Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, S. sclerotiorum, R. solani και S. minor σε σχέση με το οξειδωτικό στρες. Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Τα πιο σημαντικά υπεροξείδια που συμβάλλουν στην δημιουργία οξειδωτικού στρες είναι: α) η ρίζα του σουπεροξειδίου (O2•-), που είναι το πρωταρχικό αίτιο του οξειδωτικού στρες, β) το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), που κυρίως προκύπτει από την ένωση δύο μορίων O2•- (αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής) και γ) τα λιπιδικά υδροϋπεροξείδια (LOOH), που είναι από τα πρώιμα αποτελέσματα του οξειδωτικού στρες, λόγω της προσβολής των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Επειδή λοιπόν στην διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον προσδιορισμό του O2•-, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες, σε όλους τους οργανισμούς. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης των βασικών ενζύμων που σχετίζονται με τα προαναφερθέντα υπεροξείδια τα οποία είναι: α) η δισμουτάση του O2•- (SOD), που επιταχύνει την αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής, β) η καταλάση (CAT), που καταναλώνει το H2O2, γ) οι μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (NSPX) που χρησιμοποιούν το H2O2 και τα LOOH σαν υπόστρωμα για να οξειδώνουν άλλα μόρια και δ) η οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ), που ανιχνεύεται για πρώτη φορά σε μύκητες και είναι υπεύθυνη μεταξύ άλλων και για την παραγωγή του O2•- και H2O2 στους οργανισμούς. Ακόμη, έγινε εκτίμηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων με τη μέτρηση των αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (MDA). Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εξωγενείς τροποποιητές των παραπάνω μορίων: α) μιμητές της SOD β) H2O2 γ) υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου (λιπιδικό υδροϋπεροξείδιο) και δ) αμινοτριαζόλη (αναστολέας της CAT). Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης της νέας μεθόδου ποσοτικοποίησης του O2•-. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι οι σχετιζόμενοι με αυτό παράγοντες που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη μεταβάλλονται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Τα βασικότερα συμπεράσματα αυτής της μελέτης είναι: α) το O2•- φαίνεται ότι παίζει έμμεσο ρόλο στην έναρξη της σκληρωτιογένεσης των μυκήτων S. rolfsii και S. sclerotiorum και άμεσο στων μυκήτων R. solani και S. minor και κύρια πηγή παραγωγής του O2•- είναι τα μιτοχόνδρια και δευτερευόντως η ΧΟ β) η SOD που υπάρχει σε όλους τους μύκητες χρησιμοποιείται από αυτούς για τη μετατροπή του O2•- σε H2O2 γ) η ΧΟ που μέχρι σήμερα δεν ήταν γνωστή η ύπαρξή της στους μύκητες, καθώς και η EC-SOD αλλά και το EC-H2O2, δεν σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και ως γνωστόν μπορεί να εμπλέκονται στην προσβολή των φυτών ξενιστών από τους μύκητες αυτούς δ) το H2O2 επάγει την έναρξη της σκληρωτιογένεσης δρώντας σαν παράγοντας σημειακού κυτταρικού πολλαπλασιασμού ε) η CAT που υπάρχει σε όλους τους μύκητες στο αδιαφοροποίητο μόνο στάδιο, μάλλον χρησιμοποιείται από αυτούς ώστε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός να μην γίνεται σε μεγάλη ένταση και αναστείλλει την σημειακή διαφοροποίηση ζ) οι NSPX που εντοπίζονται σε όλους τους μύκητες φαίνεται ότι ελέγχουν τα επίπεδα του H2O2 κυρίως στο διαφοροποιημένο στάδιο η) τα LOOH φαίνεται να δρουν στις μεμβράνες των μυκήτων και σχετίζονται με διαδικασίες μεταβίβασης κυτταρικών μηνυμάτων που επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο θ) οι μιμητές της SOD Tiron και Tempol, που είχαν ανασταλτική δράση στην διαφοροποίηση θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μη τοξικά αντιμυκητιακά παρασκευάσματα. / The purpose of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to oxidative stress. Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. The most important peroxides that are responsible for oxidative stress are: a) superoxide radical (O2•-), the primary cause element of oxidative stress, b) hydrogen peroxide (H2O2), produced by the reaction between two O2•- (dismutation reaction), and c) lipid hydroperoxides (LOOH), the primary consequences of oxidative destruction due to free radical attack to polyunsaturated fatty acids. Since there was not available any appropriate method for the quantification of O2•-, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. In addition, the estimation of the concentration of certain enzymes that regulate the levels of the peroxides mentioned above was also used. These enzymes are a) superoxide dismutase (SOD), which catalyzes the dismutation reaction, b) catalase (CAT), which destroys H2O2, c) non-specific peroxidases (NSPX), which use either H2O2 or LOOH as substrates in order to oxidize other molecules and d) xanthine oxidase (XO), which was detected for the first time in fungi and is responsible, among other functions, for the production of O2•- in organisms. Furthermore, the aldehydic adducts of lipid peroxidation (MDA) were measured in order to evaluate the oxidative destruction of membrane lipids. Finally, specific externally added modulators of the above molecules were used, like: a) SOD mimetics b) H2O2 c) cumene hydroperoxide (lipid hydroperoxide) and d) aminotriazole (CAT inhibitor). The results of this study verified the need for the development of the new method for the quantification of O2•-. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that its components, tested in this study, are formed and changed variously, depending on the type of sclerotial differentiation. The most important conclusions of this study are: a) O2•- plays an indirect role in the initiation of sclerotiogenesis in fungi S. rolfsii and S. sclerotiorum, while in R. solani and S. minor its role is direct, and the main source that produces it in all four fungi are mitochondria and secondarily the ΧΟ enzyme, b) SOD is used by these fungi in order to convert O2•- to H2O2 via the dismutation reaction, c) ΧΟ which was found for the first time in fungi as well as EC-SOD and EC-H2O2, are not related with differentiation and possibly they are involved in tha attack of target plants by these fungi, d) H2O2 induces the initiation of sclerotiogenesis acting as a cell proliferating factor, e) CAT which was found in all fungi only in the undifferentiated stage, is probably used by them in order to control cell proliferation so as to avoid inhibition of sclerotiogenesis, f) NSPX are possibly used by these fungi in order to control H2O2 concentration mainly in the differentiated stage, g) LOOH appear to act on cell membrane and are related to signal transduction processes which affect cell cycle and h) SOD mimetics Tiron and Tempol, which reduced differentiation could be used as non-toxic fungicides.

Με στόχο την απομόνωση και χαρακτηρισμό εγγενών μυκοπαράσιτων του φυτοπαθογόνου μύκητα Sclerotinia sclerotiorum, απομονώθηκαν 199 υποψήφια μυκοπαράσιτα από χώματα καλλιεργουμένων εδαφών ή κήπων της δυτικής Ελλάδας. Από την προκαταρκτική αξιολόγηση των μυκοπαράσιτων αυτών επιλέχθηκαν τα πλέον αποτελεσματικά δεκαοκτώ, τα οποία αξιολογήθηκαν σε άγαρ ύδατος, σε αποστειρωμένο χώμα και σε μη-αποστειρωμένο (φυσικό χώμα). Σε γενικές γραμμές τα 18 μυκοπαράσιτα έδωσαν υψηλά επίπεδα παρασιτισμού του φυτοπαθογόνου απουσία ενδογενών ανταγωνιστών ενώ ένα από τα απομονωθέντα στελέχη του γένους Gliocladium παρουσίασε άριστα αποτελέσματα και παρουσία ενδογενών ανταγωνιστών. Ειδικότερα η απομόνωση Α-9 εκδήλωσε άριστη ανταγωνιστική δράση. Η μορφή του μολύσματος (υφές, σπόρια) αλλά και το περιβάλλον (άγαρ ύδατος, αποστειρωμένο και μη αποστειρωμένο χώμα) επηρεάζουν αποφασιστικά την συμπεριφορά και ικανότητα μυκοπαρασιτισμού των μυκοπαράσιτων με αποτέλεσμα στα πειράματα αξιολόγησης να παρατηρούνται σημαντικές διαφορές. Τα πλέον σταθερά στην συμπεριφορά τους ήταν τρία στελέχη που ανήκουν στο γένος Gliocladium. Ο ανταγωνισμός που υφίστανται τα προστιθέμενα μυκοπαράσιτα από τα ιθαγενή μικρόβια είναι σημαντικός και είναι ένας παράγοντας που θα πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη. Η ιστοπαθολογική μελέτη του παρασιτισμού των σκληρωτίων έδειξε ότι ένα από τα απομονωθέντα στελέχη του γένους Gliocladium ήταν το ταχύτερο και καταστρεπτικότερο μυκοπαράσιτο των σκληρωτίων του φυτοπαθογόνου μύκητα. Αρχικά διαπιστώθηκαν οι υφές του μυκοπαράσιτου κάτω από τον φλοιό του σκληρωτίου και λίγο αργότερα στην εντεριώνη. Παράλληλα σχηματίσθηκαν τα πρώτα χλαμυδοσπόρια κοντά στον φλοιό ακολουθούμενα από την εμφάνιση μεγάλα διάκενων. Τελικά οι υφές του μυκοπαράσιτου αποίκισαν ολόκληρο το σκληρώτιο και ακολούθησε αποδιοργάνωση του σκληρωτίου. Η μελέτη στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης έδειξε ότι η βλάστηση των σπορίων γενικεύεται στις 15 ώρες επώασης. Στις περισσότερες περιπτώσεις διαπιστώθηκε περιπλάνηση των βλαστικών σωλήνων πριν τη διείσδυσή τους εντός του σκληρωτίου, ενώ δεν διαπιστώθηκε σχηματισμός απρεσσορίων και διακλαδώσεων του βλαστικού σωλήνα. Τα πειράματα θερμοκηπίου έδειξαν ότι το πλέον καταστρεπτικό μυκοπαράσιτο του γένους Gliocladium συνέβαλε στη μέγιστη προστασία των σποριόφυτων λάχανου έναντι του φυτοπαθογόνου μύκητα S. sclerotiorum, γεγονός που υποδηλώνει ότι το μυκοπαράσιτο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αποτελεσματική καταπολέμηση του φυτοπαθογόνου μύκητα στον αγρό. / In order to isolate and characterize endogenous mycoparasites against the phytopathogenic fungi, Sclerotinia sclerotiorum, we isolated 199 candidate mycoparasites from soils of western Greece. Preliminary evaluation resulted in the isolation of 18 isolates with significant mycoparasitic efficiency. Evaluation of these isolates in water agar, sterilized soil and natural soil gave good results upon the parasitism of sclerotia of S. sclerotiorum and revealed that one of them belonging to genus Gliocladium was the most efficient under all tried conditions. This isolate showed high efficiency at both presence and absence of endogenous antagonist. Particularly, isolation A-9 revealed excellent antagonistic action. Histopathology studies demonstrated that the isolated A-9 (Gliocladium spp) was the most fast in parasitizing and destroying the sclerotia of S. sclerotiorum. At the beginning of the infection, there were observed mycoparasite hyphae under the rind and little later into the medulla of the sclerotia. At the same time the first chlamydospores were formed near the rind followed by the appearance of gaps. Finally, the mycoparasite hyphae colonize the whole sclerotium leading to there disorganization. The added mycoparasites face out strong antagonism from the indigenous microorganism and this (antagonism) is an agent that must be seriously taken account. The scanning electron microscopy study showed spore germination initiation about 12 hours after the beginning of incubation and (the spore germination) is generalised after 15 hours of incubation. In most cases it was observed wandering of the germination tubes before sclerotic penetration. Formation of appressoria was difficult to be observed because of the shape of the surface and the crust that exists due to deflation of exudates. Evaluation of plant-protection capability in pot-trials showed that the isolated A-9 (Gliocladium spp) with the faster and highest parasitic exhibited presented the highest plant-protection capability a fact that indicates that this mycoparasite could be used for large-scale biocontrol applications against the phytopathogenic fungi, Sclerotinia sclerotiorum.