Η ακεραιότητα και η λειτουργία της μιτωτικής συσκευής διαδραματίζει ουσιώδη ρόλο για τον ορθό προσανατολισμό και την ολίσθηση των χρωμοσωμάτων στους πόλους της ατράκτου, οδηγώντας στον ισομερή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά τη μιτωτική ή μειωτική διαίρεση. Τροποποιήσεις του δικτύου των μικροσωληνίσκων (α- και β-τουμπουλίνη) και των κέντρων οργάνωσης αυτών (ΜΤΟC, γ-τουμπουλίνη) είναι δυνατόν να προκαλέσουν βλάβες στη μιτωτική συσκευή, διαταράσσοντας το χρωμοσωματικό αποχωρισμό, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ανευπλοειδικών κυττάρων. Η διουρητική φαρμακευτική ένωση υδροχλωροθειαζίδιο (HCTZ) χορηγείται κατά της υπέρτασης και είναι γνωστό ότι προκαλεί μη αποχωρισμό σε διπλοειδή στελέχη του μύκητα Aspergillus nidulans. Πρόσφατες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι επάγει αυξημένες συχνότητες μικροπυρήνων και διαταράσσει το χρωμοσωματικό αποχωρισμό σε καλλιέργειες ανθρωπίνων λεμφοκυττάρων in vitro. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση του HCTZ στην οργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων κατά τη μεσόφαση και τη μίτωση, με συνδυασμένη εφαρμογή μεθόδων διπλής ανοσοσήμανσης των πρωτεϊνών των μικροσωληνίσκων, του κεντροσώματος και του κινητοχώρου. Εφαρμόστηκε επίσης in situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα (FISH), με α-satellite πανκεντρομερικό ανιχνευτή, για τον εντοπισμό μη ενσωματωμένου (lagging) χρωμοσωματικού υλικού. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικές σειρές μυός C2C12 και ανθρώπου HFFF2. Παρατηρήθηκε ότι το HCTZ προκαλεί μείωση του ρυθμού διαίρεσης, αποδιοργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων και αυξημένη συχνότητα ανώμαλων μεταφάσεων με ποικίλο αριθμό σημάτων γ-τουμπουλίνης. Αυξάνει το ποσοστό των μεταφάσεων και μειώνει το ποσοστό των ανα-τελοφάσεων, προκαλώντας συσσώρευση των κυττάρων στο στάδιο της μετάφασης. Επίσης, επάγει τη χρωμοσωματική καθυστέρηση, καθώς αυξάνει τη συχνότητα των μικροπυρήνων που παρουσιάζουν τόσο σήμα κινητοχώρου όσο και σήμα κεντρομέρους. Η γενετική δράση του στα κύτταρα C2C12 δε φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά από τη χρονική διάρκεια έκθεσης των κυττάρων σ’ αυτό. Από τις δυο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν φαίνεται ότι τα κύτταρα C2C12 είναι περισσότερο ευαίσθητα στην απόκριση στο HCTZ. Τα αποτελέσματα μας, υποδεικνύουν ανευπλοειδογόνο δράση της φαρμακευτικής ένωσης, επιβεβαιώνοντας και ενισχύοντας προηγούμενα ευρήματα της ερευνητικής μας ομάδας. / The integrity and function of mitotic apparatus play essential role for the equitable orientation and the slipping of chromosomes to the spindle poles, indicating normal distribution of chromosomes during mitotic or meiotic division. Modifications of the microtubule network (α- and β- tubulin) and microtubule-organizing centers (MTOC, γ- tubulin) may cause severe damage to the mitotic apparatus, disturbing the segregation of chromosomes and resulting to aneuploid cells. The diuretic drug hydrochlorothiazide (HCTZ) is used for the treatment of hypertension and has been found to induce non-disjunction in diploid strains of Aspergillus nidulans. Recent studies of our team have shown that HCTZ produces increased frequencies of micronuclei and disturbs chromosome segregation in human lymphocytes cultures treated in vitro. In the present study was investigated the effect of HCTZ on the organization of the microtubule network during mesophase and mitosis, with combined application of double immunofluorescence staining assay, for the visualization of microtubules, centrosomes and kinetochore proteins. Fluorescence in situ hybridization (FISH), with α-satellite pancentromeric probe, was also applied, for the localization of not integrated (lagging) nuclear material. The study was realized in C2C12 mouse cells and HFFF2 human cells. Our results revealed that HCTZ causes decrease of the cell division rate, disorganization of the microtubule network and increased frequency of abnormal metaphases with various γ-tubulin signals. HCTZ increases the percentage of metaphases and decreases the percentage of ana-telophases, indicating a metaphase arrest. Also, induces chromosome delay, as was shown from the high frequency of micronuclei that presents kinetochore and centromere signal. The genetic activity of HCTZ in C2C12 cells does not appear to be significantly influenced by the duration of the cell’s exposure time to the drug. It appears that C2C12 mouse cells are more sensitive in their response to the HCTZ. These results indicate aneugenic activity of this drug, confirming and enhancing our previous findings.

Το γλοιοβλάστωμα αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους τύπους καρκίνου για τον άνθρωπο δεδομένου ότι ο μέσος όρος επιβίωσης είναι 12-15 μήνες. Η συμβατική θεραπεία με τα κλασσικά χημειοθεραπευτικά σχήματα δεν έχει αποδώσει ιδιαιτέρως θετικά αποτελέσματα. Η εξέλιξη της μοριακής βιολογίας έχει «ρίξει φως» στην διερεύνηση και κατανόηση αρκετών μηχανισμών της κυτταρικής λειτουργίας που αφορούν τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων. Στο γλοιοβλάστωμα έχει παρατηρηθεί αυξημένη δραστηριότητα πολλών υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην επιφάνεια των κυττάρων όπως ο EGFR, ο PDGFR και ο VEGFR. Ταυτόχρονα, υπάρχουν και άλλα μόρια επιφανείας με ιδιαίτερο ενδιαφέρον όπως οι ιντεγκρίνες λόγω της ιδιότητας τους να καθορίζουν τη μετανάστευση. Στη νέα εποχή των αναστολέων κινάσης τυροσίνης οι οποίοι δρουν έναντι των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων και θεωρούνται πολλά υποσχόμενα μικρά μόρια, πρέπει να διερευνηθεί αν μπορούν να έχουν θέση στην αντιμετώπιση του γλοιοβλαστώματος. Αρχικά έγινε εκτίμηση της επίδρασης των αναστολέων sunitinib και lapatinib ξεχωριστά αλλά και σε συνδυασμό, στο πολλαπλασιασμό και στο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων γλοιβλαστώματος U87 και M059K σε συγκεντρώσεις 0,01, 0,1, 1 και 10μΜ. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 διμεθυλθειαζόλο βρωμιδίου και το ολοκληρωμένο σύστημα ανίχνευσης αννεξίνης V/προπιδίου (annexin V/propidium iodide), αντίστοιχα. Για τη διαδικασία της μετανάστευσης εφαρμόστηκε η μέθοδος μελέτης του χημειοτακτισμού. Η έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών MM-2 και MMP-9 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο του ζυμογραφήματος. Περαιτέρω έγινε διερεύνηση της πιθανής εμπλοκής των φαρμάκων στο σχηματισμό συμπλόκων EGFR-υπομονάδα β1 ιντεγκρινών, PDGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών και VEGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών. Η μελέτη της δημιουργίας των συμπλόκων των β υπομονάδων των ιντεγκρινών με τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης και της ανάλυσης κατά Western. Τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν και με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Με την ίδια μέθοδο μελετήθηκε και η επίδραση των φαρμάκων στη φωσφορυλιωμένη μορφή της FAK. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι και οι δύο αναστολείς sunitinib και lapatinib, μείωσαν τον πολλαπλασιασμό με δοσοεξαρτώμενο τρόπο 48 ώρες μετά την προσθήκη τους στα κύτταρα είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Τα αποτελέσματα της αναστολής του πολλαπλασιασμού συμβάδιζαν με τα αποτελέσματα της απόπτωσης όπου το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε. Περαιτέρω η μετανάστευση των κυττάρων εμφανίστηκε μειωμένη μετά την προσθήκη των φαρμάκων είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Η έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών MMP-2 και MMP-9 δεν επηρεάστηκε στα κύτταρα U87 μετά την προσθήκη και των 2 φαρμάκων. Αντίθετα, στα κύτταρα M059K το sunitinib αλλά και ο συνδυασμός του με το lapatinib ελαττώσαν την έκφραση των MMPs 48 ώρες μετά τη προσθήκη τους στο θρεπτικό μέσο. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι το lapatinib μπορεί να αναστείλει την δημιουργία συμπλόκου του EGFR με την υπομονάδα β1 των ιντεγκρινών, έως και 30 λεπτά μετά την προσθήκη του φαρμάκου στα κύτταρα. Αντίστοιχα το sunitinib μπορεί να αναστέλλει το σχηματισμό συμπλόκου της υπομονάδας β3 των ιντεγκρινών με τον VEGFR εντός δύο ωρών από την προσθήκη των φαρμάκων, χωρίς επίδραση όμως στον σχηματισμό των συμπλόκων PDGFR – υπομονάδα β3 ιντεγκρίνης. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με την χρήση ανοσοφθορισμού. Συνοψίζοντας, οι δύο αναστολείς κινάσης τυροσίνης, sunitinib και lapatinib κατάφεραν να επιδείξουν αξιόλογα αποτελέσματα στις παραμέτρους του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Τα αποτελέσματα της έρευνας είναι πρωτοποριακά διότι, αναφορικά με την μετανάστευση στο γλοίωμα, αυτή φαίνεται να αναστέλλεται αποτελεσματικότερα με τον συνδυασμό των δύο φαρμάκων πιθανά μέσω του μηχανισμού διαταραχής της δημιουργίας του συμπλόκου ιντεγκρίνης- υποδοχέας αυξητικού παράγοντα. / Glioblastoma is considered to be one of the most fatal among the malignancies in human with median survival between 12-15 months. The conventional chemotherapy cannot change the fate of these patients. Recent advances in molecular biology have shed light in the various mechanisms recruited by malignant cells in order to proliferate, metastasize and escape apoptosis. Studies in glioblastoma have already shown up-regulation in the function of tyrosine kinase receptors such as EGFR, PDGFR and VEGFR. Besides this, in the more recent years, research supports the significant role of integrins in the migration process of glioblastoma cells. In the new era of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), where their main mechanism of action is by blocking various growth factor receptors, it has to be determined a possible contribution in the fight against glioblastoma. Initially, it was estimated a possible effect of sunitinib and lapatinib applied either alone or in combination, on U87 and M059K glioma cells’ proliferation and apoptosis using doses of 0,01 μM, 0,1 μM, 1μM and 10 μM. The proliferation was estimated using the 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 dimethyltetrazolium bromide assay and apoptosis using annexin V/propidium iodide detection assay. Migration assay was performed using Boyden chamber assay. The release of MMP-2 and MMP-9 into the culture medium of U87 and M059K cells was measured by zymography. Furthermore, a possible implication of the tested agents in the formation of EGFR-integrin β1 complex, VEGFR-integrin β3 and PDGFR-integrin β3 complexes formation was studied. Immunoprecipitation and western blot analysis were used for studying the complex formation of EGFR, PDGFR and VEGFR with integrins. Validation of the results was made using immunofluorescence assay. Also, similar experiments were performed for the effect of sunitinib and lapatinib in FAK phosphorylation. The results showed that both tested agents decreased cell proliferation in a dose-dependent manner 48 h after their application in both cell lines either alone or in combination. The results in cell proliferation were in line with the increase in apoptotic cells after their treatment with the tested agents. Furthermore, the ability of U87 and M059K cells to migrate was inhibited either by each agent alone or in combination. Both agents did not affect MMP-2 and MMP-9 levels in U87 cells, however, MMPs levels were decreased in M059K cells, 48h after their treatment with sunitinib either alone or in combination with lapatinib. Additionally, a time course study for the effect of lapatinib on EGFR-integrin β1 complex revealed an inhibition in complex formation up to 30 min after agent application. Likewise, sunitinib inhibited complex formation of VEGFR-integrin β3 complex within 2h after its application without affecting PDGFR-integrin β3 complex. The previously-described interruption of complexes formation was confirmed with an immunofluorescence assay. Summarizing the results, sunitinib and lapatinib exerted significant effects on glioblastoma cell proliferation, apoptosis and migration. The preliminary results of the current study are the first to support the implication of a dual anti-EGFR/HER-2 agent, lapatinib and a multi-targeted agent, sunitinib in glioma cells migration, through a mechanism implying interruption of growth factor receptor - integrin complexes formation.

Στόχος: Η νόσος του Alzheimer (ΝΑ) είναι η πιο κοινή μορφή άνοιας, η παθολογία της οποίας χαρακτηρίζεται εν μέρει από την εναπόθεση ινιδίων που σχηματίζονται από την αμυλοειδική πρωτεΐνη β (Αβ), τα οποία οδηγούν στην καταστροφή των χολινεργικών νευρώνων, πρωτίστως στον εγκεφαλικό φλοιό και τον ιππόκαμπο. Η εκτεταμένη αυτή απώλεια των νευρώνων είναι προοδευτική και έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή γνωστικών εγκεφαλικών λειτουργιών και τη δημιουργία σοβαρότατης, μη αναστρέψιμης άνοιας. Η Αβ-επαγόμενη τοξικότητα συνοδεύεται από ποικίλα γεγονότα, συμπεριλαμβανομένου του οξειδωτικού στρες (O.S) το οποίο χαρακτηρίζεται από αύξηση των επιπέδων των ενεργά αντιδρώντων ειδών οξυγόνου (ROS) όπως το Η2Ο2. Έρευνες αναφέρουν ότι οι τοξικοεπαγόμενες κυτταρικές βλάβες, συνεισφέρουν σημαντικά στην νευροτοξικότητα και την παθολογία της ΝΑ. Με τα πρόσφατα δεδομένα να υποδηλώνουν άμεση συσχέτιση της ΝΑ με την εναπόθεση της Αβ, το οξειδωτικό στρες και την απώλεια της χολινεργικής διαβίβασης, το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας έχει στραφεί, είτε στην ενίσχυση της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού, είτε στη ρύθμιση του μεταβολισμού της αμυλοειδικής προ-πρωτεΐνης ΑΡΡ προς το μη-αμυλοειδογενές μονοπάτι καθώς επίσης και προς την ενίσχυση των μνημονικών διεργασιών. Τα φυσικά προϊόντα αποτελούν πηγή χρήσιμων φαρμακευτικών σκευασμάτων (π.χ. η γαλανταμίνη είναι ένα από τα εγκεκριμένα φαρμακευτικά σκευάσματα για τη ΝΑ) τα συστατικά των οποίων αποτελούν έναυσμα για το σχεδιασμό αποτελεσματικότερων φαρμάκων, σε σχέση κυρίως με τις ανεπιθύμητες δράσεις. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον μεταξύ των φυτών για τον ελλαδικό χώρο έχει το φυτό Crocus sativus L., το οποίο καλλιεργείται στο χωριό Κρόκος της Κοζάνης για τους κόκκινους στύλους του, οι οποίοι χρησιμοποιούνται ευρύτατα στη διατροφή ως άρτυμα (κρόκος ή σαφρόν). Ο κρόκος, πέραν των ιδιοτήτων του ως καρύκευμα, αποτελεί ένα φυτικό σκεύασμα με σημαντικές ιατρικές ιδιότητες, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί κατά κόρον στην παραδοσιακή ιατρική. Οι στύλοι του κρόκου περιέχουν ασυνήθιστα υδρόφιλα καροτενοειδή, τις κροκίνες, οι οποίες είναι γλυκοζίτες της κροκετίνης. Σκοπός της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η μελέτη των νευροπροστατευτικών μηχανισμών των συστατικών των στύλων του φυτού Crocus sativus και άλλων ενδημικών ειδών Crocus με έμφαση στη νόσο του Alzheimer. To εκχύλισμα των στύλων του C. sativus (CSE) και τα συστατικά του, καθώς και άλλα ενδημικά είδη Crocus χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση: (α) των αντιοξειδωτικών τους ιδιοτήτων και της επίδρασης τους στη συσσωμάτωσης της Αβ, τόσο in vitro, όσο και σε κυτταρικές καλλιέργειες (SH-SY5Y, HEK293, CHOAPP770) και (β) των μνημονικών διεργασιών, της οξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου και της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) ενήλικων και γηραιών αρσενικών Balb-c μυών μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση CSE (7-ημερών) (30 & 60 mg/Kg βάρος σώματος) (n = 9/ομάδα). Μεθοδολογία: Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των στύλων προσδιορίστηκαν με εκτίμηση της ισοδύναμης με το Trolox ικανότητας να δεσμεύει ελεύθερες ρίζες (TEAC) και της ικανότητας αναγωγής του σιδήρου (FRAP), ενώ η επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων στη συσσωμάτωση ινιδίων της Αβ μελετήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-PAGE), τη μέθοδο της θειοφλαβίνης Τ και της δέσμευσης σε DNA. Η επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων στο μεταβολισμό της ΑΡΡ πραγματοποιήθηκε τόσο στα κυτταρικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα, όσο και στο θρεπτικό μέσο μετασχηματισμένων CHO κυττάρων (CHOAPP770), με ανάλυση κατά Western και με ανοσοκατακρήμνιση, ενώ οι επιπτώσεις του H2O2-επαγόμενου οξειδωτικού στρες, προσδιορίστηκαν με μέτρηση της κυτταρικής ζωτικότητας (ΜΤΤ assay), των επιπέδων ελευθέρων ριζών (DCF-DH2 assay) και της ενεργότητας της κασπάσης-3. Η αξιολόγηση της συμπεριφοράς των πειραματοζώων, πραγματοποιήθηκε με το τεστ παθητικής αποφυγής. Η μελέτη της αντιοξειδωτικής/αντι-αποπτωτικής δράσης των φυτικών εκχυλισμάτων σε ενήλικες και γηραιούς μύες πραγματοποιήθηκε σε ολικό εγκεφαλικό ομογενοποίημα και εκτιμήθηκε υπολογίζοντας την ικανότητα αναγωγής του σιδήρου (FRAP), των συγκεντρώσεων του ασκορβικού οξέος, της γλουταθειόνης, της μηλονικής διαλδεϋδης και της κασπάσης-3. Η μελέτη της πιθανής ανασταλτικής δράσης των εκχυλισμάτων στην ενεργότητα της AChE μελετήθηκε με τη μέθοδο του Ellman, ενώ ο τύπος αναστολής, προσδιορίστηκε με κινητικές μελέτες. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι, in vitro, τα εκχυλίσματα των στύλων των ειδών Crocus παρουσίασαν υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα από αυτή της τομάτας και του καρότου, καθώς και σημαντική δοσο- και χρονο-εξαρτώμενη ανασταλτική επίδραση στη δημιουργία ινιδίων της Αβ. Η trans-κροκίνη-4, ο διγεντιοβιοζυλ-εστέρας της κροκετίνης, το κύριο καροτενοειδές συστατικό του εκχυλίσματος των στύλων, προκάλεσε αναστολή της συσσωμάτωσης της Αβ ακόμη και σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις από αυτή της διμεθυλοκροκετίνης (ένα συνθετικό ανάλογο της κροκετίνης το οποίο δεν φέρει σάκχαρα στα άκρα του), υποδηλώνοντας έτσι ότι η δράση των καροτενοειδών ενισχύεται από την παρουσία των σακχάρων. Εν συγκρίσει με τον C. sativus, ο C. boryi και ο C. niveus παρουσίασαν πολύ πιο ισχυρή αντιαμυλοειδική δράση, γεγονός που πιθανότατα να οφείλεται στη διαφορετική σύσταση τους. Στις κυτταρικές καλλιέργειες, τα αποτελέσματα ελέγχου του μεταβολισμού της ΑΡΡ με ανοσοαποτύπωση κατά Western, έδειξαν ότι μόνον το ολικό εκχύλισμα των στύλων του C. sativus, καθώς και η σαφρανάλη, μια εκ των επιμέρους συστατικών του, αύξησε τα επίπεδα έκκρισης των αμυλοειδικών (sAPPβ) και μη-αμυλοειδικών (sAPPα) μορφών της ΑΡΡ, στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των CHOAPP770 κυττάρων. Η trans-κροκίνη-4 αύξησε τα επίπεδα έκκρισης των sAPPβ, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή των μονάδων σακχάρων στη διαδικασία της αμυλοειδογένεσης. Δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης της ολικής πρωτεΐνης (holoAPP), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση των sAPPα/β στο θρεπτικό μέσο μπορεί να οφείλεται στη μετατόπιση της ισορροπίας του μεταβολισμού της ΑΡΡ προς το μονοπάτι της α- ή της β-εκκριτάσης. Επιπροσθέτως, ανοσοκατακρήμνιση της Αβ έδειξε ότι παρουσία των φυτικών εκχυλισμάτων, καμία μεταβολή δεν παρατηρήθηκε ούτε και στην αμυλοειδογένεση, στο σχηματισμό δηλαδή συσσωμάτων της Αβ, μεγάλου μοριακού βάρους, παρά την τάση προς αύξηση του p3 υπολείμματος. Η αύξηση που παρατηρήθηκε στην παραγωγή των διμερών δομών της Αβ παρουσία των συστατικών του C. sativus, εν συγκρίσει με τα ολικά εκχυλίσματα των στύλων των ειδών Crocus, υποδηλώνει ότι τα καροτενοειδή εμπλέκονται κατά κάποιον τρόπο στην διαδικασία της αμυλοειδογένεσης, ενισχύοντας τη δημιουργία και σταθερότητα των διμερών. Επώαση των κυττάρων με H2O2 οδήγησε σε μείωση της κυτταρικής ζωτικότητας, η οποία συνοδεύτηκε και από αύξηση των επιπέδων των ROS και ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Τα ανωτέρω, αντιστράφηκαν πλήρως, ύστερα από επώαση των SH-SY5Y κυττάρων με εκχυλίσματα από τα τρία είδη Crocus, με τον C. sativus να είναι αποτελεσματικότερος όλων, ενώ εξίσου αποτελεσματικά ήταν και τα επιμέρους συστατικά του C. sativus, με το βαθμό αποτελεσματικότητας να διαμορφώνεται ως εξής: CRT≥Σαφρανάλης ακόμη και στις υψηλές συγκεντρώσεις Η2Ο2. Στην HEK293 κυτταρική σειρά, η συγχορήγηση της CRT και της σαφρανάλης με διαβαθμιζόμενες συγκεντρώσεις Η2Ο2, οδήγησε σε προστασία έναντι του Η2Ο2-επαγόμενου οξειδωτικού στρες και της παραγωγής ROS, εν αντιθέσει με το ολικό εκχύλισμα κρόκου, το οποίο δεν επέδειξε προστατευτική δράση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα επιμέρους συστατικά του C. sativus προστάτευσαν έναντι της κυτταροτοξικότητας του H2O2 σε όλα τα κυτταρικά συστήματα, μέσω μείωσης του οξειδωτικού φορτίου και της παραγωγής ROS. Αντιθέτως, επώαση των υπό μελέτη φυτοχημικών σε κυτταρικό σύστημα επιβαρυμένο με Αβ (μετασχηματισμένη CHO κυτταρική σειρά) προκάλεσε επιμέρους επιδείνωση της Η2Ο2-επαγόμενης τοξικότητας. Παρόλα αυτά, η χορήγηση κρόκου οδήγησε σε αύξηση των κυτταρικών επιπέδων της GSH, ενώ εξίσου σημαντική ήταν και η μείωση που παρατηρήθηκε στα επίπεδα της MDA, με το βαθμό αποτελεσματικότητας να διαμορφώνεται ως εξής: C. boryi=C. niveus=CRT≥Σαφρανάλης. Τα αποτελέσματα της χορήγησης CSE σε μύες έδειξαν στατιστικώς σημαντική βελτίωση στη μνήμη/μάθηση των ενηλίκων και γηραιών μυών. Παρατηρήθηκαν επίσης μειωμένα επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων και κασπάσης-3, αύξηση της συγκέντρωσης της ανηγμένης γλουταθειόνης και του ασκορβικού οξέος στον εγκέφαλο των μυών που τους χορηγήθηκε CSE. Επιπλέον, η δραστικότητα της διαλυτής σε άλας και σε απορρυπαντικό μορφής της AChE μειώθηκε στατιστικώς σημαντικά στους ενήλικες μύες μετά από χορήγηση CSE, σε αντίθεση με τους αντίστοιχους γηραιούς, όπου δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή. Επιπροσθέτως, in vitro ανάλυση της ενεργότητας της AChE, έδειξε ότι παρουσία των απομονωθέντων κροκινών και της σαφρανάλης, παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ενεργότητας του εν λόγω ενζύμου (μη-συναγωνιστική αναστολή) –όμοια με αυτή της γαλανταμίνης- εν αντιθέσει με το ολικό εκχύλισμα των στύλων των ειδών Crocus το οποίο δεν ήταν και τόσο δραστικό. Αυτός ο τύπος αναστολής υποδηλώνει ότι το σημείο πρόσδεσης τους βρίσκεται στο αλλοστερικό τμήμα του ενζύμου της AChE, το οποίο κατέχει, πιθανότατα, κύριο ρόλο και στη διέγερση της εναπόθεσης ινιδίων της Αβ. Συμπεράσματα: Η έλλειψη αποτελεσματικής θεραπείας έναντι της ΝΑ, κάνει τη χρήση φυτικών σκευασμάτων, πολλαπλών στόχων και με ισχυρές νευροπροστατευτικές ιδιότητες, να θεωρείται ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία, η οποία θα είναι αποτελεσματική έναντι των μηχανισμών που υπόκεινται των νευροεκφυλιστικών ασθενειών, π.χ. του οξειδωτικού στρες, της συσσωμάτωσης των πρωτεϊνών, των συμπεριφορικών και μνημονικών αλλαγών κ.ά. Τα αποτελέσματα μας συγκλίνουν προς αυτή την κατεύθυνση, καθότι υποδηλώνουν την πιθανή χρήση των συστατικών των στύλων του C. sativus στην αναστολή της αμυλοειδογένεσης και της εναπόθεσης της Αβ στον ανθρώπινο εγκέφαλο, ενώ καταδεικνύουν, για πρώτη φορά, ότι η ευεργετική για τη μνήμη δράση που παρατηρήθηκε ύστερα από χορήγηση κρόκου στους ενήλικους και γηραιούς μύες, συσχετίζεται πιθανότατα με την υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα του εγκεφάλου και εν μέρει, την αναστολή της ενεργότητας της AChE (για την περίπτωση των ενηλίκων μυών). Παρόλα αυτά όμως, καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα της AChE των γηραιών μυών, που είχαν λάβει εκχύλισμα κρόκου, παρά την ενίσχυση των αντιοξειδωτικών συστημάτων του οργανισμού, γεγονός που ενισχύει τη σπουδαιότητα της ενσωμάτωσης μιας υγιεινούς διατροφής για τη λειτουργία του εγκεφάλου, από την πρώιμη ενηλικίωση. Το γεγονός, όμως, ότι οι στύλοι του C. sativus αποτελούν μέρος της διατροφής μας ως άρτυμα (κρόκος, σαφράνι ή ζαφορά) μεγεθύνει την αξία αυτών των πειραματικών ευρημάτων αφού θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν άμεσα. Η ταυτοποίηση των κροκινών ως ένα από τα κύρια δραστικά φυτοχημικά θα μπορούσε να αξιοποιηθεί στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μέσων για τη νόσο του Alzheimer. Όμως, επιπρόσθετες μελέτες απαιτούνται προκειμένου να διερευνήσουμε την αποτελεσματικότητα αυτού του φυτικού εκχυλίσματος και των συστατικών του ως αντιαμυλοειδικά σκευάσματα. / Objective: Alzheimer’s disease (AD) is characterized pathologically by the deposition of amyloid-β (Aβ) peptide aggregates and neurofibrillary tangles, which lead to destruction of cholinergic neurons in the cerebral cortex and the hippocampus. That loss is progressive and results in profound memory disturbances and irreversible impairment of cognitive function. Aβ-induced toxicity is accompanied by a variegated combination of events, including oxidative stress (O.S) which is characterized by an increase in the levels of reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Research indicates that cellular insults resulting from free radicals may be a major contributor to the neurotoxicity and pathology of AD. With recent findings suggesting links between AD, deposition of Aβ, O.S. and loss of cholinergic transmission, much attention has been devoted currently, either to antioxidant research or regulation of the amyloid precursor protein (APP) metabolism towards the non-amyloidogenic pathway, as well as to memory enhancing agents. Natural products are still a source of useful drugs (i.e. galanthamine, one of the approved therapies of AD) and of lead compounds for the design of more effective compounds with less side-effects. Of particular interest among the plants that grow in Greece, acquires the plant Crocus sativus, which is cultivated in Kozani, Greece, for its red-coloured styles, which are used as a spice (saffron). Saffron has been used for medicinal purposes for millennia. Its styles are a source of unusual polar carotenoids (crocins), i.e. mono- and di-glycosides of crocetin. The aim of the present study was to examine the possible neuroprotective mechnisms of Crocus sativus’ and other endemic Crocus species’ styles constituents, in relation to AD. In the present study, the Crocus sativus styles extract (CSE) and its constituents and other endemic Crocus species have been used to evaluate: (a) the antioxidant properties and effect on Aβ-aggregation both in vitro and in various cell culture systems (SHSY5Y, HEK293, CHOAPP770) and (b) learning and memory, brain oxidative status and acetylcholinesterase activity (AChE) of adult and aged, male Balb-c mice, after CSE intraperitoneal (7-days) administration (30 & 60 mg/kg body weight) (n= 9/group). Methodology: The in vitro antioxidant properties of the tested phytochemicals were determined by measuring the ferric-reducing antioxidant power (FRAP) and Trolox-equivalent antioxidant capacity (TEAC), while its effects on Aß-aggregation and fibrillogenesis were studied by SDS-PAGE, thioflavine T (ThT)-based fluorescence assay and DNA-shift binding assay. The effects of plant extracts on the regulation of APP processing in stably transfected CHO cells (CHOAPP770) was examined by Immunoprecipitation (IP)/Western blot. Measurements of cell viability and scavenging of ROS production after co-treatment with Η2Ο2 and various concentrations of plant extracts were performed by 3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), 2',7'-dichlorofluorescein (DCF) assays and determination of caspase-3 activity. Evaluation of rodent learning and memory was done by a double trial, step-through test. Mice were sacrificed on day 7 and the effects on the oxidant status and AChE of whole brain homogenates was studied by determination of FRAP, ascorbic acid concentration (colorimetric), malondialdehyde and glutathione levels (fluorometric) and by the Ellman’s reagent. Caspase-3 activity (colorimetric) was also determined. Results: In our in vitro study, the water:methanol (50:50, v/v) extracts of Crocus species were shown to possess good antioxidant properties, higher than those of tomatoes and carrots and inhibit Aß fibrillogenesis in a concentration and time-dependent manner. The main carotenoid constituent, transcrocin- 4 (TC4), the di-gentibiosyl ester of crocetin, inhibited Aß fibrillogenesis at lower concentrations than dimethylcrocetin (DMCRT, a synthetic analogue of crocetin, lacking its sugar components), revealing that the action of the carotenoid is enhanced by the presence of the sugars. In the cell culture system, results showed that CSE and safranal treatment significantly enhanced both the release of amyloidogenic/and non-amyloidogenic soluble forms of sAPPα and sAPPβ into the conditioned media of CHOAPP770 cells. Τrans-crocin-4 resulted in an increase in sAPPβ, indicating the possible implication of sugan units in the process of amyloidogenesis. No difference was observed in full-length APP indicating that the increase of sAPPα/β in the media may be related to a shift in the balance of APP metabolism towards the α- or β-secretase pathway, rather than due to an increase in the expression levels of cellular APP. In addition, immunochemical labelling of Aβ revealed a trend towards p3 production in the cell culture media treated with the tested compounds. Plant extracts had no effect on production of higher molecular mass Aβ species. The increase in Aβ dimmers observed in the presence of C. sativus constituents, in contrast to the crude Crocus styles extracts, was ascribed to the implication of carotenoids in the amyloidogenic process, resulting in the formation and stability of dimmers. Hence, any attenuation of Aβ fibrillogenesis that may have been observed was not because of an overall inhibition of Aβ production. Treatment of cells with H2O2 caused the loss of cell viability, which was associated with the elevation of ROS level and the activation of caspase-3. These phenotypes induced by H2O2, were totally reversed by the tested phytochemicals in the SH-SY5Y cell line, with C. sativus being the most effective. Its carotenoid constituents were equally effective, with CRT≥safranal, even at higher H2O2 concentrations. In HEK293 cell line, co-treatment of the cells with varying concentrations of H2O2, along with CRT and safranal, resulted in reduced H2O2–induced cytotoxicity and ROS production, in contrast to the crude extract of C. sativus, which was less effective. Based on these observations, it seems that in both cell lines tested, the carotenoid constituents of C. sativus reduced the H2O2-induced oxidative damage, probably by reducing oxidative stress and ROS production. In contrast, only moderate effects were observed in stably transfected CHO cells, where co-treatment of the cells with H2O2 and the tested phytochemicals resulted in additional cytotoxicity. However, incubation of this cell line with C. sativus resulted in an increase in GSH levels, followed by a decrease in the MDA values, with C. boryi & C. niveus being equally effective and more effective than CRT and safranal. Results in mice, showed that only the CSE (60 mg/kg)-treated adult and aged mice exhibited a significant improvement in learning and memory. CSE administration resulted also in reduced lipid peroxidation products, in higher total brain antioxidant activity and reduced caspase-3 activity of both adult and aged mice. Furthermore, AChE activity was significantly decreased in CSE-treated adult mice; while no alterations were observed in CSE-treated aged mice. Interestingly, analysis of the in vitro potency of pure crocin constituents for AChE inhibition revealed a dose-dependent inhibitory profile, in the order of CRT≥Safranal>DMCRT, which mimicked that of galanthamine. This suggests that these compounds bind to different loci of the aromatic gorge of AChE, which might be at (or satisfactory close to) the subsites of the aromatic gorge, which seems to play an important role in accelerating Aβ plaque deposition. Conclusions: The lack of an effective treatment against AD, along with our inability to alter the genetic pool, makes the use of plant extracts with potent multi-targets and neuroprotective actions, as ideal candidates against the underlying mechanisms that characterize neurodegenerative diseases, like oxidative stress, protein misfolding, behavioral/cognitive alterations etc. Our finding also point towards such direction by indicating the possible use of C. sativus styles constituents for inhibition of aggregation and deposition of Aβ in the human brain. They also showed, for the first time, that the significant cognitive enhancement observed after CSE administration in adult & aged mice is closely related to higher brain antioxidant properties and inhibition of AChE (in the case of adult mice). However, no alterations were observed in the brain AChE levels of aged mice stressing the importance of healthy diet and early nutritional intervention on brain function from adulthood to senescence, as it may prove to be a valuable asset in “quenching the fires” of oxidative stress in aging and perhaps in neurodegenerative diseases. The fact though that saffron, as a spice, is part of our nutrition provides additional value to our experimental results, which could be of immediate use. The identification of crocins as one of the most effective contained phytochemicals could, in the long term, be used as new therapeutic means against AD. However, additional studies are required in order to dealinate further the effectiveness of the current plant extract as a potent “anti-amyloidogenic drug.