Ο Kρόκος ο ήμερος (Crocus sativus Linneaus) ή ζαφορά ή σαφράνι, είναι ένα από τα σπάνια φαρμακευτικά, αρτυματικά και με μεγάλη χρωστική ικανότητα φυτά, που απαντάται από πολύ παλιά στην Ελλάδα. H δρόγη του Crocus sativus L. (saffron) είναι το υπέργειο μέρος του στύλου το οποίο έχει έντονη χρωστική ικανότητα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βαφική ύλη, αποτελεί σημαντικό άρτυμα και έχει φαρμακευτική δράση με νευροπροστατευτικές, αντινεοπλασματικές και αντιλιπιδαιμικές ιδιότητες. Το φυτό Crocus sativus L. (οικογένεια Iridaceae) σήμερα καλλιεργείται σε πολλές περιοχές του κόσμου όπως στην Ινδία, στο Ιράν, στην Κίνα στην Ισπανία, στην Ελλάδα κ.α Εδώ και περίπου 300 χρόνια ο Κρόκος Κοζάνης καλλιεργείται και αναπτύσσεται αποκλειστικά στο Νομό Κοζάνης και κατατάσσεται στην πρώτη κατηγορία κρόκου βιολογικής καλλιέργειας στον κόσμο. Η υψηλή τιμή της δρόγης ευνοεί τη νοθεία της με προσθήκη άλλων ειδών του γένους και με ίνες από κολλώδιο και ζελατίνη που έχουν διασκευασθεί και χρωματισθεί. Η νοθεία του κρόκου απασχόλησε και εξακολουθεί να απασχολεί σοβαρά το εμπόριο αυτού του προϊόντος. Έχει αναφερθεί ότι το 30 % του εμπορικού saffron δεν πληρεί τις προδιαγραφές ποιότητας κάνοντας επιτακτική την ανάγκη μιας αξιόπιστης αναλυτικής μεθοδολογίας για τον ποιοτικό έλεγχο των δειγμάτων του saffron. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό και την ποσοτικοποίηση μερικών βιοδραστικών συστατικών του Crocus sativus L. (κροκίνες και πικροκροκίνη) των στύλων του Crocus sativus L. με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή υπεριώδους-ορατού συστοιχίας φωτοδιόδων (Ηigh Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector, HPLC-DAD). Η αναπτυχθείσα αναλυτική μεθοδολογία περιελάμβανε τρία κύρια στάδια: 1. Προκατεργασία των δειγμάτων του Crocus sativus L. πριν την ανάλυση. 2. Κατασκευή καμπύλης βαθμονόμησης με τη μέθοδο του εσωτερικού προτύπου (IS). 3. Επικύρωση της μεθόδου ( Method Validation) και συγκεκριμένα την εκτίμηση της γραμμικότητας (linearity), της ακρίβειας (precision), της ορθότητας (accuracy)και των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (Limit Of Detection/Quantitation, LOD/LOQ). Η μεθοδολογία HPLC-DAD που αναπτύχθηκε επιτρέπει την αξιόπιστη ποσοτικοποίηση των υπό μελέτη βιοδραστικών συστατικών σε δείγματα saffron. Η μέθοδος παρουσίασε καλή ευαισθησία, ακρίβεια, ορθότητα και γραμμικότητα για ευρεία δυναμική περιοχή καθώς και μικρό χρόνο ανάλυσης (περίπου 30 min) συγκρινόμενη με παλιότερες δημοσιευμένες μεθόδους. Από την εφαρμογή της μεθόδου για την μέτρηση δειγμάτων saffron συμπεράθηκε ότι οι ελληνικοί στύλοι του εμπορικού saffron (Cooperative De Safran, Kozani) είναι πλούσιοι στα υπό μελέτη βιοδραστικά συστατικά και περιείχαν μεγαλύτερες ποσότητες αυτών συγκρινόμενοι με εμπορικά saffron από την Ισπανία και την Συρία. Επίσης χρησιμοποιήθηκε για την χαρτογράφηση βιοδραστικών συστατικών των στύλων σε άλλα ενδημικά taxa του γένους Crocus και συνεπώς για την κατηγοροποίηση αυτών σύμφωνα με την χημική τους ανάλυση και σύγκριση τους ως προς το χημικό περιεχόμενο των στύλων τους και των στύλων του καλλιεργούμενου Crocus. Sativus L. Συνεπώς η προτεινόμενη αναλυτική μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για χαρτογράφηση και ποσοτικοποίηση των κύριων συστατικών του saffron και είναι ένα ιδανικό αναλυτικό εργαλείο για τον έλεγχο ποιότητας των δειγμάτων του saffron καθώς και για την χαρτογράφηση άλλων ενδημικών taxa του γένους Crocus. / Crocus sativus L., a stemless perennial herb of the Iridaceae family, is cultivated in many areas of the Mediterranean region and South Asia (mainly in Iran, India, Greece, Morocco, Italy and Spain) for its red stigmas (style branches, commonly known as saffron) that are used for culinary purposes (spice, food colorant, and in alcoholic and non-alcoholic beverages) and are important ingredients in Mediterranean, Indian and Chinese diet. From ancient times saffron has been also used as a drug to treat various human health conditions. The worldwide saffron production is facing challenging tasks mainly due to the need for quality control and prevention of adulteration, which is especially important for human health. Chemical analysis of Crocus sativus L. styles has shown the presence of unusually polar carotenoids (crocins) that are mono-, di-, and triglycosydic esters of crocetin, a polyene dicarboxylic acid. Crocins (cis and trans glycosyl esters of crocetin) are the colouring components of saffron. The monoterpene aldehydes picrocrocin and its deglycosylated derivative, safranal formed in saffron during drying and storage by hydrolysis of the picrocrocin, are also important components of saffron, responsible of its bitter flavour and aroma, respectively. Saffron extract or its active constituents, crocetin and crocins, could be useful as a treatment for neurodegenative disorders accompanying memory impairment and it is a protective agent against chromosomal damage, a modulator of lipid peroxidation, and an antioxidant and detoxifying spice. Anticeptive and anti-inflammatory, as well as antiseizure, or reducing blood pressure effects have also been reported in animals. The aforementioned beneficial properties of Crocus sativus has made imperative the development of analytical methodologies for monitoring the quality control and batch adulteration, which is especially essential for human health. The goal of the research work was the development of a liquid chromatography diode array detector (HPLC-DAD) method for the quantification of bioactive substances (crocins and picrocrocin) from saffron samples. A simple, sensitive and specific high performance liquid chromatography (HPLC) has been developed in order to quantify simultaneously six major biologically active ingredients of Crocus sativus L. (saffron) namely trans-crocin-4, trans-crocin-3, trans-crocin-2, cis-crocin-4, cis-crocin-3 and picrocrocin. In addition, other extracts of styles of other Crocus taxa, endemic in Greece were analyzed and characterized using the aforementioned developed methodology. The developed analytical methodology included three main stages: 1. Pretreament of styles of Crocus sativus L. prior to analysis. 2. Construction of calibration curves with the method of internal standard (IS). 3.Method Validation) and particularly estimation of linearity, precision, accuracy and Limits Of Detection/Quantitation, LOD/LOQ). The above chromatographic method demonstrated a high separation capability, high sensitivity, precision, accuracy and short analysis time (less than 30 min), compared to previously published methods. The proposed method could be used for monitoring and quantification of the major saffron components. It is an ideal analytical tool for quality control of saffron batches as well as the screening of styles of other Crocus taxa.

Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων». Σκοπός αυτής της έρευνας ήταν η διερεύνηση της επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου τόσο στην αύξηση όσο και στην αποτελεσματικότητα των εντομοπαθογόνων μυκήτων επί των προνυμφών του λεπιδοπτέρου Sesamia nonangrioides. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι εντομοπαθογόνοι μύκητες Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) και Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae) από την συλλογή του Μπενακείου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου των οποίων η διατήρηση έγινε στο εργαστήριο Φυσιολογίας Φυτών του τμήματος Βιολογίας με την μέθοδο των ημιεκλεκτικών υποστρωμάτων (Strasser et al. 1996). Στύλοι του καλλιεργούμενου Crocus sativus εκχυλίστηκαν με διάλυμα 50% v/v μεθανόλης σε νερό (3 mL/50 mg ξηρής δρόγης) για 4 h απουσία φωτός. Οι παραπάνω εντομοπαθογόνοι μύκητες καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία petri με θρεπτικό υλικό Sabouraud Dextrose Agar (S.D.A.) για διάστημα 5 ημερών παρουσία (3,0% v/v) και απουσία (100% S.D.A. αλλά και 98,5% S.D.A. - 1,5% μεθανόλης) εκχυλίσματος. Μετά το πέρας, διαπιστώθηκε ότι η παρουσία της μεθανόλης σε αυτήν τη συγκέντρωση δεν επηρέασε την ανάπτυξη κανενός μύκητα. Περαιτέρω, οι εντομοπαθογόνοι μύκητες B. bassiana και I. fumosorosea δεν επηρεάστηκαν από την παρουσία του εκχυλίσματος κρόκου στο υπόστρωμα ανάπτυξης, ενώ ο εντομοπαθογόνος μύκητας M. robertsii επηρεάστηκε θετικά (P<0,05, τεστ Bonferoni) από την παρουσία του εκχυλίσματος. Επιπροσθέτως μελετήθηκε η επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου στην αποτελεσματικότητα των εντομοπαθογόνων μυκήτων επί των προνυμφών του εντόμου S. nonangrioides.. Για κάθε εντομοπαθογόνο μύκητα παρασκευάστηκαν τρεις συγκεντρώσεις (106, 107, 108 κονίδια/mL) ενώ η θνησιμότητα των προνυμφών καταγραφόταν καθημερινά για 7 ημέρες. Oι εντομοπαθογόνοι μύκητες προκάλεσαν υψηλά ποσοστά θνησιμότητας στις προνύμφες του εντόμου ιδιαίτερα ο I. fumosorosea (υπόστρωμα μόνο S.D.A) προκάλεσε θνησιμότητα του S. nonangrioides που κυμάνθηκε από 80 έως 93%. Η παρουσία του εκχυλίσματος κρόκου στο υπόστρωμα αύξησε σημαντικά (P<0,05, test Bonferoni) τη θνησιμότητα του εντόμου (80-96%) ένεκα του εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii. Η σημαντική θετική επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου στην αύξηση και την αποτελεσματικότητα του εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii επί των προνυμφών του S. nonangrioides χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης ως προς τους μηχανισμούς με τους οποίους επετεύχθη αλλά και ανοίγουν νέους δρόμους ως προς την ανάπτυξη νέων μεθόδων βιολογικής καλλιέργεια. / This thesis was produced as part of the Interdepartmental Graduate Program entitled “Medicinal Chemistry: Design and Development of Medicinal Products”. The intention of this thesis was to study the effect of saffron extract at the growth of entomopathogenic fungi in semi selective substrates and at the efficacy of entomopathogenic fungi on larvae of the insect S. nonangrioides. This study used Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae) from the collection of the Benaki Phytopathological Institute and maintain with the selective medium method in laboratory of Plant Physiology at the Department of Biology (Strasser et al. 1996). Saffron (stigmas of Crocus sativus) was extracted with methanol:water 1:1, v/v (3 mL/50 mg dry plant material) for 4 h in the absence of light. Entomopathogenic fungi were cultured in petri dishes with Sabouraud Dextrose Agar (S.D.A.) for 5 days in the presence (3.0%, v/v) and absence (100% S.D.A. and 98,5% S.D.A. -1,5% methanol) of saffron extract. Methanol in the culture medium did not affect fungal growth at the particular concentration. After the five days, entomopathogenic fungi B. bassiana and I. fumosorosea were not affected by the presence of saffron extract in the growing medium, whereas M. robertsii growth was influenced positively (P<0.05, Bonferoni test) by the presence of saffron extract. In addition, the effect of saffron extract on the efficacy of entomopathogenic fungi on larvae of S. nonangrioides was studied. For each entomopathogenic fungus three concentrations (106, 107, 108 conidia/mL) were used, while the mortality of larvae was recorded daily for 7 days. Entomopathogenic fungi caused high mortality in larvae of the insect; particularly I. fumosorosea (substrate SDA) induced mortality ranging from 80 to 93%. Saffron in the culture medium of M. robertsii significantly (P<0.05, Bonferoni test) increased insect mortality (80 to 96%). The significant positive effect of saffron in the semi-selective substrate on the growth and effectiveness of M. robertsii on S. nonangrioides larvae demand further investigation of the mechanisms of action and pose new dimension in the use of biological agents.

Το σελήνιο (Se) είναι σημαντικό συστατικό πολλών αντιοξειδωτικών ενζύμων. Σε μεγάλες ποσότητες, ωστόσο, είναι ιδιαίτερα τοξικό και καρκινογόνο. Σύμφωνα με προηγούμενες in vitro και in vivo μελέτες του εργαστηρίου μας, το εκχύλισμα των στύλων του Crocus sativus (κρόκος Κοζάνης) εμφανίζει σημαντική αντιοξειδωτική δράση. Σκοπός της εργασίας μας ήταν η μελέτη της επίδρασης της χορήγησης υψηλών συγκεντρώσεων σεληνιώδους νατρίου (Na2SeO3) καθώς και της χορήγησης μεθανολικού εκχυλίσματος κρόκου σε επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές (φλοιός, μεσεγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα) αναπτυσσόμενων επίμυων. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (n=6/ομάδα): “Se”: 20 μmol Na2SeO3/kg (υποδορίως -10η ημέρα μετά τη γέννηση τους), “CrSeCr”: 60 mg εκχυλίσματος κρόκου/kg (ενδοπεριτοναϊκώς - 9η ημέρα) 20 μmol Na2SeO3/kg (υποδορίως - 10η ημέρα)/60 mg εκχυλίσματος/kg (ενδοπεριτοναϊκώς - 12η ημέρα), “SeCrCr”: 20 μmol Na2SeO3/kg (υποδορίως - 10η ημέρα)/60 mg εκχυλίσματος κρόκου/kg (ενδοπεριτοναϊκώς - 11η και 12η ημέρα), μάρτυρες: ενέσιμα φυσιολογικός ορός στις αντίστοιχες ημέρες. Το σωματικό βάρος των ζώων καταγραφόταν ανά τακτά διαστήματα. Στους υπό μελέτη ιστούς προσδιορίστηκαν, φθορισμομετρικά, τα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης και φωτομετρικά η ενεργότητα της καταλάσης, η σουπεροξειδική δισμουτάση και η ικανότητα αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος. Το σωματικό βάρος των ζώων όλων των ομάδων ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένα (Se: 13,21%, CrSeCr: 13.83%, SeCrCr: 10,69%) συγκριτικά με τους μάρτυρες. Όσον αφορά στη λιπιδική υπεροξείδωση, στα ζώα που έλαβαν το Na2SeO3 τα επίπεδα της MDA αυξήθηκαν (34,83%) στον φλοιό σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Στις ομάδες που χορηγήθηκε το εκχύλισμα του κρόκου η λιπιδική υπεροξείδωση ήταν σημαντικά ελαττωμένη (CrSeCr: 29,62%) σε σχέση με τους μάρτυρες στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκέφαλου. Στο ήπαρ η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου προκάλεσε στατιστικώς σημαντική μείωση της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε ποσοστό 47.78%, της ενεργότητας της καταλάσης και αύξηση της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος. Επιπλέον, με την χορήγηση του εκχυλίσματος του Crocus sativus παρατηρήθηκαν κάποιες μικρές αλλά σημαντικές αλλαγές, ιδιαίτερα στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας. Συγκεκριμένα, στην παρεγκεφαλίδα η χορήγηση του εκχυλίσματος του Crocus sativus προκάλεσε στατιστικώς σημαντική αύξηση της δραστικότητας της σουπεροξειδικής δισμουτάσης, της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος και μείωση της ενεργότητας της καταλάσης. Συμπερασματικά, η χορήγηση του Na2SeO3 στους αναπτυσσόμενους επίμυες επηρέασε αρνητικά την ανάπτυξή τους και επέδρασε στην οξειδοαναγωγική ισσοροπία με ιστοειδικό τρόπο θετικά στο ήπαρ και αρνητικά στον εγκεφαλικό φλοιό. Η χορήγηση κρόκου δεν άμβλυνε αυτές τις αλλαγές ενώ επηρέασε σημαντικά παραμέτρους στην παραγκεφαλίδα του εγκεφάλου. / Selenium (Se) is an important constituent of many antioxidant enzymes. In large quantities, however, it is highly toxic and carcinogenic. According to previous in vitro and in vivo studies in our laboratory, the extract from Crocus sativus (saffron) stigmas shows significant antioxidant cerebral protection of adult and aged rodents. In this study, our aim was to study the effect of administration of high concentrations of sodium selenite (Na2SeO3) and also of the co-administration of the saffron extract in individual brain regions (cortex, midbrain, cerebellum) in developing rats, an established model of cataractogenesis. The rats were divided into four groups (n = 6/group): "Se": 20 μmol Na2SeO3/kg (subcutaneous-10th day after birth), "CrSeCr": 60 mg dry saffron extract/kg (intraperitoneally - day 9)/20 μmol Na2SeO3/kg (subcutaneous - day 10)/60 mg extract/kg (intraperitoneally – day 12), "SeCrCr": 20μmol Na2SeO3/kg (subcutaneous - day 10)/60 mg saffron extract/kg (intraperitoneally on 11th and 12th day). Control animals received normal saline injections on the respective days. The animal body weight was recorded at regular intervals. Levels of lipid peroxidation (malondialdehyde, MDA) were determined fluorimetrically and the activity of catalase, superoxide dismutase and ferric-reducing antioxidant power spectometrically in tissue homogenates. The weight of animals in all treated groups was significantly lower (Se: 13.21%, CrSeCr: 13.83%, SeCrCr: 10.69%) than that of controls. MDA levels were significanly increased (34,83%) in the cortex of the animals that received Na2SeO3 compared to controls. In the groups treated with saffron extract, the lipid peroxidation was significantly reduced (CrSeCr: 29.62%) only in the cerebellum compared with controls. In the liver the administration of sodium selenite caused statistically significant reduction of lipid peroxidation in percentage of 47.78% with concomitant decrease of catalase activity. Moreover, the administration of the saffron extract caused some small but significant changes, especially in the cerebellum. Significant increase of superoxide dismutase activity, increase of the ferric-reducing antioxidant power and decrease of catalase activity. In conclusion, administration of Na2SeO3 to developing rats negatively affected their development and affected the redox equilibrium in a region-specific way, positively in liver and negatively in the cerebral cortex. The administration of the saffron extract did not affect these changes while it beneficially changed in the cerebellum of the brain.

Στόχος: Η νόσος του Alzheimer (ΝΑ) είναι η πιο κοινή μορφή άνοιας, η παθολογία της οποίας χαρακτηρίζεται εν μέρει από την εναπόθεση ινιδίων που σχηματίζονται από την αμυλοειδική πρωτεΐνη β (Αβ), τα οποία οδηγούν στην καταστροφή των χολινεργικών νευρώνων, πρωτίστως στον εγκεφαλικό φλοιό και τον ιππόκαμπο. Η εκτεταμένη αυτή απώλεια των νευρώνων είναι προοδευτική και έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή γνωστικών εγκεφαλικών λειτουργιών και τη δημιουργία σοβαρότατης, μη αναστρέψιμης άνοιας. Η Αβ-επαγόμενη τοξικότητα συνοδεύεται από ποικίλα γεγονότα, συμπεριλαμβανομένου του οξειδωτικού στρες (O.S) το οποίο χαρακτηρίζεται από αύξηση των επιπέδων των ενεργά αντιδρώντων ειδών οξυγόνου (ROS) όπως το Η2Ο2. Έρευνες αναφέρουν ότι οι τοξικοεπαγόμενες κυτταρικές βλάβες, συνεισφέρουν σημαντικά στην νευροτοξικότητα και την παθολογία της ΝΑ. Με τα πρόσφατα δεδομένα να υποδηλώνουν άμεση συσχέτιση της ΝΑ με την εναπόθεση της Αβ, το οξειδωτικό στρες και την απώλεια της χολινεργικής διαβίβασης, το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας έχει στραφεί, είτε στην ενίσχυση της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού, είτε στη ρύθμιση του μεταβολισμού της αμυλοειδικής προ-πρωτεΐνης ΑΡΡ προς το μη-αμυλοειδογενές μονοπάτι καθώς επίσης και προς την ενίσχυση των μνημονικών διεργασιών. Τα φυσικά προϊόντα αποτελούν πηγή χρήσιμων φαρμακευτικών σκευασμάτων (π.χ. η γαλανταμίνη είναι ένα από τα εγκεκριμένα φαρμακευτικά σκευάσματα για τη ΝΑ) τα συστατικά των οποίων αποτελούν έναυσμα για το σχεδιασμό αποτελεσματικότερων φαρμάκων, σε σχέση κυρίως με τις ανεπιθύμητες δράσεις. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον μεταξύ των φυτών για τον ελλαδικό χώρο έχει το φυτό Crocus sativus L., το οποίο καλλιεργείται στο χωριό Κρόκος της Κοζάνης για τους κόκκινους στύλους του, οι οποίοι χρησιμοποιούνται ευρύτατα στη διατροφή ως άρτυμα (κρόκος ή σαφρόν). Ο κρόκος, πέραν των ιδιοτήτων του ως καρύκευμα, αποτελεί ένα φυτικό σκεύασμα με σημαντικές ιατρικές ιδιότητες, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί κατά κόρον στην παραδοσιακή ιατρική. Οι στύλοι του κρόκου περιέχουν ασυνήθιστα υδρόφιλα καροτενοειδή, τις κροκίνες, οι οποίες είναι γλυκοζίτες της κροκετίνης. Σκοπός της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η μελέτη των νευροπροστατευτικών μηχανισμών των συστατικών των στύλων του φυτού Crocus sativus και άλλων ενδημικών ειδών Crocus με έμφαση στη νόσο του Alzheimer. To εκχύλισμα των στύλων του C. sativus (CSE) και τα συστατικά του, καθώς και άλλα ενδημικά είδη Crocus χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση: (α) των αντιοξειδωτικών τους ιδιοτήτων και της επίδρασης τους στη συσσωμάτωσης της Αβ, τόσο in vitro, όσο και σε κυτταρικές καλλιέργειες (SH-SY5Y, HEK293, CHOAPP770) και (β) των μνημονικών διεργασιών, της οξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου και της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) ενήλικων και γηραιών αρσενικών Balb-c μυών μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση CSE (7-ημερών) (30 & 60 mg/Kg βάρος σώματος) (n = 9/ομάδα). Μεθοδολογία: Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των στύλων προσδιορίστηκαν με εκτίμηση της ισοδύναμης με το Trolox ικανότητας να δεσμεύει ελεύθερες ρίζες (TEAC) και της ικανότητας αναγωγής του σιδήρου (FRAP), ενώ η επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων στη συσσωμάτωση ινιδίων της Αβ μελετήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-PAGE), τη μέθοδο της θειοφλαβίνης Τ και της δέσμευσης σε DNA. Η επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων στο μεταβολισμό της ΑΡΡ πραγματοποιήθηκε τόσο στα κυτταρικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα, όσο και στο θρεπτικό μέσο μετασχηματισμένων CHO κυττάρων (CHOAPP770), με ανάλυση κατά Western και με ανοσοκατακρήμνιση, ενώ οι επιπτώσεις του H2O2-επαγόμενου οξειδωτικού στρες, προσδιορίστηκαν με μέτρηση της κυτταρικής ζωτικότητας (ΜΤΤ assay), των επιπέδων ελευθέρων ριζών (DCF-DH2 assay) και της ενεργότητας της κασπάσης-3. Η αξιολόγηση της συμπεριφοράς των πειραματοζώων, πραγματοποιήθηκε με το τεστ παθητικής αποφυγής. Η μελέτη της αντιοξειδωτικής/αντι-αποπτωτικής δράσης των φυτικών εκχυλισμάτων σε ενήλικες και γηραιούς μύες πραγματοποιήθηκε σε ολικό εγκεφαλικό ομογενοποίημα και εκτιμήθηκε υπολογίζοντας την ικανότητα αναγωγής του σιδήρου (FRAP), των συγκεντρώσεων του ασκορβικού οξέος, της γλουταθειόνης, της μηλονικής διαλδεϋδης και της κασπάσης-3. Η μελέτη της πιθανής ανασταλτικής δράσης των εκχυλισμάτων στην ενεργότητα της AChE μελετήθηκε με τη μέθοδο του Ellman, ενώ ο τύπος αναστολής, προσδιορίστηκε με κινητικές μελέτες. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι, in vitro, τα εκχυλίσματα των στύλων των ειδών Crocus παρουσίασαν υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα από αυτή της τομάτας και του καρότου, καθώς και σημαντική δοσο- και χρονο-εξαρτώμενη ανασταλτική επίδραση στη δημιουργία ινιδίων της Αβ. Η trans-κροκίνη-4, ο διγεντιοβιοζυλ-εστέρας της κροκετίνης, το κύριο καροτενοειδές συστατικό του εκχυλίσματος των στύλων, προκάλεσε αναστολή της συσσωμάτωσης της Αβ ακόμη και σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις από αυτή της διμεθυλοκροκετίνης (ένα συνθετικό ανάλογο της κροκετίνης το οποίο δεν φέρει σάκχαρα στα άκρα του), υποδηλώνοντας έτσι ότι η δράση των καροτενοειδών ενισχύεται από την παρουσία των σακχάρων. Εν συγκρίσει με τον C. sativus, ο C. boryi και ο C. niveus παρουσίασαν πολύ πιο ισχυρή αντιαμυλοειδική δράση, γεγονός που πιθανότατα να οφείλεται στη διαφορετική σύσταση τους. Στις κυτταρικές καλλιέργειες, τα αποτελέσματα ελέγχου του μεταβολισμού της ΑΡΡ με ανοσοαποτύπωση κατά Western, έδειξαν ότι μόνον το ολικό εκχύλισμα των στύλων του C. sativus, καθώς και η σαφρανάλη, μια εκ των επιμέρους συστατικών του, αύξησε τα επίπεδα έκκρισης των αμυλοειδικών (sAPPβ) και μη-αμυλοειδικών (sAPPα) μορφών της ΑΡΡ, στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των CHOAPP770 κυττάρων. Η trans-κροκίνη-4 αύξησε τα επίπεδα έκκρισης των sAPPβ, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή των μονάδων σακχάρων στη διαδικασία της αμυλοειδογένεσης. Δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης της ολικής πρωτεΐνης (holoAPP), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση των sAPPα/β στο θρεπτικό μέσο μπορεί να οφείλεται στη μετατόπιση της ισορροπίας του μεταβολισμού της ΑΡΡ προς το μονοπάτι της α- ή της β-εκκριτάσης. Επιπροσθέτως, ανοσοκατακρήμνιση της Αβ έδειξε ότι παρουσία των φυτικών εκχυλισμάτων, καμία μεταβολή δεν παρατηρήθηκε ούτε και στην αμυλοειδογένεση, στο σχηματισμό δηλαδή συσσωμάτων της Αβ, μεγάλου μοριακού βάρους, παρά την τάση προς αύξηση του p3 υπολείμματος. Η αύξηση που παρατηρήθηκε στην παραγωγή των διμερών δομών της Αβ παρουσία των συστατικών του C. sativus, εν συγκρίσει με τα ολικά εκχυλίσματα των στύλων των ειδών Crocus, υποδηλώνει ότι τα καροτενοειδή εμπλέκονται κατά κάποιον τρόπο στην διαδικασία της αμυλοειδογένεσης, ενισχύοντας τη δημιουργία και σταθερότητα των διμερών. Επώαση των κυττάρων με H2O2 οδήγησε σε μείωση της κυτταρικής ζωτικότητας, η οποία συνοδεύτηκε και από αύξηση των επιπέδων των ROS και ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Τα ανωτέρω, αντιστράφηκαν πλήρως, ύστερα από επώαση των SH-SY5Y κυττάρων με εκχυλίσματα από τα τρία είδη Crocus, με τον C. sativus να είναι αποτελεσματικότερος όλων, ενώ εξίσου αποτελεσματικά ήταν και τα επιμέρους συστατικά του C. sativus, με το βαθμό αποτελεσματικότητας να διαμορφώνεται ως εξής: CRT≥Σαφρανάλης ακόμη και στις υψηλές συγκεντρώσεις Η2Ο2. Στην HEK293 κυτταρική σειρά, η συγχορήγηση της CRT και της σαφρανάλης με διαβαθμιζόμενες συγκεντρώσεις Η2Ο2, οδήγησε σε προστασία έναντι του Η2Ο2-επαγόμενου οξειδωτικού στρες και της παραγωγής ROS, εν αντιθέσει με το ολικό εκχύλισμα κρόκου, το οποίο δεν επέδειξε προστατευτική δράση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα επιμέρους συστατικά του C. sativus προστάτευσαν έναντι της κυτταροτοξικότητας του H2O2 σε όλα τα κυτταρικά συστήματα, μέσω μείωσης του οξειδωτικού φορτίου και της παραγωγής ROS. Αντιθέτως, επώαση των υπό μελέτη φυτοχημικών σε κυτταρικό σύστημα επιβαρυμένο με Αβ (μετασχηματισμένη CHO κυτταρική σειρά) προκάλεσε επιμέρους επιδείνωση της Η2Ο2-επαγόμενης τοξικότητας. Παρόλα αυτά, η χορήγηση κρόκου οδήγησε σε αύξηση των κυτταρικών επιπέδων της GSH, ενώ εξίσου σημαντική ήταν και η μείωση που παρατηρήθηκε στα επίπεδα της MDA, με το βαθμό αποτελεσματικότητας να διαμορφώνεται ως εξής: C. boryi=C. niveus=CRT≥Σαφρανάλης. Τα αποτελέσματα της χορήγησης CSE σε μύες έδειξαν στατιστικώς σημαντική βελτίωση στη μνήμη/μάθηση των ενηλίκων και γηραιών μυών. Παρατηρήθηκαν επίσης μειωμένα επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων και κασπάσης-3, αύξηση της συγκέντρωσης της ανηγμένης γλουταθειόνης και του ασκορβικού οξέος στον εγκέφαλο των μυών που τους χορηγήθηκε CSE. Επιπλέον, η δραστικότητα της διαλυτής σε άλας και σε απορρυπαντικό μορφής της AChE μειώθηκε στατιστικώς σημαντικά στους ενήλικες μύες μετά από χορήγηση CSE, σε αντίθεση με τους αντίστοιχους γηραιούς, όπου δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή. Επιπροσθέτως, in vitro ανάλυση της ενεργότητας της AChE, έδειξε ότι παρουσία των απομονωθέντων κροκινών και της σαφρανάλης, παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ενεργότητας του εν λόγω ενζύμου (μη-συναγωνιστική αναστολή) –όμοια με αυτή της γαλανταμίνης- εν αντιθέσει με το ολικό εκχύλισμα των στύλων των ειδών Crocus το οποίο δεν ήταν και τόσο δραστικό. Αυτός ο τύπος αναστολής υποδηλώνει ότι το σημείο πρόσδεσης τους βρίσκεται στο αλλοστερικό τμήμα του ενζύμου της AChE, το οποίο κατέχει, πιθανότατα, κύριο ρόλο και στη διέγερση της εναπόθεσης ινιδίων της Αβ. Συμπεράσματα: Η έλλειψη αποτελεσματικής θεραπείας έναντι της ΝΑ, κάνει τη χρήση φυτικών σκευασμάτων, πολλαπλών στόχων και με ισχυρές νευροπροστατευτικές ιδιότητες, να θεωρείται ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία, η οποία θα είναι αποτελεσματική έναντι των μηχανισμών που υπόκεινται των νευροεκφυλιστικών ασθενειών, π.χ. του οξειδωτικού στρες, της συσσωμάτωσης των πρωτεϊνών, των συμπεριφορικών και μνημονικών αλλαγών κ.ά. Τα αποτελέσματα μας συγκλίνουν προς αυτή την κατεύθυνση, καθότι υποδηλώνουν την πιθανή χρήση των συστατικών των στύλων του C. sativus στην αναστολή της αμυλοειδογένεσης και της εναπόθεσης της Αβ στον ανθρώπινο εγκέφαλο, ενώ καταδεικνύουν, για πρώτη φορά, ότι η ευεργετική για τη μνήμη δράση που παρατηρήθηκε ύστερα από χορήγηση κρόκου στους ενήλικους και γηραιούς μύες, συσχετίζεται πιθανότατα με την υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα του εγκεφάλου και εν μέρει, την αναστολή της ενεργότητας της AChE (για την περίπτωση των ενηλίκων μυών). Παρόλα αυτά όμως, καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα της AChE των γηραιών μυών, που είχαν λάβει εκχύλισμα κρόκου, παρά την ενίσχυση των αντιοξειδωτικών συστημάτων του οργανισμού, γεγονός που ενισχύει τη σπουδαιότητα της ενσωμάτωσης μιας υγιεινούς διατροφής για τη λειτουργία του εγκεφάλου, από την πρώιμη ενηλικίωση. Το γεγονός, όμως, ότι οι στύλοι του C. sativus αποτελούν μέρος της διατροφής μας ως άρτυμα (κρόκος, σαφράνι ή ζαφορά) μεγεθύνει την αξία αυτών των πειραματικών ευρημάτων αφού θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν άμεσα. Η ταυτοποίηση των κροκινών ως ένα από τα κύρια δραστικά φυτοχημικά θα μπορούσε να αξιοποιηθεί στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μέσων για τη νόσο του Alzheimer. Όμως, επιπρόσθετες μελέτες απαιτούνται προκειμένου να διερευνήσουμε την αποτελεσματικότητα αυτού του φυτικού εκχυλίσματος και των συστατικών του ως αντιαμυλοειδικά σκευάσματα. / Objective: Alzheimer’s disease (AD) is characterized pathologically by the deposition of amyloid-β (Aβ) peptide aggregates and neurofibrillary tangles, which lead to destruction of cholinergic neurons in the cerebral cortex and the hippocampus. That loss is progressive and results in profound memory disturbances and irreversible impairment of cognitive function. Aβ-induced toxicity is accompanied by a variegated combination of events, including oxidative stress (O.S) which is characterized by an increase in the levels of reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Research indicates that cellular insults resulting from free radicals may be a major contributor to the neurotoxicity and pathology of AD. With recent findings suggesting links between AD, deposition of Aβ, O.S. and loss of cholinergic transmission, much attention has been devoted currently, either to antioxidant research or regulation of the amyloid precursor protein (APP) metabolism towards the non-amyloidogenic pathway, as well as to memory enhancing agents. Natural products are still a source of useful drugs (i.e. galanthamine, one of the approved therapies of AD) and of lead compounds for the design of more effective compounds with less side-effects. Of particular interest among the plants that grow in Greece, acquires the plant Crocus sativus, which is cultivated in Kozani, Greece, for its red-coloured styles, which are used as a spice (saffron). Saffron has been used for medicinal purposes for millennia. Its styles are a source of unusual polar carotenoids (crocins), i.e. mono- and di-glycosides of crocetin. The aim of the present study was to examine the possible neuroprotective mechnisms of Crocus sativus’ and other endemic Crocus species’ styles constituents, in relation to AD. In the present study, the Crocus sativus styles extract (CSE) and its constituents and other endemic Crocus species have been used to evaluate: (a) the antioxidant properties and effect on Aβ-aggregation both in vitro and in various cell culture systems (SHSY5Y, HEK293, CHOAPP770) and (b) learning and memory, brain oxidative status and acetylcholinesterase activity (AChE) of adult and aged, male Balb-c mice, after CSE intraperitoneal (7-days) administration (30 & 60 mg/kg body weight) (n= 9/group). Methodology: The in vitro antioxidant properties of the tested phytochemicals were determined by measuring the ferric-reducing antioxidant power (FRAP) and Trolox-equivalent antioxidant capacity (TEAC), while its effects on Aß-aggregation and fibrillogenesis were studied by SDS-PAGE, thioflavine T (ThT)-based fluorescence assay and DNA-shift binding assay. The effects of plant extracts on the regulation of APP processing in stably transfected CHO cells (CHOAPP770) was examined by Immunoprecipitation (IP)/Western blot. Measurements of cell viability and scavenging of ROS production after co-treatment with Η2Ο2 and various concentrations of plant extracts were performed by 3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), 2',7'-dichlorofluorescein (DCF) assays and determination of caspase-3 activity. Evaluation of rodent learning and memory was done by a double trial, step-through test. Mice were sacrificed on day 7 and the effects on the oxidant status and AChE of whole brain homogenates was studied by determination of FRAP, ascorbic acid concentration (colorimetric), malondialdehyde and glutathione levels (fluorometric) and by the Ellman’s reagent. Caspase-3 activity (colorimetric) was also determined. Results: In our in vitro study, the water:methanol (50:50, v/v) extracts of Crocus species were shown to possess good antioxidant properties, higher than those of tomatoes and carrots and inhibit Aß fibrillogenesis in a concentration and time-dependent manner. The main carotenoid constituent, transcrocin- 4 (TC4), the di-gentibiosyl ester of crocetin, inhibited Aß fibrillogenesis at lower concentrations than dimethylcrocetin (DMCRT, a synthetic analogue of crocetin, lacking its sugar components), revealing that the action of the carotenoid is enhanced by the presence of the sugars. In the cell culture system, results showed that CSE and safranal treatment significantly enhanced both the release of amyloidogenic/and non-amyloidogenic soluble forms of sAPPα and sAPPβ into the conditioned media of CHOAPP770 cells. Τrans-crocin-4 resulted in an increase in sAPPβ, indicating the possible implication of sugan units in the process of amyloidogenesis. No difference was observed in full-length APP indicating that the increase of sAPPα/β in the media may be related to a shift in the balance of APP metabolism towards the α- or β-secretase pathway, rather than due to an increase in the expression levels of cellular APP. In addition, immunochemical labelling of Aβ revealed a trend towards p3 production in the cell culture media treated with the tested compounds. Plant extracts had no effect on production of higher molecular mass Aβ species. The increase in Aβ dimmers observed in the presence of C. sativus constituents, in contrast to the crude Crocus styles extracts, was ascribed to the implication of carotenoids in the amyloidogenic process, resulting in the formation and stability of dimmers. Hence, any attenuation of Aβ fibrillogenesis that may have been observed was not because of an overall inhibition of Aβ production. Treatment of cells with H2O2 caused the loss of cell viability, which was associated with the elevation of ROS level and the activation of caspase-3. These phenotypes induced by H2O2, were totally reversed by the tested phytochemicals in the SH-SY5Y cell line, with C. sativus being the most effective. Its carotenoid constituents were equally effective, with CRT≥safranal, even at higher H2O2 concentrations. In HEK293 cell line, co-treatment of the cells with varying concentrations of H2O2, along with CRT and safranal, resulted in reduced H2O2–induced cytotoxicity and ROS production, in contrast to the crude extract of C. sativus, which was less effective. Based on these observations, it seems that in both cell lines tested, the carotenoid constituents of C. sativus reduced the H2O2-induced oxidative damage, probably by reducing oxidative stress and ROS production. In contrast, only moderate effects were observed in stably transfected CHO cells, where co-treatment of the cells with H2O2 and the tested phytochemicals resulted in additional cytotoxicity. However, incubation of this cell line with C. sativus resulted in an increase in GSH levels, followed by a decrease in the MDA values, with C. boryi & C. niveus being equally effective and more effective than CRT and safranal. Results in mice, showed that only the CSE (60 mg/kg)-treated adult and aged mice exhibited a significant improvement in learning and memory. CSE administration resulted also in reduced lipid peroxidation products, in higher total brain antioxidant activity and reduced caspase-3 activity of both adult and aged mice. Furthermore, AChE activity was significantly decreased in CSE-treated adult mice; while no alterations were observed in CSE-treated aged mice. Interestingly, analysis of the in vitro potency of pure crocin constituents for AChE inhibition revealed a dose-dependent inhibitory profile, in the order of CRT≥Safranal>DMCRT, which mimicked that of galanthamine. This suggests that these compounds bind to different loci of the aromatic gorge of AChE, which might be at (or satisfactory close to) the subsites of the aromatic gorge, which seems to play an important role in accelerating Aβ plaque deposition. Conclusions: The lack of an effective treatment against AD, along with our inability to alter the genetic pool, makes the use of plant extracts with potent multi-targets and neuroprotective actions, as ideal candidates against the underlying mechanisms that characterize neurodegenerative diseases, like oxidative stress, protein misfolding, behavioral/cognitive alterations etc. Our finding also point towards such direction by indicating the possible use of C. sativus styles constituents for inhibition of aggregation and deposition of Aβ in the human brain. They also showed, for the first time, that the significant cognitive enhancement observed after CSE administration in adult & aged mice is closely related to higher brain antioxidant properties and inhibition of AChE (in the case of adult mice). However, no alterations were observed in the brain AChE levels of aged mice stressing the importance of healthy diet and early nutritional intervention on brain function from adulthood to senescence, as it may prove to be a valuable asset in “quenching the fires” of oxidative stress in aging and perhaps in neurodegenerative diseases. The fact though that saffron, as a spice, is part of our nutrition provides additional value to our experimental results, which could be of immediate use. The identification of crocins as one of the most effective contained phytochemicals could, in the long term, be used as new therapeutic means against AD. However, additional studies are required in order to dealinate further the effectiveness of the current plant extract as a potent “anti-amyloidogenic drug.