Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Durante las periodontitis, la respuesta inmune del hospedero involucra la producción de citoquinas, metaloproteinasas de la matriz, quimioquinas y receptores de quimioquinas que determinan la constitución de un ambiente inflamatorio local y la estimulación de la destrucción de tejidos periodontales, pudiendo derivar en la pérdida de los dientes. Las quimioquinas (CCLs) son citoquinas quimiotácticas que cumplen un rol fundamental en la regulación de la migración de células del sistema inmune. La interacción de las quimioquinas CCL19 y CCL21 con su receptor CCR7 en las células inmunes, incrementa la secreción de citoquinas proinflamatorias y activa la diferenciación de los linfocitos Th1 y Th17. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es determinar los niveles de expresión de las quimioquinas CCL19 y CCL21 en biopsias gingivales de pacientes afectados de periodontitis crónica. Los resultados demuestran los elevados niveles de expresión de las quimioquinas CCL19 y CCL21 en biopsias de pacientes afectados con periodontitis en comparación a los sujetos sanos y sugieren un rol pro-inflamatorio en la regulación del sistema inmune y el desarrollo de la enfermedad.

Notre laboratoire a démontré que le récepteur de chimiokine CCR7 joue un rôle majeur dans la migration des monocytes en réponse à ses ligands naturels, les chimiokines CCL19 et CCL21. Plusieurs études ont permis de mettre en évidence que les monocytes en réponse à des infections, des traumatismes ou des maladies neurologiques, migrent vers les tissus en inflammation du cerveau par un mécanisme jusqu’à présent inconnu. D’un autre côté, l’activation de certains récepteurs TLR (de l’anglais « Toll-like receptors ») par des composants bactériens est caractéristique aux infections bactériennes et tient un rôle primordial dans la réponse immunitaire. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de déterminer si l’activation des TLR bactériens module l’expression de CCR7 chez les monocytes, les rendant ainsi aptes à transmigrer à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). Pour ce faire, nous avons d’abord développé un modèle in vitro de la BHE à partir de co- culture d’astrocytes humains et de cellules endothéliales microvasculaires humaines. Les résultats de résistance électrique transendothéliale (de l’anglais « Transendothelial Electrical Resistance » (TEER)) démontrent que ce modèle est fonctionnel et possède des jonctions serrées rendant la BHE imperméable et plus près de la réalité. Des essais de transmigration de monocytes démontrent que le modèle de la BHE construite limite le passage des monocytes à travers la barrière. Ces résultats laissent supposer que la BHE limite donc le passage des monocytes à travers le SNC. Cette imperméabilité aux cellules, propre à la BHE in vivo, rend le modèle idéal à des essais chimiotaxiques de transmigration. Par la suite, nos travaux ont permis de déterminer si l’activation de certains TLR par des composants provenant de bactéries Gram + et Gram – sont capables de moduler l’expression iv et la fonctionnalité de CCR7 chez les monocytes. Des PCR quantitatives effectuées avec la lignée MONO-MAC-1 ont démontré que l’activation des TLR1/2 et TLR4 promeut l’expression de l’ARNm codant pour CCR7. Des essais de cytométrie en flux ont démontré que l’activation de TLR1/2 et TLR9 chez la lignée MONO-MAC-1 ainsi que l’activation de TLR4 chez les monocytes sanguins augmentait le pourcentage de cellules exprimant CCR7 à leur surface. Des essais de migration ont démontré que le récepteur CCR7 était fonctionnel puisque la lignée MONO-MAC-1 et les monocytes sanguins traités avec l’agoniste de TLR4 migraient en plus grand nombre en réponse aux agonistes de CCR7, les chimiokines CCL19 et CCL21. Nos travaux ont aussi démontré que le récepteur CCR7 exprimé par les MONO- MAC-1 et monocytes sanguins avait une plus grande affinité envers CCL19 que CCL21. L’activation de TLR4 promeut la migration CCR7 dépendante des MONO-MAC-1 et des monocytes sanguins à travers le modèle in vitro d’une barrière hémato-encéphalique en réponse à CCL19. Nos résultats suggèrent une implication importante des récepteurs TLR4 dans la migration CCR7 dépendante des monocytes à travers la BHE et donc qu’une infection bactérienne ou que la présence de LPS dans le sang peut influencer la migration des monocytes au cerveau exacerbant ainsi des conditions neurologiques pathologiques. Davantage d’études portant sur les rôles des TLR dans la migration cellulaire pourraient permettre de développer de nouvelles thérapies.

Yes / The CCR7 chemokine axis is comprised of chemokine ligand 21 (CCL21) and chemokine ligand 19 (CCL19) acting on chemokine receptor 7 (CCR7). This axis plays two important but apparently opposing roles in cancer. On the one hand, this axis is significantly engaged in the trafficking of a number of effecter cells involved in mounting an immune response to a growing tumour. This suggests therapeutic strategies which involve potentiation of this axis can be used to combat the spread of cancer. On the other hand, the CCR7 axis plays a significant role in controlling the migration of tumour cells towards the lymphatic system and metastasis and can thus contribute to the expansion of cancer. This implies that therapeutic strategies which involve decreasing signaling through the CCR7 axis would have a beneficial effect in preventing dissemination of cancer. This dichotomy has partly been the reason why this axis has not yet been exploited, as other chemokine axes have, as a therapeutic target in cancer. Recent report of a crystal structure for CCR7 provides opportunities to exploit this axis in developing new cancer therapies. However, it remains unclear which of these two strategies, potentiation or antagonism of the CCR7 axis, is more appropriate for cancer therapy. This review brings together the evidence supporting both roles of the CCR7 axis in cancer and examines the future potential of each of the two different therapeutic approaches involving the CCR7 axis in cancer.

Chemokines are a family of chemotactic cytokines that play a multifaceted role in human biology. Chemokine receptor CCR7, activated by its ligands CCL19 & CCL21, is known to play a significant role in cancer metastasis. In view of the wider roles that chemokines play in the biology of the cell, we hypothesised that CCR7 could influence cancer progression through other mechanisms in particular increased proliferation and/or increased chemo- and radioresistance, and whether these effects may have a physiological/clinical relevance. Interestingly, CXCR4 involvement in cancer recurrence, metastasis and proliferation is already well established. Thus, it was used as a point of reference to compare whether CCR7 axis effect on cancer proliferation and chemoresistance is similar to that observed in CXCR4 axis. It is proven that hypoxia is a driving factor in increased CCR7 expression. This study shows that CCR7 expression is upregulated as a response to a number of other stress factors, in particular that caused by different chemotherapeutic treatments. In addition, we showed that CCL21, one of the two endogenous ligands for CCR7 is similarly produced under these conditions We used several techniques to establish the expression and functionality of CCR7 and CXCR4 in different cancer cell lines. We then showed that activation of the CCR7 axis by physiologically relevant concentrations of CCL21 induces cancer cell proliferation and chemo- and radio-resistance. Furthermore, these effects are abrogated by small molecule antagonists (ICT13069), neutralizing monoclonal antibody, or CCR7 knockdown. Our findings support the hypothesis that antagonising CCR7 receptor will not only inhibit cancer metastasis, as it is well-illustrated in the literature, but it would also lead to alternative therapeutic approaches as well as potential clinical endpoints. / University of Tobruk, and the Ministry of Higher Education of Libya

L’efficacité de la réponse immunitaire adaptative repose tout particulièrement sur la motilité des lymphocytes T naïfs entre la circulation sanguine et les organes lymphoïdes secondaires, leur permettant ainsi de rencontrer un antigène spécifique. De nombreuses voies de signalisation sont impliquées dans ce phénomène. En particulier, les Rho GTPases y jouent un rôle central, par leur capacité à moduler le cytosquelette d’actine. Nous avons identifié la protéine Fam65b comme nouveau régulateur de la circulation des lymphocytes T. En effet, nous avons montré que la diminution de l’expression de Fam65b dans des LT primaires humains induit une augmentation de leur polarisation, leur adhésion et leur migration in vitro. Afin d’étudier son rôle dans un contexte plus physiologique, nous avons développé au laboratoire une souris Fam65b-/-, dans laquelle l’expression de Fam65b est supprimée dans le lignage T. Les lymphocytes T issus de ces souris présentent un contenu global en F-actine réduit, une plus grande quantité de L-sélectine et d’intégrines actives à leur surface, et une migration moins rapide et moins rectiligne que leurs équivalents WT. Nous n’avons pu observer, avec nos méthodes, aucune différence significative de polarisation, de migration in vitro ou d’entrée dans les organes lymphoïdes secondaires pour les LT Fam65b-/-. Nous avons identifié les Rho GTPases comme médiateurs de ces effets de Fam65b. Nous avons observé, en cytométrie de flux, que les niveaux de RhoA-GTP et de Rac-GTP sont plus élevés dans les LT murins Fam65b-/-, et que cela est aussi vrai pour RhoA-GTP dans les LT humains exprimant de faibles niveaux de Fam65b. Nous avons identifié, dans des expériences in vitro, le mécanisme par lequel Fam65b inhibe l’activité de RhoA, puisqu’il ralentit sa charge en GTP par les protéines GEF. Nous avons montré, par des techniques de biochimie, que l’activation de RhoA en aval d’une stimulation chimiokine est permise par la dissociation de RhoA et de Fam65b, probable conséquence de la phosphorylation de Fam65b. Cette dissociation a aussi été observée pour Fam65b et Rac1, mais les mécanismes mis en jeu restent à déterminer. D’autre part, l’expression de Fam65b est sous le contrôle du facteur de transcription FOXO1, connu pour son rôle dans le contrôle de l’écotaxie (homing) via la régulation de l’expression de molécules permettant l’entrée dans les ganglions lymphatiques. Fam65b, régulateur atypique de l’activité des Rho GTPases, représente donc un lien inédit entre la voie PI3K/FOXO1 et les Rho GTPases. / The motility of naive T lymphocytes between the blood and secondary lymphoid organs is essential to the efficiency of the adaptative immune response, and allows those cells to meet their cognate antigen. Numerous signaling pathways are involved in this phenomenon, such as Rho GTPases, modulators of the actin cytoskeleton. We have identified Fam65b as a new regulator of T lymphocytes recirculation. We have shown that a decrease of Fam65b expression in human primary T cells increases the morphological polarization, the adhesion and the in vitro migration of those cells. Looking for a more physiological model, we developed, in the lab, a Fam65b KO (Knock-Out) mouse, specific to the T lineage. In those animals, T cells showed decreased levels of F-actin, an increase in the display of L-selectin and integrins, and a slower and less straight migration, compared to WT (Wild-Type) T cells. On the other hand, we weren't able to see any significant differences in the morphological polarisation, the in vitro migration or the homing capacity of the Fam65b KO T cells. We have identified Rho GTPases as mediators of the effects of Fam65b. We showed, in flow cytometry, that the amount of RhoA-GTP and Rac-GTP are increased in the Fam65b KO cells. The RhoA-GTP levels are also increased in human primary T cells expressing low levels of Fam65b. We have identified, in in vitro experiments, that Fam65b slows down RhoA loading with GTP by its GEF proteins, thus inhibiting RhoA activity. Moreover, we showed that Fam65b dissociates from RhoA after chemokine stimulation of T cells, thus allowing RhoA activation. The phosphorylation of Fam65b is a probable cause to this phenomenon. Fam65b also dissociates from Rac1 in these conditions, although no mechanism is yet known. Furthermore, the transcription factor FOXO1 controls the expression of Fam65b. FOXO1 is also known to control the homing capacity of T cells, since it controls the expression of molecules involved in the entry of lymphocytes in the lymph nodes. Fam65b, an atypical regulator of Rho GTPases activity, thus represents a new connection between the PI3K/FOXO1 and the Rho GTPases pathways.

Le Récepteur de chimiokine CCR7 joue un rôle important dans la migration des cellules immunitaires, permettant ainsi l'initiation de la réponse immunitaire. Des études ont démontré qu'une déficience dans l'expression de ce récepteur ou de ces ligand CCL19 et CCL21 a un impact considérable sur la mise en place de la réaction immunitaire suite a un stimulus. D'autre part la prostaglandine de série E 2 a été identifié comme un agent régulateur important sur l'expression et la fonctionnalité du récepteur CCR7 dans l'établissement de la réponse immunitaire, principalement au niveau des cellules dendritiques. L'élévation du niveau de prostaglandine E 2 , lors de certaine infection, induit une augmentation importante de la migration des cellules immunitaires, lors de l'activation du récepteur CCR7. Ces cellules vont alors migrer vers ses ligands qui sont produit principalement au niveau des ganglions lymphatique, permettant ainsi la présentation antigénique aux cellules du système immunitaire adaptatif. Récemment, des travaux ont permis de mettre en évidence l'expression du récepteur CCR7 chez les monocyte et du rôle important de la PGE 2 dans l'expression et la fonctionnalité du récepteur chez ces cellules. Les travaux réalisés dans le cadre de cette maîtrise avaient pour but, dans un premier temps, de déterminer les mécanismes moléculaires permettant la migration cellulaire des monocytes suite à l'activation du récepteur CCR7 par la présence de son ligand CCL19. Nous avons également vérifié l'implication de la PGE 2 dans ce processus. Partant des mécanismes connus chez les cellules dendritiques et des cellules T, nous avons établi que la participation des MAPK p38, ERK et JNK sont importantes dans ce processus. La présence de PGE2 permet une phosphorylation plus rapide de ses MAPK. Nous avons ensuite vérifié la participation de la voie RhoA/ROCK, importante dans le réarrangement du cytosquelette d'actine. L'activation du récepteur CCR7 par son ligand CCL 19 permet une activation de RhoA. Cette activation survient plus rapidement lorsque les cellules sont en présence de PGE 2. Lorsque ces voies métaboliques sont bloquées par des inhibiteurs pharmacologiques, la migration des monocytes est alors inhibée, démontrant l'importance de ses voies pour la migration des monocytes vers les ligands CCL191 Dans un second temps, nous avons étudié l'impact de la maturation des monocytes en macrophage sur le récepteur CCR7. Jusqu'à maintenant, il est connu que la PGE2 permet une augmentation de l'expression de CCR7 chez les monocytes et augmente la réponse chimiotactique des cellules vers les ligands de CCR7. De plus on sait que lors de la maturation des monocytes en cellules dendritique mature, une forte augmentation de l'expression du récepteur CCR7 est observé et que la présence de PGE 2 est essentielle pour assurer la fonctionnalité du récepteur. Toutefois, l'impact de la maturation des monocytes en macrophage sur le récepteur CCR7 est encore inconnu. Nous avons alors démontré que lors de la maturation des monocytes en macrophages, il y a une importante perte de l'expression du récepteur CCR7 et que la présence inflammatoire de la PGE 2 ne permet pas une augmentation de l'expression du récepteur et de la migration des cellules chers les ligands de CCR7. La migration des macrophages vers les ganglions lymphatique ne serait alors pas attribuée à la chimiotaxie de CCR7 vers ses ligands. Ces travaux ont permis de mettre en lumière les principaux acteurs moléculaires impliqué dans la migration des monocytes suite à l'activation du récepteur CCR7 et que la PGE2 permettrait aux monocytes de migrer préférentiellement vers ses ligands au lieu de transmigrer vers les tissus où ils se différencieraient en macrophage. Suite à la différenciation des monocytes en macrophages, nous avons également pu démontrer qu'ils n'ont plus la capacité d'exprimer le récepteur CCR7 et amorcer leur migration vers les ligands CCL19 et CCL21 exerçant ainsi leur fonction en tant que cellules résidente des tissus.[ symboles non conformes]

Chemokines are chemotactic cytokines, which mediate cell trafficking and play a key role in mobilisation of leukocytes. More recently, chemokines and their cognate receptors have been described as key players in different aspects of cancer biology contributing to proliferation, angiogenesis and metastasis. In particular, chemokines CCL19 and CCL21 acting on their associated receptor CCR7 are postulated to be key drivers of lymph node metastasis in a number of malignancies including breast, colon, gastric, & thyroid cancers. It has been reported that the cleavage of the pre-cysteine bridge N-terminal residues of CCL21 (SDGGAQD) and of CCL19 (GTNDAED) renders both peptides incapable of fully activating CCR7. However, little is known about the nature of the interactions that occur between the N-terminal residues of CCL19 or CCL21 and the CCR7 receptor, or the role they have in activation of CCR7. The aim of this study is to investigate the role of the residues in the N-terminus of CCL19 and in particular CCL21 in the context of CCR7 activation and to use this information in the discovery of novel CCR7 antagonists or agonists. To achieve this, we synthesised a number of short (three to seven amino acids) peptides and peptidomimetics inspired by the seven N-terminal amino acid residues of CCL19 and CCL21 and pharmacologically characterised their ability to activate CCR7 or block the activation of CCR7 using a number of in vitro assays such as calcium flux, trans-well (Boyden chamber), and Western blotting. We also carried out computational studies to better understand and predict the activity of these peptides. Our results demonstrate that some of these peptides are indeed capable of acting as agonists or antagonists of CCR7. / Kuwait Health Ministry and Kuwait Civil Services Commission

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Το λεμφαγγειακό σύστημα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών, στην ανοσολογική απόκριση του οργανισμού, στην απορρόφηση των λιπών από τον πεπτικό σωλήνα, και στη διασπορά των καρκινικών κυττάρων. Η πρόσφατη ανακάλυψη ειδικών για τα λεμφαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα δεικτών και αναπτυξιακών παραγόντων, όπως επίσης και η δημιουργία γενετικών μοντέλων ποντικιών με διαταραγμένη τη λειτουργία του λεμφαγγειακού συστήματος, παρείχαν σημαντικότατες πληροφορίες για τη μοριακή ρύθμιση της εμβρυικής ανάπτυξης του λεμφαγγειακού συστήματος και της φυσιολογίας του. Τα σχετικά πρόσφατα αναγνωρισμένα μοριακά σηματοδοτικά μονοπάτια από τα οποία ρυθμίζεται η λεμφαγγειογένεση επέτρεψαν τη μελέτη της σχετιζόμενης με όγκους λεμφαγγειογένεσης. Οι μελέτες αυτές κατέδειξαν ότι η σχετιζόμενη με τους όγκους λεμφαγγειογένεση αποτελεί σημαντικό στοιχείο της μεταστατικής διαδικασίας, ενώ παράλληλα αναδεικνύουν συνεχώς καινούρια μόρια/σηματοδοτικά μονοπάτια-ρυθμιστές της εν λόγω διαδικασίας. / The lymphatic vascular system plays an important role in the maintenance of fluid homeostasis, in the afferent immune response, in the intestinal lipid uptake and in the metastatic spread of malignant cells. The recent discovery of specific markers and growth factors for lymphatic endothelium and the establishment of genetic mouse models with impairment of lymphatic function have provided novel insights into the molecular control of the lymphatic system in physiology and in embryonic development. Recently, molecular pathways that signal for lymphangiogenesis have been described allowing analyses of tumor lymphangiogenesis to be performed. These studies demonstrate that tumor lymphangiogenesis is a major component of the metastatic process, while at the same time new molecules and transduction pathways are discovered to regulate tumor lymphatics growth.