 c) cumene hydroperoxide (lipid hydroperoxide) and d) aminotriazole (CAT inhibitor). The results of this study verified the need for the development of the new method for the quantification of O2•-. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that its components, tested in this study, are formed and changed variously, depending on the type of sclerotial differentiation. The most important conclusions of this study are: a) O2•- plays an indirect role in the initiation of sclerotiogenesis in fungi S. rolfsii and S. sclerotiorum, while in R. solani and S. minor its role is direct, and the main source that produces it in all four fungi are mitochondria and secondarily the ΧΟ enzyme, b) SOD is used by these fungi in order to convert O2•- to H2O2 via the dismutation reaction, c) ΧΟ which was found for the first time in fungi as well as EC-SOD and EC-H2O2, are not related with differentiation and possibly they are involved in tha attack of target plants by these fungi, d) H2O2 induces the initiation of sclerotiogenesis acting as a cell proliferating factor, e) CAT which was found in all fungi only in the undifferentiated stage, is probably used by them in order to control cell proliferation so as to avoid inhibition of sclerotiogenesis, f) NSPX are possibly used by these fungi in order to control H2O2 concentration mainly in the differentiated stage, g) LOOH appear to act on cell membrane and are related to signal transduction processes which affect cell cycle and h) SOD mimetics Tiron and Tempol, which reduced differentiation could be used as non-toxic fungicides.

Η νόσος του Parkinson χαρακτηρίζεται από τη βαθμιαία, εκλεκτική νευροεκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μελαινοραβδωτής οδού. Η μειωμένη δραστηριοποίηση των ντοπαμινεργικών υποδοχέων που προκαλείται από την ανεπάρκεια ντοπαμίνης τροποποιεί τη λειτουργία των βασικών γαγγλίων και αναστέλλει τα κινητικά συστήματα. Ιδανικό πειραματικό μοντέλο αποτελεί το μοντέλο weaver, το οποίο εμφανίζει το ίδιο μοτίβο νευροεκφύλισης με τους παρκινσονικούς ασθενείς καθώς και περισσότερη από 70% μείωση της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα. Το γεγονός πως δεν υπάρχει σήμερα αποτελεσματική θεραπεία που να σταματά ή να αναστρέφει την εξέλιξη της νόσου, δημιουργεί την ανάγκη ανακάλυψης ενός φαρμακευτικού σχήματος το οποίο θα έχει νευροπροστατευτική δράση και θα περιορίζει τις παρενέργειες. Προηγούμενα αποτελέσματα της ομάδας μας δείχνουν σημαντική επιβίωση των ντοπαμινεργικών κυττάρων στο μοντέλο weaver μετά από χρόνια χορήγηση του ενδογενούς νευροστεροειδούς DHEAS, του χημικού αναλόγου του ΒΝΝ-50 (το οποίο δε μεταβολίζεται σε οιστρογόνα) και του φαρμακευτικού συνδυασμού του ΒΝΝ-50 με τη Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC), με το τελευταίο να επαναφέρει πλήρως τον αριθμό των κυττάρων στη μέλαινα ουσία. Στην παρούσα εργασία θελήσαμε να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς μέσω των οποίων επιτυγχάνεται η νευροπροστασία που προκαλεί η συγχορήγηση του συνδυασμού BNN-50/ΝAC. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε την αντιαποπτωτική, καθώς και την αντιοξειδωτική δράση του σχήματος BNN-50/NAC. Οι δύο δείκτες επιλέχθηκαν λαμβάνοντας υπόψιν τον κεντρικό ρόλο του αποπτωτικού θανάτου στη διαδικασία της νευροεκφύλισης, καθώς και το ρόλο του οξειδωτικού στρες στην παθογένεια της νόσου. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν πλειοτροπική δράση του φαρμακευτικού συνδυασμού BNN-50/NAC, η οποία εκφράζεται μέσω της ισχυρής αντιαποπτωτικής και αντιοξειδωτικής του δράσης. / Parkinson 's disease is characterized by the progressive, selective neurodegeneration of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway. The decreased activation of dopamine receptors caused by insufficient dopamine levels, modifies the function of the basal ganglia circuit and inhibits the mobility systems. The weaver model consists an ideal model for neuroprotection studies, which exhibits the same pattern of neurodegeneration as the parkinsonian patients and more than 70% decrease of dopamine in the striatum. The fact that there is currently no effective treatment to attenuate or reverse the disease progression, creates the need for discovery of a drug combination which will exhibit neuroprotective effect and reduce the side effects. Previous results of our group, have shown a significant survival of dopaminergic neurons in weaver mice after chronic administration of endogenous neurosteroid DHEA-S, the chemical analog BNN-50 (which is not metabolized to estrogens) and the combination of the BNN-50 with N-acetylcysteine (NAC,with the latter combination completely rescuing the number of dopaminergic cells of the substantia nigra. The aim of this study was to investigate the mechanisms of neuroprotection induced by coadministration of combination BNN-50/NAC. For this purpose, we evaluated the possible antiapoptotic and antioxidant action of the BNN-50/NAC combination. Our results suggest a pleiotropic effect of the BNN-50/NAC drug combination, that is expressed through strong antiapoptotic and antioxidant activity.