Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή (EMT – epithelial to mesenchymal transition) είναι ένας τύπος επιθηλιακής πλαστικότητας που χαρακτηρίζεται από μακράς διάρκειας φαινοτυπικές και μοριακές αλλαγές στο επιθηλιακό κύτταρο ως αποτέλεσμα μιας διαδικασίας διαφοροποίησης προς κύτταρο μεσεγχυματικού τύπου. Η μοριακή αυτή διεργασία φαίνεται πως είναι θεμελιώδης κατά την μετάσταση επιθηλιακών καρκίνων και αποσκοπεί στην απόκτηση από τα καρκινικά κύτταρα φαινοτυπικών χαρακτήρων που τους δίνουν την δυνατότητα διείσδυσης στους ιστούς. Το ΕΜΤ, εκτός από την μετάσταση, αποτελεί βασική διεργασία τόσο στην εμβρυική ανάπτυξη όσο και στις παθολογικές καταστάσεις της φλεγμονής και της επούλωσης. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι μια πλοήγηση μέσα από την βιβλιογραφία που αφορά το φαινόμενο ΕΜΤ και τις επιμέρους διεργασίες που το πλαισιώνουν. Στην πρώτη ενότητα θα γίνει παρουσίαση των μορίων που αναλαμβάνουν τον ρόλο της σηματοδότησης του φαινομένου το οποίο στη συνέχεια εξελίσσεται μέσα από την ενεργοποίηση δεδαλώδων σηματοδοτικών μονοπατιών. Θα παρακολουθήσουμε ακόμα την μετάδοση του σήματος μέσω των κομβικών μορίων αυτών των μονοπατιών ως τον πυρήνα όπου το σήμα απαρτιώνεται αλληλεπιδρώντας με μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση πρωτεϊνών σχετιζόμενων με την μετατροπή του επιθηλιακού κυττάρου. Στην δεύτερη ενότητα της εργασίας θα γίνει αναφορά στις δομικές και λειτουργικές αλλάγές του επιθηλιακού κυττάρου που του εξασφαλίζουν την μεταναστευτική δυναμική. Πιο συγκεκριμένα θα παρακολουθήσουμε πως το επιθηλιακό κύτταρο χάνει τη συνοχή του με το ‘περιβάλλον’ του εκφεύγοντας ταυτόχρονα της απόπτωσης. Επιπλέον θα εξετάσουμε την αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού και την έκφραση νέων πρωτεϊνών με σπουδαία συμμετοχή στο φαινόμενο. Τέλος θα γίνει αναφορά στην φαινοτυπική μετατροπή που επιφέρει το φαινόμενο ΕΜΤ στο στρώμα που περιβάλλει τον καρκίνο και πως αυτή με τη σειρά της συνεισφέρει στα δίαφορα μοριακά γεγονότα που συνιστούν το φαινόμενο. Η μετάσταση είναι μια ραγδαία εξέλιξη στην αδυσώπητη πορεία του καρκίνου. Η κατανόησή της λοιπόν σε μοριακό επίπεδο είναι ζήτημα νευραλγικής σημασίας που ξεφεύγει απο τα πλαίσια του απλού ακαδημαϊκού ενδιαφέροντος. Ο χειρισμός των μοριακών μηχανισμών για τον έλεγχο της μετάστασης θα μπορεί να αποτελέσει το στοίχημα για την ΄΄μοριακή χειρουργική΄΄ του μέλλοντος. / Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a type of epithelial cell plasticity which is characterized by long lasting phenotypic and molecular modifications of the epithelial cell as a result of a transforming procedure leading to a cell of mesenchymal type. This molecular procedure seems to be pivotal for the metastasis of epithelial cancers and its attribution to the epithelial cells is the gain of phenotypic characters which enable them to invade the tissues. EMT apart from metastasis is also an important molecular phenomenon during embryogenesis and inflammation. The target of this project is a scan through the recent bibliography about EMT. Specifically the project’s first part is going to present the molecules that induce the phenomenon followed by the activation of the complicated signaling pathways of the cell. These paths which are consisted of nodal molecules lead the sing towards the nucleus where it interacts with transcription factors. The conclusion is the regulation of the transcription of some important genes for the phenotypic alteration of the epithelial cell to a cell with mesenchymal characters. The next subject with which this project is going to deal is the thorough presentation of the alterations of the epithelial cell. These include basically the abolishment of the adherence junctions and the reconstruction of the cytoskeleton with the formation of new structures such as filopodia and lamellipodia which endows the cell with the potential of kinesis. Additionally the transformed cells produce new proteins like N-cadherin and vimentin. They also modify the production of a family of proteins with unique importance for the EMT, the so called metalloproteinases. Moreover the cell which has gone through the impact of EMT phenomenon has the ability to induce neovascular formation and at the same time acquires molecular mechanisms to avoid the programmed cell death, known as apoptosis. Finally the transformed epithelial cell implies a phenotypic modification even to the surrounding stroma of the cancer with which the epithelial cells constitute a functional harmonic unit. From one hand the modification of the stroma activates it and the activated stroma from the other hand implies an intense impact to the most molecular subjects that are related to EMT. Metastasis is a rapid development in the ominous course of cancer. The effort to deceive the molecular basis of this phenomenon is not a subject of simple academic interest since the exploit of the molecular mechanisms so as to gain the control of metastasis could be the ‘bet’ for a futuristic ‘molecular surgery’.

Το γλοιοβλάστωμα αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους τύπους καρκίνου για τον άνθρωπο δεδομένου ότι ο μέσος όρος επιβίωσης είναι 12-15 μήνες. Η συμβατική θεραπεία με τα κλασσικά χημειοθεραπευτικά σχήματα δεν έχει αποδώσει ιδιαιτέρως θετικά αποτελέσματα. Η εξέλιξη της μοριακής βιολογίας έχει «ρίξει φως» στην διερεύνηση και κατανόηση αρκετών μηχανισμών της κυτταρικής λειτουργίας που αφορούν τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων. Στο γλοιοβλάστωμα έχει παρατηρηθεί αυξημένη δραστηριότητα πολλών υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην επιφάνεια των κυττάρων όπως ο EGFR, ο PDGFR και ο VEGFR. Ταυτόχρονα, υπάρχουν και άλλα μόρια επιφανείας με ιδιαίτερο ενδιαφέρον όπως οι ιντεγκρίνες λόγω της ιδιότητας τους να καθορίζουν τη μετανάστευση. Στη νέα εποχή των αναστολέων κινάσης τυροσίνης οι οποίοι δρουν έναντι των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων και θεωρούνται πολλά υποσχόμενα μικρά μόρια, πρέπει να διερευνηθεί αν μπορούν να έχουν θέση στην αντιμετώπιση του γλοιοβλαστώματος. Αρχικά έγινε εκτίμηση της επίδρασης των αναστολέων sunitinib και lapatinib ξεχωριστά αλλά και σε συνδυασμό, στο πολλαπλασιασμό και στο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων γλοιβλαστώματος U87 και M059K σε συγκεντρώσεις 0,01, 0,1, 1 και 10μΜ. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 διμεθυλθειαζόλο βρωμιδίου και το ολοκληρωμένο σύστημα ανίχνευσης αννεξίνης V/προπιδίου (annexin V/propidium iodide), αντίστοιχα. Για τη διαδικασία της μετανάστευσης εφαρμόστηκε η μέθοδος μελέτης του χημειοτακτισμού. Η έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών MM-2 και MMP-9 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο του ζυμογραφήματος. Περαιτέρω έγινε διερεύνηση της πιθανής εμπλοκής των φαρμάκων στο σχηματισμό συμπλόκων EGFR-υπομονάδα β1 ιντεγκρινών, PDGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών και VEGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών. Η μελέτη της δημιουργίας των συμπλόκων των β υπομονάδων των ιντεγκρινών με τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης και της ανάλυσης κατά Western. Τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν και με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Με την ίδια μέθοδο μελετήθηκε και η επίδραση των φαρμάκων στη φωσφορυλιωμένη μορφή της FAK. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι και οι δύο αναστολείς sunitinib και lapatinib, μείωσαν τον πολλαπλασιασμό με δοσοεξαρτώμενο τρόπο 48 ώρες μετά την προσθήκη τους στα κύτταρα είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Τα αποτελέσματα της αναστολής του πολλαπλασιασμού συμβάδιζαν με τα αποτελέσματα της απόπτωσης όπου το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε. Περαιτέρω η μετανάστευση των κυττάρων εμφανίστηκε μειωμένη μετά την προσθήκη των φαρμάκων είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Η έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών MMP-2 και MMP-9 δεν επηρεάστηκε στα κύτταρα U87 μετά την προσθήκη και των 2 φαρμάκων. Αντίθετα, στα κύτταρα M059K το sunitinib αλλά και ο συνδυασμός του με το lapatinib ελαττώσαν την έκφραση των MMPs 48 ώρες μετά τη προσθήκη τους στο θρεπτικό μέσο. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι το lapatinib μπορεί να αναστείλει την δημιουργία συμπλόκου του EGFR με την υπομονάδα β1 των ιντεγκρινών, έως και 30 λεπτά μετά την προσθήκη του φαρμάκου στα κύτταρα. Αντίστοιχα το sunitinib μπορεί να αναστέλλει το σχηματισμό συμπλόκου της υπομονάδας β3 των ιντεγκρινών με τον VEGFR εντός δύο ωρών από την προσθήκη των φαρμάκων, χωρίς επίδραση όμως στον σχηματισμό των συμπλόκων PDGFR – υπομονάδα β3 ιντεγκρίνης. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με την χρήση ανοσοφθορισμού. Συνοψίζοντας, οι δύο αναστολείς κινάσης τυροσίνης, sunitinib και lapatinib κατάφεραν να επιδείξουν αξιόλογα αποτελέσματα στις παραμέτρους του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Τα αποτελέσματα της έρευνας είναι πρωτοποριακά διότι, αναφορικά με την μετανάστευση στο γλοίωμα, αυτή φαίνεται να αναστέλλεται αποτελεσματικότερα με τον συνδυασμό των δύο φαρμάκων πιθανά μέσω του μηχανισμού διαταραχής της δημιουργίας του συμπλόκου ιντεγκρίνης- υποδοχέας αυξητικού παράγοντα. / Glioblastoma is considered to be one of the most fatal among the malignancies in human with median survival between 12-15 months. The conventional chemotherapy cannot change the fate of these patients. Recent advances in molecular biology have shed light in the various mechanisms recruited by malignant cells in order to proliferate, metastasize and escape apoptosis. Studies in glioblastoma have already shown up-regulation in the function of tyrosine kinase receptors such as EGFR, PDGFR and VEGFR. Besides this, in the more recent years, research supports the significant role of integrins in the migration process of glioblastoma cells. In the new era of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), where their main mechanism of action is by blocking various growth factor receptors, it has to be determined a possible contribution in the fight against glioblastoma. Initially, it was estimated a possible effect of sunitinib and lapatinib applied either alone or in combination, on U87 and M059K glioma cells’ proliferation and apoptosis using doses of 0,01 μM, 0,1 μM, 1μM and 10 μM. The proliferation was estimated using the 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 dimethyltetrazolium bromide assay and apoptosis using annexin V/propidium iodide detection assay. Migration assay was performed using Boyden chamber assay. The release of MMP-2 and MMP-9 into the culture medium of U87 and M059K cells was measured by zymography. Furthermore, a possible implication of the tested agents in the formation of EGFR-integrin β1 complex, VEGFR-integrin β3 and PDGFR-integrin β3 complexes formation was studied. Immunoprecipitation and western blot analysis were used for studying the complex formation of EGFR, PDGFR and VEGFR with integrins. Validation of the results was made using immunofluorescence assay. Also, similar experiments were performed for the effect of sunitinib and lapatinib in FAK phosphorylation. The results showed that both tested agents decreased cell proliferation in a dose-dependent manner 48 h after their application in both cell lines either alone or in combination. The results in cell proliferation were in line with the increase in apoptotic cells after their treatment with the tested agents. Furthermore, the ability of U87 and M059K cells to migrate was inhibited either by each agent alone or in combination. Both agents did not affect MMP-2 and MMP-9 levels in U87 cells, however, MMPs levels were decreased in M059K cells, 48h after their treatment with sunitinib either alone or in combination with lapatinib. Additionally, a time course study for the effect of lapatinib on EGFR-integrin β1 complex revealed an inhibition in complex formation up to 30 min after agent application. Likewise, sunitinib inhibited complex formation of VEGFR-integrin β3 complex within 2h after its application without affecting PDGFR-integrin β3 complex. The previously-described interruption of complexes formation was confirmed with an immunofluorescence assay. Summarizing the results, sunitinib and lapatinib exerted significant effects on glioblastoma cell proliferation, apoptosis and migration. The preliminary results of the current study are the first to support the implication of a dual anti-EGFR/HER-2 agent, lapatinib and a multi-targeted agent, sunitinib in glioma cells migration, through a mechanism implying interruption of growth factor receptor - integrin complexes formation.

Το λεμφαγγειακό σύστημα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών, στην ανοσολογική απόκριση του οργανισμού, στην απορρόφηση των λιπών από τον πεπτικό σωλήνα, και στη διασπορά των καρκινικών κυττάρων. Η πρόσφατη ανακάλυψη ειδικών για τα λεμφαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα δεικτών και αναπτυξιακών παραγόντων, όπως επίσης και η δημιουργία γενετικών μοντέλων ποντικιών με διαταραγμένη τη λειτουργία του λεμφαγγειακού συστήματος, παρείχαν σημαντικότατες πληροφορίες για τη μοριακή ρύθμιση της εμβρυικής ανάπτυξης του λεμφαγγειακού συστήματος και της φυσιολογίας του. Τα σχετικά πρόσφατα αναγνωρισμένα μοριακά σηματοδοτικά μονοπάτια από τα οποία ρυθμίζεται η λεμφαγγειογένεση επέτρεψαν τη μελέτη της σχετιζόμενης με όγκους λεμφαγγειογένεσης. Οι μελέτες αυτές κατέδειξαν ότι η σχετιζόμενη με τους όγκους λεμφαγγειογένεση αποτελεί σημαντικό στοιχείο της μεταστατικής διαδικασίας, ενώ παράλληλα αναδεικνύουν συνεχώς καινούρια μόρια/σηματοδοτικά μονοπάτια-ρυθμιστές της εν λόγω διαδικασίας. / The lymphatic vascular system plays an important role in the maintenance of fluid homeostasis, in the afferent immune response, in the intestinal lipid uptake and in the metastatic spread of malignant cells. The recent discovery of specific markers and growth factors for lymphatic endothelium and the establishment of genetic mouse models with impairment of lymphatic function have provided novel insights into the molecular control of the lymphatic system in physiology and in embryonic development. Recently, molecular pathways that signal for lymphangiogenesis have been described allowing analyses of tumor lymphangiogenesis to be performed. These studies demonstrate that tumor lymphangiogenesis is a major component of the metastatic process, while at the same time new molecules and transduction pathways are discovered to regulate tumor lymphatics growth.