acase@tulane.edu / Women are at greater risk to develop the incurable psychiatric diseases posttraumatic stress disorder (PTSD) and major depressive disorder (MDD). In spite of the elevated risk associated with female biological sex, the vast majority of preclinical studies have exclusively used male rodents. Therefore, the neurobiology which underlies the increased susceptibility to stress-related mental illness associated with female sex is largely unknown. Currently, it is thought that regulation of the transcription factor cyclic-AMP response element binding protein (CREB) may act as a molecular locus capable of transducing aversive experiences into lasting changes in the structure and function of neurons in the hippocampus. However, the signal transduction cascades recruited by stress to modulate CREB activity are less well understood. Therefore, the goal of this thesis was to investigate stress-induced modulation of CREB phosphorylation and upstream signaling cascades in the hippocampus of male and female rodents exposed to severe stress. Exposure to either acute predator odor stress or chronic variable stress reduced phosphorylation of CREB in the male, but not the female hippocampus. Predator odor exposure rapidly reduced phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase and increased nuclear expression of the synapto-nuclear messenger protein Jacob in the male hippocampus, consistent with the previously described CREB shut-off cascade. Chronic variable stress affected the activity of Sirtuin1, a metabolically-sensitive deacetylase known to interact with CREB, in the male, but not the female dentate gyrus sub-area of the hippocampus, possibly through recruitment of adenosine monophosphate activated protein kinase. Behaviorally, female rodents exposed to predator odor exhibited an impaired ability to discriminate between a context previously paired with the predator odor and a neutral context, possibly representing a fear over-generalizing phenotype. In contrast female rodents exposed to chronic variable stress did not exhibit the altered metabolic phenotypes observed in male rodents exposed to chronic variable stress, suggesting that females are more resilient to chronic stress. Collectively, these data suggest that the female hippocampus resists changes in CREB phosphorylation associated with severe stress which may contribute to sex differences observed in stress-related mental health disorders. / 1 / Damek Homiack

Widespread epidemiological data support the notion that high isoflavoves intake is safe and provides health benefits similar to estrogen. Isoflavones have been reported to regulate genes that are involved in several cellular events, such as control of cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis, transcription regulation, cancer invasion and metastasis and so on. Previously, soy isoflavones have been demonstrated to have a tumor suppressor effect on bladder cancer. We earlier identified 71 candidate bladder tumor suppressors by using the isoflavones treatment vs. non-treatment in RT4 (Stage I, TMN) cells in conjunction with the strategy of suppression subtractive cDNA libraries. In a preliminary screening, epithelial membrane protein 2 (EMP2) mRNA was downregulated in higher TMN-grade bladder tumor cells. In this study, we aim at the mechanism of isoflavones upregulation of the candidate bladder tumor suppressor: EMP2. In order to clarify the regulatory mechanism, we have constructed a series of 5¡¦ deletion fragment of EMP2 promoter (-1,420 to +268 bp) into a luciferase reporter plasmid pGL3-baisc and analyzed the promoter activity. The rapidly loss of the promoter activities when the region between pH (-44 to +268) and pI (-24 to +268) is deleted, suggesting that at least one critical transcriptional factor binding site may exist between -44 to -24 bp region. By bioinformatics, the transcription factor CREB1 binding site is predicted in the critical region. The ChIP assay and site-directed mutagenesis of the CREB site reveal its critical role for the EMP2 transcription. The EMP2 mRNA is downregulated after knock-down of CREB1 protein by shCREB1 in J82 cells. It can be evidence for EMP2 transcription is regulated by transcription factor CREB1. In investigations of genistein (one component of isoflavones) up-regulated EMP2 transcripts, we find there are consistent results for genistein upregulated of EMP2 promoter region. In conclusion, transcription factor CREB1 plays an important role in the regulation of EMP2 transcription.

Patterns of physiological electrical activity in the central nervous system (CNS) cause longlasting changes in gene expression that promote neuronal survival. These changes can be mediated by signalling pathways activated by Ca2+ influx through synaptic N-methyl DAspartate receptors (NMDARs). Identification and study of these, and other neuroprotective signalling pathways of the CNS, is invaluable; as this may one day lead to therapeutic strategies against the deleterious effects of CNS injury or degeneration. The data presented in this thesis focuses on activity-dependent neuroprotection and how it interacts with other signalling pathways to protect against apoptotic and oxidative insults. A previously unobserved role of activity-dependent neuroprotection in mediating the effects of the neuropeptide PACAP is demonstrated. By promoting cAMP/PKA signalling PACAP triggers neuronal firing activity, which is essential for the neuroprotective effects mediated by PACAP. This firing activity cooperates with direct signalling by PKA in promoting longlasting CREB-mediated gene expression. The molecular events associated with PACAP mediated stimulation of CRE-dependent gene expression are presented. Investigation of the control of neuronal antioxidant defences by neuronal activity, both on its own and in cooperation with astrocyte-derived support, was also investigated. Neuronal activity is demonstrated to strongly increase the capacity of the antioxidant glutathione (GSH) system, through a program of coordinated transcriptional events. The utilisation, biosynthesis and recycling of GSH is enhanced in neurons, leading to increased resistance against oxidative insults. Since several GSH pathway enzyme genes are regulated by the transcription factor Nrf2, the ability of CDDO-F3, a small molecule activator of Nrf2, to mimic the effect of firing activity on neuronal GSH levels was examined. CDDO-F3 sustains neuronal GSH levels and confers neuroprotection against oxidative insult. These actions are dependent on the presence of astrocytes; whereas Nrf2 mediated regulation of GSH pathway genes is essentially inactive in neurons. Neuronal activity and activation of the astrocytic Nrf2 pathway can cooperate, maintaining neuronal GSH levels and protecting neurons against strong oxidative insults. Collectively this work expands our knowledge as to the molecular mechanisms of activity-dependent neuroprotection, and how such signals may synergise with other protective pathways to promote neuronal health.

Les variations de la concentration cytosolique de Ca[indice supérieur 2+] contrôlent divers processus biologiques tel la contraction, la division cellulaire et la transactivation de gènes. Chez les cellules non excitables, la stimulation de certains GPCRs (G protein coupled receptor) ou récepteurs tyrosine kinase mène à l'activation d'une phospholipase C qui produit de l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]). L'IP[indice inférieur 3] active un récepteur-canal au niveau du réticulum endoplasmique (RE) et permet une relâche de Ca[indice supérieur 2+] du RE. Il existe trois isoformes distinctes d'IP[indice inférieur 3]R (IP[indice inférieur 3]R-1 à -3) différemment exprimées dans les tissus. Dans ces travaux, nous avons étudié un mode de régulation de l'IP[indice inférieur 3]R-2 par la PKC, une kinase elle-même activée lors de la réponse calcique. Nous avons aussi vérifié l'implication de chaque isoforme d'IP[indice inférieur 3]R dans l'activité transcriptionnelle des facteurs de transcription sensibles au Ca[indice supérieur 2+] NFAT et CREB.Les cellules AR4-2J expriment principalement l'IP[indice inférieur 3]R-2 (86%), ce qui en fait un bon modèle d'étude pour les mécanismes de régulation de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Dans la première étude, nous avons vérifié si la PKC influençait l'activité calcique de l'IP[indice inférieur 3]R-2. D'abord, nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est majoritairement exprimé dans les cellules AR4-2J. Nous avons montré par phosphorylation in vitro et in cellulo que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est phosphorylé par la PKC. Nous avons montré que le traitement par la PKC réduit la réponse calcique induite par l'IP[indice inférieur 3] sur des cellules perméabilisées. Finalement, nous avons démontré que la réponse calcique induite par le CCh ou l'EGF sur des cellules entières était réduite avec l'activation de la PKC. Ces résultats indiquent que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est une autre cible de la PKC permettant de contrôler l'intensité de la réponse calcique. Dans la deuxième étude l'objectif était de déterminer l'implication des isoformes d'IP[indice inférieur 3]R sur l'activité des facteurs de transcription sensibles au Ca[indice supérieur 2+] NFAT et CREB. Par l'approche des gènes rapporteurs de l'activité de NFAT ou CREB, nous avons montré que NFAT était activé par la voie de la calcineurine et que CREB par les voies de CamKII et de la calcineurine dans les cellules HEK 293A. Nous avons démontré que l'invalidation de l'IP[indice inférieur 3]R-2 diminuait la réponse calcique induite par le CCh et que la costimulation avec le VIP pouvait la restaurer. Nous avons montré que l'activité transcriptionnelle de NFAT était affectée, contrairement à celle de CREB, par l'invalidation de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Finalement, nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-2, et aussi l'IP[indice inférieur 3]R-1, semblent jouer un rôle secondaire, différent de celui de transporteur de Ca[indice supérieur 2+], dans le mécanisme d'activation de NFAT. Ces résultats laissent envisager que l'IP[indice inférieur 3]R serait impliqué dans la formation d'un complexe protéique facilitant l'activation de NFAT.

1 / Rongrong Zhang

Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in dt. Sprache.

Les molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH) jouent un rôle crucial dans la régulation des réponses immunitaires. Il existe trois familles de molécules présentatrices d’Ag : les molécules du CMH de classe I et II et les molécules CD1qui possèdent la particularité de présenter des lipides et des glycolipides. Parmi ces molécules, CD1a est exprimée de façon variable à la surface des cellules dendritiques. L’objectif de mon travail de thèse a été de déterminer les mécanismes de régulation de l’expression de la molécule CD1a sur les cellules dendritiques humaines. Ce travail a donc permis de montrer que la régulation de CD1a par CD99, au sein des cellules dendritiques, implique l’activation de la voie de signalisation de p38 MAPK, ainsi que de la voie de l’AMPc conduisant à la phosphorylation constitutive des facteurs de transcription ATF-2 et CREB-1. La forme courte de CD99 est, quant à elle, requise pour obtenir une inhibition de la voie de signalisation induite par la forme longue de CD99. La différentiation in vitro de monocytes en cellules dendritiques est caractérisée par un « switch » de l’expression de CD99. Son absence conduit à la génération de cellules dendritiques CD1a négatives. Mon travail a également permis de démontrer l’implication des voies de l’AMPc et p38 dans la génération de ces deux sous populations de cellules. Cette étude suggère fortement un rôle pour CD99 dans la régulation de la différenciation des monocytes en différents sous types de cellules dendritiques. / Introduction: Accumulating data have shown that the microenvironment of dendritic cells modulates subtype differentiation, demonstrating a link between lipoproteins, PPARγ activation, and the differentiation and functional activity of CD1- and CD1a+ iDCs. We have previously established that CD99, a ubiquitous surface molecule expressed as two isoforms, could regulate CD1a expression in iDCs. The percentage of CD1a negative iDCs substantially varied among individuals, only 10% of healthy donors exhibit a very low percentage of CD1a positive iDCs. The goal of the present study was to characterize the mechanisms by which exogenous factors confer these effects. Methods: Monocyte from healthy donors or patients with lipid disorders were differentiated into iDCs and CD1a expression was analysed by flow cytometry. CD1a expression was analysed at both membrane and intracellular levels using western blot analysis and flow cytometry in healthy donnors. Then monocytes were differentiated to iDCs under differents conditions so that modify CD1a+/CD1a- cells balance. Results: We demonstrated that lipid disorders in patients shift DC differentiation to the development of CD1a− DCs and modulate DC activation through its inhibitory effect on CD1a+ DC differentiation. We suggest that beside activation of intracellular signaling the lipoproteins microenvironement is also crucial for CD1a regulation.

L'infection chronique par le virus de l’hépatite B (HBV) est un problème de santé majeur dans le monde et peut conduire à la cirrhose et à l’hépatocarcinome. Des réponses défectives des cellules T ont été démontrées, mais les événements précis qui peuvent contribuer à l'insuffisance des réponses des cellules B restent à déterminer. L'expansion et la différenciation optimales des cellules B reposent sur l'activité du récepteur Toll Like Receptor 9 (TLR9) qui détecte l'ADNdb et est exprimée chez l'homme principalement par les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) et les cellules B. L'impact de HBV sur TLR9 dans les cellules B humaines reste à explorer. Dans cette étude, nous avons exploré les effets de HBV sur l’expression et les fonctions médiées par TLR9 dans les cellules B humaines en utilisant une lignée cellulaire de cellules B ainsi que des lymphocytes B primaires. De plus, on a corroboré nos résultats dans une cohorte de patients HBV chroniques. L'expression de TLR9 a été réduite chez les toutes les sous-populations de cellules B du sang périphérique, exposées au VHB. Les fonctions des cellules B médiées par TLR9 comme la prolifération et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires ont été abrogées en présence de HBV. Nos résultats montrent que l’antigène de surface HBsAg inhibe la phosphorylation du facteur de transcription CREB qui ne peut plus se lier sur son site CRE situé sur le promoteur TLR9 ce qui affecte la transcription de ce dernier. Enfin, nous avons corroboré nos résultats in vitro dans une cohorte de porteurs chroniques du HBV et constaté que l'expression et la fonction de TLR9 étaient significativement diminuées. Nos résultats révèlent le mécanisme qui induit une réponse immunosuppressive par HBV sur la fonction TLR9 dans les cellules B humaines, ce qui peut contribuer à la persistance de ce virus chez l'hôte et la complication de la phase chronique de la maladie / Chronic HBV infection is a major health problem worldwide. Ineffective T cell and antibody responses have been demonstrated, yet the precise events that may contribute to insufficient B cell responses remain to be determined. Optimal B cell function, expansion and differentiation rely on Toll Like Receptor 9 (TLR9) activity which senses dsDNA and is expressed in human mainly by plasmacytoid dendritic ( pDC) and B cells. The impact of HBV on TLR9 in human B cell subsets remains to be explored.Here, we investigated the effects of HBV on TLR9 function in human B cells. Both primary and B cell lines were used to analyze the effect of HBV on TLR9 expression and function. These results were corroborated in a cohort of chronically infected HBV patients. TLR9 expression was reduced in all peripheral blood B cells subsets exposed to HBV. B cell function mediated by TLR9, such as proliferation and pro-inflammatory cytokines secretion were abrogated in the presence of HBV. Our results show that the viral surface antigen HBsAg inhibited the phosphorylation of the transcription factor CREB which could no longer bind the CRE site located on the TLR9 promoter. Finally, we corroborated our in vitro findings in a cohort of chronic HBV carriers (CHB) and found that TLR9 expression and function were significantly suppressed.Our findings reveal the mechanism that induces an immunosuppressive response by HBV on TLR9 function in human B cells, which may contribute to HBV persistence in the host

Les neutrophiles représentent une composante fondamentale du système immunitaire. En effet, il est bien connu qu'ils sont essentiels à la défense de l'organisme contre les agressions microbiennes. En plus de leurs fonctions anti-microbiennes classiques, les neutrophiles, via la sécrétion de cytokines (incluant les chimiokines), jouent un rôle prépondérant dans l'initiation et la modulation de la réponse immunitaire. Lors d'une infection ou d'une blessure, les neutrophiles agissent à titre de premier répondant et migrent rapidement au site de l'aggression. La production rapide de cytokines par les neutrophiles permet le recrutement additionnel de neutrophiles au site inflammatoire et celui d'autres populations leucocytaires, tout en modulant les fonctions de ces dernières. La génération de cytokines par les neutrophiles est induite par une vaste gamme de stimuli: agonistes d'origine microbienne, facteurs chimiotactiques, cytokines, chimiokines et facteurs de croissance. Ces signaux inflammatoires induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation menant ultimement à l'activation de facteurs transcriptionnels. L'expression des gènes de cytokines inflammatoires doit être finement régulée afin qu'il y ait une production adéquate de ces médiateurs. Elle repose, en grande partie, sur le recrutement de facteurs transcriptionnels capables de se lier à des séquencescibles sur les promoteurs de ces gènes.Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l'identification des facteurs de transcription impliqués, ainsi que des sentiers de signalisation en amont, dans l'expression de gènes encodant des cytokines chez le neutrophile humain. Dans le premier chapitre de la section résultats, nous avons montré que l'expression génique des cytokines dépend fortement de l'activation du facteur de transcription NF-[kappa]B. Celui-ci contrôle l'expression inductible de tous les gènes étudiés. De plus, nous avons montré que la génération de ces cytokines chez les neutrophiles dépend fortement de l'activation des voies p38 MAP kinases (aux niveaux transcriptionnel et traductionnel) et MEK/ERK (au niveau traductionnel seulement). Dans le deuxième chapitre, nous avons étudié l'expression et la localisation des différents facteurs de transcription de la famille C/EBP, de même que l'activation de C/EBP[bêta] via sa phosphorylation en Thr 235 chez les neutrophiles humains. Grâce à la surexpression d'un répresseur des C/EBP (A-C/EBP2N3T) chez les cellules PLB-985 granulocytiques, nous avons montré l'importance de la famille de C/EBP dans la production de MIP-1[alpha], de MIP-1[bêta] et d'IL-8 chez les neutrophiles humains.Les facteurs C/EBP ne semblent toutefois pas impliqués dans la production de TNF-[alpha] par ces cellules. La surexpression d'un mutant de C/EBP[bêta] (C/EBP[bêta] T235A) chez ces mêmes cellules nous a par ailleurs permis de déterminer que la phosphorylation de cet acide aminé est essentielle à la production des chimiokines MIP-1[alpha], MIP-1[bêta] et IL-8. Nous démontrons enfin une association constitutive de C/EBP[bêta] et de C/EBP[epsilon] avec le promoteur de l'IL-8 chez les neutrophiles primaires humains. Un des éléments déclencheurs de la transcription de ce gène serait probablement l'induction de la phosphorylation de C/EBP[bêta] sur les promoteurs géniques. Enfin, dans le troisième chapitre de la section résultats, nous explorons le rôle de la MAPK p38 dans la production de cytokines chez les neutrophiles. Nous y identifions quelques-uns de ses substrats impliqués dans la transcription et la traduction de cytokines inflammatoires. Ainsi, nous avons determiné que la MAPK p38 participe à l'activation des facteurs de transcription C/EBP[bêta] et CREB, probablement via l'activation des kinases MSK-1 et RSK. Nous avons également établi l'impact de la phosphorylation de la Ser 133 de CREB sur la production de cytokines chez les neutrophiles humains. Finalement, nous avons documenté l'activation de la kinase MNK1 par la MAPK p38, et son rôle dans la régulation traductionnelle des cytokines. L'ensemble de ces travaux a permis d'identifier des molécules-clés dans la génération de cytokines, plus particulièrement de chimiokines, chez le neutrophile humain. Nos travaux ont donc contribué de manière substantielle à nos connaissances des mécanismes transcriptionnels et traductionnels gouvernant l'expression de gènes précoces chez le neutrophile. Nos résultats permettront en outre l'identification de cibles thérapeutiques potentielles qui pourraient servir à atténuer l'inflammation chronique observée dans de nombreuses pathologies où les neutrophiles prédominent.

Extensive research in both humans and animals has identified and isolated distinct brain regions essential for different types of memory, supporting the notion of multiple memory systems (MMS). The hippocampus and the striatum are the two systems that have been studied widely and are the focus of our studies. Research involving lesion and pharmacologic manipulations on both memory systems show strong evidence for independence. However, recent evidence suggests that both memory systems can interact as well. Though evidence point also in favor interactions, the mechanisms under which these systems interact are unknown. The experiments in this dissertation primarily focused on understanding how these two systems operate in a normally functioning brain. Two methods were used to investigate our notions: 1) Behavioral experiment measured cellular changes in the levels of phosphorylated CREB (pCREB) in the regions of interest (ROI) 2) Somatic experiments measured changes in the behavior following manipulation of CREB selectively in the ROI. Overall, these experiments demonstrate CREB as a critical neuronal marker that can be used in both interventions. Behavioral intervention experiment showed evidence as a plasticity related changes in the levels of pCREB that suggested both the hippocampus and the striatum might act in a competitive manner, bidirectionally. The somatic intervention experiments used lentiviral (LV) vectors and showed evidence that LV CREB manipulations are suitable for chronic stable expression and can be used to investigate multiple tasks following a single manipulation. LV mutant CREB in the hippocampus impaired memory across two different hippocampus-dependent tasks and demonstrated that CREB is critical for long term memory. Overexpression of wild type CREB in the striatum enhanced striatal memory, but also showed evidence for hippocampus competition and cooperation. Similarly, CREB overexpressed in the hippocampus of young and middle-aged rats demonstrate that CREB might be a rate limiting factor in young, but not in the middle-aged rats. / acase@tulane.edu