Το οξειδωτικό στρες είναι μια κατάσταση στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα όταν σε αυτά οι αντιοξειδωτική άμυνα υπερκεράζεται έναντι των οξειδωτικών εκθέσεων των κυττάρων και χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση ελευθέρων ριζών οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν καταστροφές στα βιομόρια του κυττάρου (λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες). Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να εμπλέκεται στους μηχανισμούς τόσο φυσιολογικών (διαφοροποίηση, γήρανση), όσο και παθολογικών καταστάσεων (νευροεκφυλιστικές παθήσεις). Σε περίπτωση έντονου οξειδωτικού στρες εξαιτίας φυσιολογικών ή παθολογικών ερεθισμάτων στα κύτταρα επέρχονται βλάβες σε μόρια, όπως οι πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου η ακριβής ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής υπεροξείδωσης με μεθόδους που εξειδικευμένα ποσοτικοποιούν συγκεκριμένες αλλαγές, όπως τη δημιουργία των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, είναι χρήσιμες για την εκτίμηση της έκτασης της βλάβης. Οι καρβονυλομάδες δημιουργούνται σε συγκεκριμένα αμινοξέα των πρωτεϊνών (λυσίνη, αργινίνη, προλίνη και θρεονίνη [1]), ύστερα από έκθεση των κυττάρων/οργανισμών σε συνθήκες υψηλού οξειδωτικού στρες. Για την ποσοτικοποίησή τους, η κλασική φωτομετρική μέθοδος, που στηρίζεται στην αντίδραση των καρβονυλομάδων με το αντιδραστήριο 2,4,-dinitrophenylhydrazine (DNPH) παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα. Τα βασικότερα είναι: (1) η μη φωτομετρική διάκριση της προκύπτουσας υδραζόνης από το ελεύθερο DNPH, σε συνδυασμό με την απομόνωσή του μέσω πρωτεϊνικής καταβύθισης και αναποτελεσματικού πλυσίματος του πρωτεϊνικού ιζήματος για την απομάκρυνση του μη ειδικά συνδεδεμένου DNPH στην πρωτεΐνη, και (2) η υδρόλυση του δεσμού της υδραζόνης σε όξινο pH. Ως εκ τούτου, η κλασική μέθοδος του DNPH παρουσιάζει προβλήματα επαναληψιμότητας και ακρίβειας. H παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας νέας ευαίσθητης και απλής μεθοδολογίας με βάση το αντιδραστήριο DNPH για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε δείγματα ιστών, η οποία θα αντιμετωπίζει τα προαναφερθέντα μειονεκτήματα της κλασικής φωτομετρικής μεθόδου. Τα αποτελέσματα της διατριβής έχουν ευρεία βιολογική σημασία εξαιτίας του ότι η νέα μέθοδος (αλκαλική DNPH μέθοδος) μπορεί να εφαρμοστεί σε ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δειγμάτων, κάνοντας τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες έναν αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού στρες. / Oxidative stress is a condition where the cells are characterized by low antioxidant defense, which leads to the generation of oxygen/nitrogen free radicals that damage the central molecules of the cell (lipids, nucleic acids, proteins). Oxidative stress is involved in both physiological (e.g. differentiation, aging) and pathological conditions (e.g. neurodegenerative diseases). In case of severe oxidative stress due to physiological or pathological parameters in the cells, proteins and other macromolecules are damaged. Therefore, the accurate quantification of protein peroxidation with assays for specific oxidative modifications such as protein carbonyls is very important for the evaluation of the extent of damage. Carbonyl groups are formed in certain amino acids of proteins (lysine, arginine, proline, and threonine residues [1]), following the exposure of cells/organisms to high oxidative stress conditions. For their quantification, the standard photometric method, based on the reaction of carbonyl groups with the reagent 2,4,-dinitrophenylhydrazine (DNPH) presents several disadvantages. The main disadvantages are: (1) the non-photometric differentiation of the protein-DNPH hydrazone from free DNPH, coupled with its isolation via protein precipitation and ineffective washing of the protein precipitate to remove non-specifically bound DNPH to the protein, and (2) the hydrolysis of the hydrazone bond at acidic pH. Therefore, the standard DNPH assay cannot be used accurately. The present study aims to develop a novel sensitive and simple DNPH-based methodology for the quantification of the protein carbonyls in tissue samples, which overcomes all the aforementioned disadvantages. The findings presented here are very important because the new assay (alkaline DNPH assay) is applicable to a wide spectrum of biological samples, making protein carbonyls a very reliable marker of oxidative stress.

Το οξειδωτικό στρες είναι μια κατάσταση στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα όταν σε αυτά η αντιοξειδωτική άμυνα υπερκεράζεται έναντι των οξειδωτικών εκθέσεων των κυττάρων και χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση ελευθέρων ριζών οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν καταστροφές στα βιομόρια του κυττάρου (λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες). Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να εμπλέκεται στους μηχανισμούς τόσο φυσιολογικών (διαφοροποίηση, γήρανση), όσο και παθολογικών καταστάσεων (νευροεκφυλιστικές παθήσεις). Σε περίπτωση έντονου οξειδωτικού στρες εξαιτίας φυσιολογικών ή παθολογικών ερεθισμάτων στα κύτταρα επέρχονται βλάβες σε μόρια, όπως οι πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου η ακριβής ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής υπεροξείδωσης με μεθόδους που εξειδικευμένα ποσοτικοποιούν συγκεκριμένες αλλαγές, όπως τη δημιουργία των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, είναι χρήσιμες για την εκτίμηση της έκτασης της βλάβης. Οι καρβονυλομάδες υπερισχύουν ποσοτικά ως προϊόντα οξείδωσης των πρωτεϊνών και δημιουργούνται σε συγκεκριμένα αμινοξέα των πρωτεϊνών (λυσίνη, αργινίνη, προλίνη και θρεονίνη [1]) ύστερα από έκθεση των κυττάρων/οργανισμών σε συνθήκες υψηλού οξειδωτικού στρες. Για την ποσοτικοποίησή τους, η κλασική φθορισμομετρική μέθοδος, που στηρίζεται στην αντίδραση των καρβονυλομάδων με το αντιδραστήριο fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTC) παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα. Τα βασικότερα είναι: (1) η μη φθορισμομετρική διάκριση της προκύπτουσας υδραζόνης από το ελεύθερο FTC, σε συνδυασμό με την απομόνωσή του μέσω πρωτεϊνικής καταβύθισης και αναποτελεσματικού πλυσίματος του πρωτεϊνικού ιζήματος για την απομάκρυνση του μη ειδικά συνδεδεμένου FTC στην πρωτεΐνη, και (2) η υδρόλυση του δεσμού της υδραζόνης σε σύντομο χρονικό διάστημα. Ως εκ τούτου, η κλασική φθορισμομετρική μέθοδος του FTC παρουσιάζει προβλήματα επαναληψιμότητας και ακρίβειας. H παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας νέας ευαίσθητης και απλής φθορισμομετρικής μεθοδολογίας με βάση ένα νέο αντιδραστήριο, το Rhodamine B Hydrazine (RBH) για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε δείγματα ιστών, η οποία θα αντιμετωπίζει τα προαναφερθέντα μειονεκτήματα της κλασικής φθορισμομετρικής μεθόδου και επιπλέον θα στοχεύει σε μεγαλύτερη ευαισθησία (λιγότερη ποσότητα πρωτεΐνης). Τα αποτελέσματα της διατριβής έχουν ευρεία βιολογική σημασία εξαιτίας του ότι η νέα μέθοδος (φθορισμομετρική RBH μέθοδος) μπορεί να εφαρμοστεί σε ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δειγμάτων, κάνοντας τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες έναν αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού στρες. / Oxidative stress is a condition where the cells are characterized by low antioxidant defense, which leads to the generation of oxygen/nitrogen free radicals that damage the central molecules of the cell (lipids, nucleic acids, proteins). Oxidative stress is involved in both physiological (e.g. differentiation, aging) and pathological conditions (e.g. neurodegenerative diseases). In case of severe oxidative stress due to physiological or pathological parameters in the cells, proteins and other macromolecules are damaged. Therefore, the accurate quantification of protein peroxidation with assays for specific oxidative modifications such as protein carbonyls is very important for the evaluation of the extent of damage. Carbonyl groups are quantitatively the major type of oxidative modification of proteins, and are formed in certain amino acids of proteins (lysine, arginine, proline, and threonine residues [1]), following the exposure of cells/organisms to high oxidative stress conditions. For their quantification, the standard fluorometric method, based on the reaction of carbonyl groups with the reagent fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTC) presents several disadvantages. The main disadvantages are: (1) the non-fluorometric differentiation of the protein-FTC hydrazone from free FTC, coupled with its isolation via protein precipitation and ineffective washing of the protein precipitate to remove non-specifically bound FTC to the protein, and (2) the hydrolysis of the hydrazone bond at acidic pH. Therefore, the standard FTC assay cannot be used accurately. The present study aims to develop a novel sensitive and simple fluorometric assay based on a novel reagent, Rhodamine B Hydrazine (RBH), for the quantification of protein carbonyls in tissue samples, which overcomes all the aforementioned disadvantages. The findings presented here are very important because the new assay (fluorometric RBH assay) is applicable to a wide spectrum of biological samples, making protein carbonyls a very reliable marker of oxidative stress.