Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Τα κακοήθη γλοιώματα συνιστούν τον πιο κοινό τύπο καρκίνου του κεντρικού νευρικού συστήματος στους ενήλικες και χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό αγγειογένεσης και διήθησης στον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αν και οι θεραπευτικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, ποσοστό μεγαλύτερο του 90% των ασθενών εμφανίζουν υποτροπή της νόσου και η συνολική επιβίωση είναι εξαιρετικά χαμηλή. Τα παραπάνω γεγονότα εντείνουν την ανάγκη για την εφαρμογή πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών σχημάτων, καθώς και την ανακάλυψη νέων μορίων-στόχων για τη θεραπεία του συγκεκριμένου τύπου καρκίνου. Η HARP είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας με μοριακό βάρος 18 kDa που έχει ισχυρή συγγένεια με την ηπαρίνη. Η HARP εκφράζεται κυρίως κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και απομονώθηκε για πρώτη φορά ως πρωτεΐνη που προάγει την επέκταση των νευριτών στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο. Στην HARP έχει αποδοθεί ένας σημαντικός αριθμός βιολογικών δράσεων, όπως η συμμετοχή της στον πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στη διαφοροποίηση των κυττάρων, στο σχηματισμό οστών, στη χονδρογένεση, στη σπερματογένεση, στην ογκογένεση και στην αγγειογένεση. Η HARP εκφράζεται σε διάφορες καρκινικές σειρές από μηνιγγίωμα, νευροβλάστωμα, αστροκυττάρωμα, μελάνωμα, μικροκυτταρικό τύπο καρκίνου του πνεύμονα και γλοιοβλάστωμα. Κλινικές μελέτες έχουν αναφέρει αυξημένα επίπεδα της HARP στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο του κόλον του εντέρου, με καρκίνο του παγκρέατος και με καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε το ρόλο της HARP στην ανάπτυξη όγκου και στην αγγειογένεση που προκαλούν τα κύτταρα C6, μετασχηματίζοντας τα κύτταρα αυτά με την αντινοηματική αλληλουχία για το cDNA της HARP και καταστέλλοντας την έκφρασή της στα κύτταρα C6. Μείωση της ενδογενούς έκφρασης της πρωτεΐνης της HARP στα κύτταρα C6 (κύτταρα AS-C6) προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό, στην ανάπτυξη των κυττάρων σε τρισδιάστατο περιβάλλον και στη μετανάστευση. Όταν κύτταρα AS-C6 εμβολιάστηκαν σε χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας, οδήγησαν σε σημαντική αύξηση της καρκινικής αγγειογένεσης, σε σύγκριση με τις μεμβράνες που είχαν εμβολιαστεί με μη μετασχηματισμένα κύτταρα C6 ή με κύτταρα C6 που είχαν μετασχηματιστεί μόνο με το πλασμίδιο-φορέα (κύτταρα ΡC-C6). Με παρόμοιο τρόπο, θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων AS-C6 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στο σχηματισμό ψευδαγγείων των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro σε σύγκριση με την επίδραση του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας των κυττάρων C6 και ΡC-C6. Η έκφραση της HARP φαίνεται να είναι απαραίτητη για την ανασταλτική δράση αυξημένων ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων C6 και αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης και έκκρισης HARP, πιθανά μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1. Τέλος, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης του αυξητικού παράγοντα των ενδοθηλιακών κυττάρων (vascular endothelial growth factor, VEGF) σε καλλιέργειες των κυττάρων AS-C6 σε σχέση με τα κύτταρα C6 και PC-C6. H HARP βρέθηκε να συν-ανοσοκατακρημνίζεται με τον VEGF σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων C6 και pC-C6, το οποίο υποδηλώνει μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών αυξητικών παραγόντων. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προτείνουν ότι ο αυξητικός παράγοντας HARP έχει αρνητικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξη όγκου και της αγγειογένεση που επάγουν τα κύτταρα C6, πιθανά ρυθμίζοντας την έκφραση ή/και τη διαθεσιμότητα άλλων αυξητικών παραγόντων. / Malignant gliomas, the most common type of brain tumors in adults, present a remarkable degree of neovascularisation and invasiveness into surrounding tissues. Although combinations of surgery, radiotherapy and chemotherapy are used, more than 90% of the patients experience local recurrence and their survival is extremely low. These facts stress the need for more effective therapeutic strategies and new targets for tumour therapy. Heparin affin regulatory peptide (HARP), also known as pleiotrophin or heparin-binding growth-associated molecule, is an 18-kDa secreted growth factor that has high affinity for heparin. HARP is mainly expressed during embryonic development, in early postnatal rat and bovine brain and was first isolated as a major neurite outgrowth-promoting protein of developing brain. Since then, a number of biological activities have been well established for HARP, such as its role in cellular proliferation, migration and differentiation and its involvement in bone formation, chondrogenesis, spermatogenesis, tumor growth and angiogenesis. HARP is expressed in various cancer cell lines, derived from meningiomas, neuroblastomas, astrocytomas, melanomas, small cell lung cancer (SCLC) cell lines and glioblastomas. Clinical studies have shown elevated serum levels and tumor expression of HARP in patients with colon, stomach, pancreatic and breast cancer. Ιn the present study, we tried to elucidate the role of HARP in the growth and angiogenicity of C6 glioma cells by using an antisense strategy for inhibition of HARP expression in rat C6 glioma cells. Decrease of the expression of endogenous HARP protein in C6 cells (AS-C6 cells) significantly increased proliferation rate and anchorage-independent growth of cells. Implantation of AS-C6 cells onto chicken embryo chorioallantoic membranes resulted in a significant increase of tumor-induced angiogenesis, compared with those induced by non transfected or C6 cells transfected with the plasmid alone (PC-C6 cells). In the same line, conditioned medium from AS-C6 cells significantly increased endothelial cell proliferation, migration and tube formation in vitro compared with the effect of C6 or PC-C6 cells. HARP expression is required for cAMP-induced inhibition of C6 cell proliferation and migration and cAMP increased the expression and secretion of HARP by C6 cells, possibly through activation of Activator Protein 1. Finally, a significant increase in vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA and protein levels were observed in cultures of AS-C6 cells compared with C6 or PC-C6 cells. HARP was co-immunoprecipitated with VEGF from the conditioned medium of C6 and PC-C6 cells, which indicates a direct interaction between the two factors. Collectively, these data suggest that HARP negatively regulates tumor growth and angiogenesis induced by C6, possibly through regulation of the expression or/and activation of other growth factors.

Τα γλοιώματα είναι η πιο συχνή κακοήθης μορφή καρκίνου του κεντρικού νευρικού συστήματος. Δυστυχώς, είναι επίσης μεταξύ των πιο δύσκολων μορφών όσο αναφορά τη θεραπεία, με αποτέλεσμα την κακή πρόγνωση των ασθενών. Γλοιώματα παρουσιάζουν πολύπλοκη κυτταρική και γενετική ετερογένεια, περιορίζοντας σημαντικά τις στοχευμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η ανακάλυψη γονιδίων και σηματοδοτικών μονοπατιών που ρυθμίζουν την επιβίωση και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων θα βοηθήσουν στην ανάπτυξη νέων και πιο αποτελεσματικών θεραπειών. Η πρωτεΐνη απόκρισης στο κυκλικό-AMP (CREB) είναι ένα πυρηνικό μόριο που ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης από κινάσες σερίνης/θρεονίνης και ελέγχει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων στα νευρικά κύτταρα. Ο ρόλος του CREB στη νευρωνική λειτουργία κυμαίνεται από την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό σε πιο πολύπλοκες εγκεφαλικές λειτουργίες, όπως η μνήμη και οι συμπεριφορές εθισμού. Δεδομένα από πρόσφατες έρευνες δείχνουν πως ανώμαλη έκφραση ή ενεργοποίηση του CREB μπορεί να προσδώσει καρκινικές ιδιότητες σε διάφορους τύπους ιστών και κυττάρων. Επίσης το CREB συμμετέχει σε διαδικασίες επιβίωσης και μετάστασης σε μεγάλο αριθμό καρκινικών κυτταρικών σειρών. Με βάση αυτά μελετήθηκε ο ρόλος του CREB σε κύτταρα καρκίνου του εγκεφάλου, με έμφαση στις περιπτώσεις γλοιοβλαστώματος. Δείξαμε ότι τόσο τα επίπεδα ενεργοποίησης όσο και ο αριθμός των κυττάρων που στα οποία το CREB είναι φωσφορυλιωμένο/ ενεργοποιημένο είναι σημαντικά αυξημένος σε σχέση με δείγματα παρακείμενου μη καρκινικού ιστού. Επιπλέων βρέθηκε πως η αποσιώπηση του CREB σε καρκινικές σειρές γλοιοβλαστώματος, με χρήση μορίων siRNA, επέφερε σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα τους. Τα παραπάνω ευρήματα συσχετίζουν για πρώτη φορά το μεταγραφικό παράγοντα CREB με το γλοιοβλάστωμα και του προσδίδουν ένα αρκετά σημαντικό ρόλο όσο αναφορά την επιβίωση των συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων. / Gliomas are the most common malignant cancers of the nervous system. Unfortunately, they are also amongst the most difficult cancers to treat, resulting in poor patient prognosis. Gliomas exhibit complex cellular and genetic heterogeneity, limiting effective targeted therapy approaches. Discovering the genes and pathways that regulate cancer cells survival and growth will aid in the development of novel and more effective treatments. The Cyclic-AMP Response Element Binding protein (CREB) is a serine/threonine kinase-regulated nuclear factor modulating the transcription of numerous genes in nerve cells and has various roles in neuronal function, ranging from survival and proliferation to more complex brain functions, such as memory and drug addiction behaviours. Given recent findings that aberrant CREB expression can impart oncogenic properties on myeloid cells, liver cells and ovarian epithelial cells, we explored the potential role of CREB in brain cancer biology by examining its expression in a panel of human patient brain tumour specimens. We show that both the level of expression and the number of cells expressing activated/phosphorylated CREB is markedly elevated in tumours compared with adjacent non-tumour control brain tissue. Moreover using siRNA molecules we knocked-down the expression of CREB in glioblastoma cell lines and then we studied the viability of these cells throughout 96 hours with the use of MTT assay. A significant reduction in viability was observed at CREB siRNA transfected cells against the control. These observations are the first to highlight a link between CREB and brain tumours. Our hypothesis is that CREB has a role in brain tumour development/growth and that at least some of CREB's neuro-oncogenic properties are due to its role in neural cells survival and proliferation.

Το γλοιοβλάστωμα αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους τύπους καρκίνου για τον άνθρωπο δεδομένου ότι ο μέσος όρος επιβίωσης είναι 12-15 μήνες. Η συμβατική θεραπεία με τα κλασσικά χημειοθεραπευτικά σχήματα δεν έχει αποδώσει ιδιαιτέρως θετικά αποτελέσματα. Η εξέλιξη της μοριακής βιολογίας έχει «ρίξει φως» στην διερεύνηση και κατανόηση αρκετών μηχανισμών της κυτταρικής λειτουργίας που αφορούν τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων. Στο γλοιοβλάστωμα έχει παρατηρηθεί αυξημένη δραστηριότητα πολλών υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην επιφάνεια των κυττάρων όπως ο EGFR, ο PDGFR και ο VEGFR. Ταυτόχρονα, υπάρχουν και άλλα μόρια επιφανείας με ιδιαίτερο ενδιαφέρον όπως οι ιντεγκρίνες λόγω της ιδιότητας τους να καθορίζουν τη μετανάστευση. Στη νέα εποχή των αναστολέων κινάσης τυροσίνης οι οποίοι δρουν έναντι των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων και θεωρούνται πολλά υποσχόμενα μικρά μόρια, πρέπει να διερευνηθεί αν μπορούν να έχουν θέση στην αντιμετώπιση του γλοιοβλαστώματος. Αρχικά έγινε εκτίμηση της επίδρασης των αναστολέων sunitinib και lapatinib ξεχωριστά αλλά και σε συνδυασμό, στο πολλαπλασιασμό και στο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων γλοιβλαστώματος U87 και M059K σε συγκεντρώσεις 0,01, 0,1, 1 και 10μΜ. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 διμεθυλθειαζόλο βρωμιδίου και το ολοκληρωμένο σύστημα ανίχνευσης αννεξίνης V/προπιδίου (annexin V/propidium iodide), αντίστοιχα. Για τη διαδικασία της μετανάστευσης εφαρμόστηκε η μέθοδος μελέτης του χημειοτακτισμού. Η έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών MM-2 και MMP-9 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο του ζυμογραφήματος. Περαιτέρω έγινε διερεύνηση της πιθανής εμπλοκής των φαρμάκων στο σχηματισμό συμπλόκων EGFR-υπομονάδα β1 ιντεγκρινών, PDGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών και VEGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών. Η μελέτη της δημιουργίας των συμπλόκων των β υπομονάδων των ιντεγκρινών με τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης και της ανάλυσης κατά Western. Τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν και με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Με την ίδια μέθοδο μελετήθηκε και η επίδραση των φαρμάκων στη φωσφορυλιωμένη μορφή της FAK. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι και οι δύο αναστολείς sunitinib και lapatinib, μείωσαν τον πολλαπλασιασμό με δοσοεξαρτώμενο τρόπο 48 ώρες μετά την προσθήκη τους στα κύτταρα είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Τα αποτελέσματα της αναστολής του πολλαπλασιασμού συμβάδιζαν με τα αποτελέσματα της απόπτωσης όπου το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε. Περαιτέρω η μετανάστευση των κυττάρων εμφανίστηκε μειωμένη μετά την προσθήκη των φαρμάκων είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Η έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών MMP-2 και MMP-9 δεν επηρεάστηκε στα κύτταρα U87 μετά την προσθήκη και των 2 φαρμάκων. Αντίθετα, στα κύτταρα M059K το sunitinib αλλά και ο συνδυασμός του με το lapatinib ελαττώσαν την έκφραση των MMPs 48 ώρες μετά τη προσθήκη τους στο θρεπτικό μέσο. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι το lapatinib μπορεί να αναστείλει την δημιουργία συμπλόκου του EGFR με την υπομονάδα β1 των ιντεγκρινών, έως και 30 λεπτά μετά την προσθήκη του φαρμάκου στα κύτταρα. Αντίστοιχα το sunitinib μπορεί να αναστέλλει το σχηματισμό συμπλόκου της υπομονάδας β3 των ιντεγκρινών με τον VEGFR εντός δύο ωρών από την προσθήκη των φαρμάκων, χωρίς επίδραση όμως στον σχηματισμό των συμπλόκων PDGFR – υπομονάδα β3 ιντεγκρίνης. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με την χρήση ανοσοφθορισμού. Συνοψίζοντας, οι δύο αναστολείς κινάσης τυροσίνης, sunitinib και lapatinib κατάφεραν να επιδείξουν αξιόλογα αποτελέσματα στις παραμέτρους του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Τα αποτελέσματα της έρευνας είναι πρωτοποριακά διότι, αναφορικά με την μετανάστευση στο γλοίωμα, αυτή φαίνεται να αναστέλλεται αποτελεσματικότερα με τον συνδυασμό των δύο φαρμάκων πιθανά μέσω του μηχανισμού διαταραχής της δημιουργίας του συμπλόκου ιντεγκρίνης- υποδοχέας αυξητικού παράγοντα. / Glioblastoma is considered to be one of the most fatal among the malignancies in human with median survival between 12-15 months. The conventional chemotherapy cannot change the fate of these patients. Recent advances in molecular biology have shed light in the various mechanisms recruited by malignant cells in order to proliferate, metastasize and escape apoptosis. Studies in glioblastoma have already shown up-regulation in the function of tyrosine kinase receptors such as EGFR, PDGFR and VEGFR. Besides this, in the more recent years, research supports the significant role of integrins in the migration process of glioblastoma cells. In the new era of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), where their main mechanism of action is by blocking various growth factor receptors, it has to be determined a possible contribution in the fight against glioblastoma. Initially, it was estimated a possible effect of sunitinib and lapatinib applied either alone or in combination, on U87 and M059K glioma cells’ proliferation and apoptosis using doses of 0,01 μM, 0,1 μM, 1μM and 10 μM. The proliferation was estimated using the 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 dimethyltetrazolium bromide assay and apoptosis using annexin V/propidium iodide detection assay. Migration assay was performed using Boyden chamber assay. The release of MMP-2 and MMP-9 into the culture medium of U87 and M059K cells was measured by zymography. Furthermore, a possible implication of the tested agents in the formation of EGFR-integrin β1 complex, VEGFR-integrin β3 and PDGFR-integrin β3 complexes formation was studied. Immunoprecipitation and western blot analysis were used for studying the complex formation of EGFR, PDGFR and VEGFR with integrins. Validation of the results was made using immunofluorescence assay. Also, similar experiments were performed for the effect of sunitinib and lapatinib in FAK phosphorylation. The results showed that both tested agents decreased cell proliferation in a dose-dependent manner 48 h after their application in both cell lines either alone or in combination. The results in cell proliferation were in line with the increase in apoptotic cells after their treatment with the tested agents. Furthermore, the ability of U87 and M059K cells to migrate was inhibited either by each agent alone or in combination. Both agents did not affect MMP-2 and MMP-9 levels in U87 cells, however, MMPs levels were decreased in M059K cells, 48h after their treatment with sunitinib either alone or in combination with lapatinib. Additionally, a time course study for the effect of lapatinib on EGFR-integrin β1 complex revealed an inhibition in complex formation up to 30 min after agent application. Likewise, sunitinib inhibited complex formation of VEGFR-integrin β3 complex within 2h after its application without affecting PDGFR-integrin β3 complex. The previously-described interruption of complexes formation was confirmed with an immunofluorescence assay. Summarizing the results, sunitinib and lapatinib exerted significant effects on glioblastoma cell proliferation, apoptosis and migration. The preliminary results of the current study are the first to support the implication of a dual anti-EGFR/HER-2 agent, lapatinib and a multi-targeted agent, sunitinib in glioma cells migration, through a mechanism implying interruption of growth factor receptor - integrin complexes formation.