Univ., Diss.--Würzburg, 1995.

Tübingen, Univ., Diss., 2003.

Zugl.: Berlin, Freie Univ., Diss., 2006

Zugl.: Hannover, Tierärztliche Hochsch., 2007

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2003--Hannover.

Für das klinische Management des Prostatakarzinoms werden nuklearmedizinische Verfahren zunehmend relevant. Bildgebung und Therapie, welche gegen das Prostataspezifische Membranantigen (PSMA) gerichtet sind, werden bereits im klinischen Alltag angewendet. Weitere potenzielle Biomarker des Prostatakarzinoms, wie beispielsweise der CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) und der Somatostatinrezeptor Typ 2 (SSTR2), werden zudem als nuklearmedizinische Zielstrukturen diskutiert. Vorangegangene Arbeiten legten einen Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der PSMA-Expression und der Sensitivität gegenüber Docetaxel in Prostatakarzinomzellen nahe. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, diesen Mechanismus genauer zu untersuchen. Dabei wurden die Aktivität onkogener Signalwege, die Proliferation und die CXCR4- sowie die Androgenrezeptor (AR)- Expression in Prostatakarzinomzelllinien mit unterschiedlicher PSMA-Expression durchflusszytometrisch quantifiziert. Im zweiten Projektteil sollte der Einfluss von Metformin und verschiedener, bereits in der Prostatakarzinomtherapie angewandter Medikamente (Docetaxel, Dexamethason, Abirateron und Enzalutamid), auf die Expression von PSMA, CXCR4 und SSTR2 untersucht werden. Die Quantifizierung der Expression erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Ein kausaler Mechanismus für den Zusammenhang zwischen PSMA-Expression und Docetaxel-Sensitivität konnte in dieser Arbeit schließlich nicht hergestellt werden. Es zeigten sich jedoch vor allem Expressionsmodulationen von PSMA und CXCR4. Mittels Docetaxel konnte z.B. bei C4-2 Zellen eine Verdopplung der PSMA-Expression und eine Verdreifachung der CXCR4-Expression erreicht werden. Darüber hinaus zeigte die Behandlung mit Abirateron eine deutliche Heraufregulation der PSMA- Expression bei LNCaP und C4-2 Zellen, sowie eine Zunahme der CXCR4- Expression bei allen untersuchten Zelllinien. Sollte sich der Einfluss der medikamentösen Behandlung auf die Expression von PSMA und CXCR4 bestätigen, kann dies zukünftig zur verbesserten und individualisierten Diagnostik und Therapie von Prostatakarzinompatienten beitragen. / Nuclear medicine methods are becoming increasingly relevant for the clinical management of prostate carcinoma. Imaging and therapy directed against the prostate specific membrane antigen (PSMA) are already used in clinical practice. Other potential biomarkers of prostate cancer, such as CXC motif chemokine receptor 4 (CXCR4) and somatostatin receptor type 2 (SSTR2), are also being discussed as nuclear medicine targets. Previous work suggested a relationship between the level of PSMA expression and sensitivity to docetaxel in prostate cancer cells. One aim of the present work was to further investigate this mechanism. The activity of oncogenic signalling pathways, proliferation and CXCR4 expression as well as androgen receptor (AR) expression in prostate carcinoma cell lines with different PSMA expression were quantified by flow cytometry. In the second part of the study, the influence of metformin and various drugs already used in prostate carcinoma therapy (docetaxel, dexamethasone, abiraterone and enzalutamide) on the expression of PSMA, CXCR4 and SSTR2 was assessed. Expression was quantified by flow cytometry analysis. A causal mechanism for the connection between PSMA expression and docetaxel sensitivity could, eventually, not be established in this work. However, expression modulations were primarily found for PSMA and CXCR4. Using docetaxel, for instance, a doubling of PSMA expression and a tripling of CXCR4 expression could be achieved in C4-2 cells. In addition, treatment with abiraterone showed a significant upregulation of PSMA expression in LNCaP and C4-2 cells, as well as an increase in CXCR4 expression in all cell lines examined. If the influence of drug treatment on the expression of PSMA and CXCR4 is confirmed, this may contribute to improved and individualised diagnostics and therapy of prostate cancer patients.

Hintergrund: Kraniopharyngeome sind seltene embryonale Fehlbildungstumoren. Bei insgesamt guter Überlebensrate von Patienten nach Erkrankung im Kindes- und Jugendalter werden Prognose und Lebensqualität von Langzeitüberlebenden durch Nebenwirkungen und Spätfolgen wie Hypophyseninsuffizienz und ausgeprägter Adipositas wesentlich geprägt. Zur Prophylaxe bzw. zur Therapie eines Hirnödems, sowie zur Prophylaxe einer drohenden Addisonkrise muss beim Kraniopharyngeom im Kindes- und Jugendalter während und nach der Operation Dexamethason substituiert werden. Langfristige hochdosierte Dexamethasongaben führten bei Patienten mit anderen malignen onkologischen Erkrankungen zu Gewichtszunahme und Cushing-Syndrom. Demnach wurde in der vorliegenden Studie der Einfluss der perioperativen Dexamethasontherapie auf die kurzfristige und langfristige Gewichtsentwicklung bei Kindern und Jugendlichen mit Kraniopharyngeom untersucht. Patienten und Methoden: Die Krankenunterlagen von 81 Kindern und Jugendlichen mit Kraniopharyngeom wurden untersucht. Die Krankenunterlagen von 58 Patienten (27 weiblich - 31 männlich) mit insgesamt 68 operativen Eingriffen konnten hinsichtlich der Daten zum postoperativen Gewichtsverlauf und zur perioperativen Dexamethasontherapie in die retrospektive Untersuchung einbezogen werden. Die mediane Nachbeobachtungsdauer betrug 4,2 Jahre. Größe und Gewicht der Patienten wurde für den Zeitpunkt der Operation, für Kontrollzeitpunkte 3,6, 9 und 12 Monate nach der Operation sowie für die zuletzt stattgefundene Kontrolluntersuchung ermittelt. Um den Grad der Adipositas der einzelnen Patienten zu bestimmen, wurde ihr Body Mass Index (BMI) berechnet. Der BMI wurde anhand der Referenzwerte von Rolland-Cachera als Standardabweichung (SDS) ausgedrückt. Patienten mit BMI- Werten > 3 SD bei der letzten Kontrolluntersuchung wurden als ausgeprägt adipös definiert, solche mit Werten < 2 SD als normalgewichtig, solche mit Werten zwischen 2 SD und 3 SD als mäßig adipös. Zur Beschreibung der Dexamethasontherapie wurden aus den Unterlagen jedes Patienten für jede der neurochirurgischen Operationen die kumulative Gesamtdosis an Dexamethason (mg/m2), Die Dauer der Dexamethasontherapie (Tage) und der Applikationsmodus (intravenös/ oral) ermittelt. Schätzung der Gruppenunterschiede zwischen der Gruppe der ausgeprägt adipösen Patienten und der Gruppe der normalgewichtigen Patienten mittels Mann-Whitney-U-Test. Schätzung der Signifikanz von Korrelationen mittels Spearman-Rank-Correlation-Test. Ergebnisse: 20 Patienten (12w / 8m) entwickelten eine ausgeprägte Adipositas (BMI>3SD). 26 Patienten (10w/ 16m) blieben normalgewichtig (BMI<2SD), 6 Patienten (2w/ 4m) waren bei der letzten Kontrolluntersuchung mäßig adipös (BMI zwischen 2 und 3SD). In Bezug auf das Alter der Patienten zum Zeitpunkt der Operation und die Dauer der Nachbeobachtung bestanden keine Unterschiede zwischen den Patientengruppen. Zwischen den Patientengruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die kumulative Gesamtdosis an Dexamethason, die Dauer der Dexamethasontherapie und die Applikationsform. Patienten, die langfristig eine ausgeprägte Adipositas entwickelten, hatten bereits zum Zeitpunkt der Diagnose einen höheren BMI (p<0,001). Der höchste Anstieg des BMI innerhalb des ersten postoperativen Jahres lag für alle drei Gruppen von Kraniopharyngeompatienten innerhalb der ersten drei Monate nach der Operation. Schlussfolgerungen: In der Studie konnte gezeigt werden, dass Dosis und Dauer der perioperativen Dexamethasontherapie keinen Einfluss auf die Entwicklung einer langfristigen ausgeprägten Adipositas bei Kindern und Jugendlichen mit Kraniopharyngeom hatten. Patienten, die ein erhöhtes Risiko haben, im langfristigen Verlauf eine ausgeprägte Adipositas zu entwickeln, hatten bereits zum Zeitpunkt der Diagnose einen höheren BMI. Diese Beobachtung stützt die Hypothese, dass pathogene Mechanismen zur Entwicklung einer Adipositas bereits sehr früh den Krankheitsverlauf beeinflussen. / Background: Craniopharyngiomas are rare dysontogenetic malformations. As the survival rate after craniopharyngioma diagnosed during childhood and adolescence is high, prognosis and quality of life in survivors mainly depend on adverse side effects such as hypopituitarism and severe obesity. The substitution of dexamethasone during and following surgery of childhood craniopharyngioma is necessary in order to treat and/ or prevent brain edema and acute adrenal insufficiency. Long-term, highly dosed dexamethasone therapy leads to weight gain and Cushings syndrome in patients with other oncological malignancies. Accordingly, we analysed the impact of perioperative dexamethasone treatment on short-term and long-term weight development in patients with childhood craniopharyngioma. Patients und methods: We analysed the records of 81 children and adolescents with craniopharyngioma. The records of 58 patients (27 female - 31 male) receiving 68 neurosurgical interventions were available for retrospective analysis of postoperative weight development and perioperative dexamethasone treatment. The median follow-up period was 4.2 years. Weight and height were evaluated at the time of surgery, during follow-ups at 3, 6, 9 and 12 months after surgery and at the time of final visit. The degree of obesity was categorized by calculating the body mass index (BMI). BMI was expressed as a standdard deviation score (SDS) using the references of Rolland-Cachera. A BMI at final visit above 3 SD was defined as severe obesity. A BMI < 2SD was defined as non-obese. Patients showing a BMI between 2 and 3 SD were defined as moderately obese. Dexamethasone treatment during the perioperative period was analysed in all patients for each surgery in terms of administered dexamethasone (mg/m2), duration of dexamethsone treatment (days) and mode of application (intravenous/ orally). Difference between extremely obese and non-obese patients in terms of dexamethasone treatment were estimated using the Mann-Whitney-U-Test. The significance of correlations was tested using the Spearman-Rank-correlation-Test. Results: 20 patients (12 female/ 8 male) developed severe obesity (BMI > 3SD). 26 patients (10 female/ 16 male) retained normal weight (BMI < 2SD). 6 patients (2 female/ 4 male) displayed a BMI between 2 and 3 SD at final visit. Differences in terms of age at surgery or follow-up period were non-detectable between the analysed groups of craniopharyngioma patients. Cumulative dexamethasone doses were similar for severely obese patients and normal weight patients. Differences between the groups of patients in terms of duration and mode of application of dexamethasone treatment were non-significant. Patients with long-term severe obesity had a higher (p<0,001) BMI already at the time of surgery. For all groups of craniopharyngioma patients, the maximum increase of BMI during the first year after surgery took place within the first three months. Conclusions: We conclude that dose and duration of perioperative dexamethasone treatment had no effects on the development of long-term severe obesity in patients with childhood craniopharyngioma. Patients with increased risk for severe obesity already displayed a higher BMI at the time of diagnosis. This observation supports the hypothesis that pathogenic mechanisms for severe obesity due to craniopharyngioma are of influence in the very early course of the disease.

Kinasen der SRC-Familie (SFKs) sind sowohl in Wachstum und Metastasierung von Tumor- und Leukämiezellen als auch an prominenter Stelle in vielgestaltige Signalwege aller Immunzellen involviert. Eine Hemmung von SFKs ist damit ein vielversprechendes Mittel zur Therapie maligner Erkrankungen, kann aber darüber hinaus auch sehr effektiv zur Immunmodulation genutzt werden. Für den zur Therapie von CML und AML zugelassenen Tyrosinkinaseinhibitor (TKI) Dasatinib (Handelsname Sprycel®), für den unter anderem SFKs die Hauptziele darstellen, wurden, neben der antitumoralen Wirkung, sowohl immunsuppressive als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. Aus diesem Grund könnte Dasatinib ein für die Modulation von Immunantworten sehr interessantes Hilfsmittel darstellen. In der vorliegenden Arbeit werden die hemmenden und fördernden Einflüsse von Dasatinib auf zwei Typen von Immunzellen genauer untersucht, um so die Auswirkungen einer Dasatinib-Behandlung auf Zellen des Immunsystems besser zu verstehen und sich das immunmodulatorische Potenzial von Dasatinib besser nutzbar machen zu können. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung möglicher kombinatorischer Effekte zwischen Dasatinib und dem Glucocorticoid Dexamethason auf verschiedene Subsets von T-Zellen vor dem Hintergrund eines potentiellen Einsatzes der Kombination bei der allogenen Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) zur Separation von Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekten und der Graft-versus-host Disease (GvHD). Während keine kombinatorischen Effekte bei der Aktivierung von T-Zellen auftraten, ergaben sich bei der Untersuchung des Einflusses auf die Proliferation besonders in CD8+ T-Zellen additive Effekte durch die Kombination. Die Proliferation naiver T-Zell-Subsets wurde bereits durch die beiden Einzelsubstanzen alleine stark gehemmt. Dagegen waren Memory T-Zell-Subsets deutlich unempfindlicher, allerdings konnte durch eine Kombination von Dexamethason und Dasatinib auch die Proliferation dieser Memory Subsets effektiv gehemmt werden. Hierbei zeigten sich bei CD8+ Memory Subsets die deutlichsten synergistischen Effekte. Da eine Kombination in stärkerem Maße auch CD8+ gegenüber CD4+ Memory Subsets hemmt und diese Subsets unterschiedliche Rollen in der Induktion von GvL-Effekten und der Auslösung einer GvHD zu spielen scheinen, ist eine Steigerung der GvL-Effektivität durch die Medikamenten-Kombination bei gleichzeitiger Minimierung eines GvHD-Risikos in Zusammenhang mit anderen publizierten Ergebnissen durchaus denkbar. Weil eine starke Hemmung von virus-spezifischen T-Zellen nur bei sehr hohen Konzentrationen auftrat, ist zudem das Risiko einer Virus-Reaktivierung, die ein großes Problem bei einer HSCT darstellt, eher als gering einzuschätzen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Dasatinib auf aus Monozyten generierte Dendritische Zellen (moDCs) mit einem Fokus auf der Beeinflussung ihrer Migration. Während eine Behandlung mit Dasatinib nur sehr geringe Auswirkungen auf die Ausreifung der moDCs und die Expression von kostimulatorischen Molekülen hatte, führte eine Dasatinib-Behandlung zu einer Zeit- und Dosis-abhängigen Verringerung der Zytokinsekretion (IL-10 und IL-12). Im Gegensatz dazu hatte Dasatinib keinen Einfluss auf die phagozytotische Aktivität der moDCs und auf ihre Fähigkeit, Virus-spezifische T-Zell-Antworten auszulösen. Dasatinib zeigte dagegen einen deutlich steigernden Einfluss auf die Migration von moDCs gegen einen CCL19-Gradienten im Transwell-Assay, ohne die Expression des CCL19-Rezeptors CCR7 zu beeinflussen. Da ähnliche Migrations-steigernde Effekte auch bei einer Behandlung mit dem spezifischen SFK-Inhibitor SKI-1 auftraten, eine Behandlung mit Nilotinib, einem TKI der nicht auf SFKs wirkt, im Gegensatz dazu aber zu einer Hemmung der Migration führte, liegt es nahe dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über SFKs vermittelt wird. Dasatinib führte zu einer deutlichen Inhibierung der Phosphorylierung der inhibitorischen Immunrezeptoren Siglec-9 und Siglec-3 (CD33) ohne ihre Expressionslevel zu beeinflussen. Eine mit spezifischen Antikörpern durchgeführte Blockierung dieser Immunrezeptoren, deren ITIM-Domänen mutmaßlich von SFKs phosphoryliert werden, hatte eine deutliche Steigerung der Migration und eine verringerte Phosphorylierung von Siglec-9, Siglec-3 und SHP-2 zur Folge. Letztere ist eine Phosphatase, die nach Bindung an phosphorylierte ITIM-Domänen von Rezeptoren wie den Siglecs verschiedene Zielmoleküle dephosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über eine Hemmung von SFKs und daraus resultierend auf dem Wegfall eines inhibitorischen Signalwegs erfolgt. Diese Steigerung der Migration könnte in der Tumor-Therapie von großem Nutzen sein, da bei einer Vakzinierung mit autologen DCs, die mit Tumor-assoziierten Antigenen stimuliert wurden, die schlechte Einwanderung in die Lymphknoten eines der Hauptprobleme darstellt. Zur Überwindung dieses Problems könnte Dasatinib ein sehr effektives Hilfsmittel darstellen und die Therapie-Effizienz deutlich verbessern. Da Dasatinib aber auch eine ganze Reihe weiterer, sehr vielfältiger Einflüsse auf alle Arten von Immunzellen ausübt, scheint eine Verwendung spezifischer blockierender α-Siglec-Antikörper auf Grund geringerer Nebenwirkungen im Vergleich zu Dasatinib möglicherweise sogar noch deutlich besser geeignet zu sein, das Migrationsverhaltens Dendritischer Zellen positiv zu beeinflussen. Die Verwendung gegen Siglec-Rezeptoren gerichteter Antikörper als Adjuvantien könnte somit zu einem erfolgreicheren Einsatz der Vakzination mit Dendritischen Zellen in der Tumor-Therapie führen. / SRC-family kinases (SFKs) are involved in growth and metastasis of tumor and leukemic cells as well as in manifold signaling pathways at prominent position in all types of immune cells. Inhibition of SFKs thereby represents a promising tool for the therapy of malignant diseases but can also be used quite effectively for immunomodulation. Besides its antitumoral activity, immune-suppressive as well as immune-stimulatory effects have been described for the tyrosine kinase inhibitor (TKI) dasatinib (trademark Sprycel®) which is approved for the treatment of CML and AML. Therefore the use of dasatinib could be a very interesting method for the modulation of immune responses. The present paper aimes to scrutinize the inhibitory and promoting effects of dasatinib on two types of immune cells to gain a better insight into the consequences of a dasatinib treatment in immune cells and to take advantage of the immunomodulatory potential of dasatinib. The first part of the paper deals with the investigation of potential combinatory effects between dasatinib and the glucocorticoid dexamethasone on various T cell subsets in the context of a potential use of the combination in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to dissect Graft-versus-leukemia (GvL) effects and Graft-versus-host Disease. While no combinatory effects regarding T cell activation occurred, the investigation of the influence on T cell proliferation revealed significant additive effects of the combination especially in CD8+ T cells. The proliferation of naïve T cell subsets was inhibited already by use of the single agents. In contrast, memory T cell subsets proved to be much more insensitive, but their proliferation was effectively hampered by a combination of dasatinib and dexamethasone whereas the most pronounced synergistic effects occurred in CD8+ memory subsets. Since the combination more potently inhibits also CD8+ in comparison to CD4+ Memory subsets and since these subsets seem to fulfill diverging roles in mediation of GvL effects and induction of GvHD, an increase in GvL efficacy by the drug combination while concurrently reducing the risk of a GvHD is conceivable, especially when including other published results. Moreover, as a potent inhibition of virus-specific T cells only occurred at very high concentrations, the risk of viral reactivations, which represent a major problem with HSCT, could be considered as rather marginal. The second part of the paper addresses the influence of dasatinib on monocyte-derived dendritic cells (moDCs) with a special focus on its influence on their migration. While dasatinib treatment exhibited only negligible effects on moDCs’ maturation and expression of costimulatory molecules, dasatinib led to a time- and dose-dependent reduction in cytokine secretion (IL-10 and IL-12). In contrast, dasatinib had no influence on phagocytotic activity of moDCs and on their ability to induce virus-specific T cell responses. Notably Dasatinib had a pronounced beneficial effect on migration of moDCs towards a CCL-19 gradient in a transwell assay without altering the expression of the CCL19 receptor CCR7. Since comparable migration-enhancing effects also occurred in presence of the specific SFK-inhibitor SKI-1 while the use of nilotinib, a TKI not inhibiting SFKs, in contrast led to an inhibition of migration, it can be assumed that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via an inhibition of SFKs. Dasatinib treatment led to a dramatic decrease in phosphorylation of the inhibitory immunoreceptors Siglec-9 and Siglec-3 (CD33) without altering their expression levels. The use of specific antibodies for blocking of these immunoreceptors, whose ITIM domains are thought to be phosphorylated by SFKs, led to a powerful increase in migration and diminished phosphorylation of Siglec-9, Siglec-3 and SHP-2. The latter is a phosphatase which dephosphorylates target molecules after binding phosphorylated ITIM domains of receptors like the Siglecs. This paper’s results suggest that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via inhibition of SFKs resulting in omission of an inhibitory signaling pathway. This enhancement of migratory capacity could be very useful in anti-tumor therapy as limited migration to the lymph nodes is one of the major problems when vaccinating with autologous dendritic cells that were stimulated with tumor-associated antigens. Dasatinib could be a potent mediator to overcome this problem and could lead to an improvement in the efficacy of therapy. Since dasatinib in addition also affects a broad range of processes in all immune cells, the use of specific α-Siglec blocking antibodies seems to be the more appropriate attempt to positively influence the migratory behavior of dendritic cells due to fewer side effects in comparison to dasatinib. Utilization of antibodies that target siglec receptors as adjuvants could lead to a more successful use of a vaccination with dendritic cells in tumor therapy.

6. ZUSAMMENFASSUNG Charakterisierung b-adrenerger Rezeptoren auf Pferdelymphozyten und deren Regulation unter dem Einfluß von Clenbuterol und Dexamethason Getu Abraham Institut für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig, Deutschland Juni, 2001 86 S., 205 Lit., 7 Tab., 23 Abb. Über Vorkommen und Eigenschaften von b-Adrenozeptoren auf Pferdelymphozyten und ihre pharmakologische Regulation liegen bisher keine Untersuchungen vor. Mit der vorliegenden Arbeit sollten b-adrenerge Rezeptoren an intakten Pferdelymphozyten in Bindungsstudien mit dem Radioliganden (-)-(125I)-Iodocyanopindolol (ICYP), einem potenten b2-selektiven Adrenozeptorenantagonisten, charakterisiert und deren funktionelle Ansprechbarkeit durch Messung des Isoprenalin-induzierten Anstiegs des intrazellulären cAMP-Gehaltes mittels Radioimmunoassay bestimmt werden. Die Bindung von ICYP an intakten Pferdelymphozyten war schnell, sättigbar (maximale Anzahl der Bindungsstellen 320 ± 20 ICYP Bindungsstellen/Zelle, Mittelwert±SEM, n = 12) ) und hochaffin (KD-Wert für ICYP 14,37 ± 1,66 pmol/l, Mittelwert±SEM, n = 12). Verdrängungsexperimente mit Agonisten und Antagonisten zeigten eine Affinität und Stereoselektivität, wie sie bei b-Adrenozeptoren zu erwarten waren. Der nicht radioaktiv markierte b2-selektive Adrenozeptorantagonist ICI 118,551 verdrängte den Radioliganden ICYP aus seiner Bindung mit mehr als 1500fach höherer Affinität als der nicht radioaktiv markierte b1-selektive Adrenozeptorantagonist CGP 20712A. In Pferdelymphozyten können somit mehr als 90 % der b-Adrenozeptoren dem b2-Subtyp zugeordnet werden. Ein Anteil von weniger als 10 % an b1-Adrenozeptoren kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Die Bindungsstellen waren stereospezifisch, da das biologisch aktive (-)-Propranolol die Bindung von ICYP mit 40fach höherer Affinität verdrängte als (+)-Propranolol. b-adrenerge Agonisten verdrängten ICYP aus seiner spezifischen Bindung in der Rangfolge ihrer pharmakologischen Wirkungstärke, die typisch für den b2-Subtyp des Adrenozeptors ist: (-)-Isoprenalin > (-)-Adrenalin > (-)-Noradrenalin. Eine ähnliche Rangfolge wurde auch für die Agonist-induzierte cAMP-Bildung in Lymphozyten festgestellt. Aufgrund der dargestellten Befunde kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß ICYP ein geeigneter Radioligand ist, um b-adrenerge Rezeptoren an Pferdelymphozyten zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Bindung von ICYP an intakte Lymphozyten stellt somit ein geeignetes Modell dar, um wichtige Informationen über die Funktion und Regulation des b-adrenergen Systems beim Pferd sowohl unter physiologischen (pathophysiologischen) Bedingungen als auch über Arzneimittel-induzierte Veränderungen in vivo zu gewinnen. Ausgehend von den beschriebenen Grundlagenuntersuchungen wurden in einer weiteren Versuchsreihe bei zwölf klinisch gesunden Pferden der Einfluß von Clenbuterol und Dexamethason lymphozytäre b2-Adrenozeptoren, hinsichtlich ihrer Dichte, ihrer Affinität zum Radioliganden und ihrer cAMP-Bildung (als Maß für die funktionelle Ansprechbarkeit der b2-Adrenozeptoren bestimmt über Stimulation durch 10 µmol/l Isoprenalin) untersucht. Während der 12tägigen Clenbuterolbehandlung (2 Ž 0,8 µg/kg/Tag, i. v.) fielen die Anzahl der b2-Adrenozeptoren an Lymphozyten und der durch (-)-Isoprenalin-induzierte Anstieg des intrazellulären cAMP-Gehaltes signifikant (p < 0,05, n = 8) unter die Ausgangswerte unbehandelter Tiere ab. Clenbuterol bewirkte in der therapeutischen Dosis bereits 48 Stunden nach der Behandlung einen Abfall der Anzahl der b2-Adrenozeptoren bzw. der cAMP-Bildung um etwa 30 - 40 %. Während der restlichen Behandlungsdauer unter Clenbuterol blieb die Rezeptorendichte auf diesem niedrigen Niveau. Bei einer weiteren Versuchsgruppe wurde der Effekt des Glukokortikoids Dexamethason auf die Clenbuterol-induzierte Desensibilisierung von b2-Adrenozeptoren untersucht. Dexamethasonverabreichung (1 Ž 0,1mg/kg/d, i. v.) unmittelbar nach der letzten Clenbuteroldosis über 5 Tage beschleunigte die Wiederherstellung der down-regulierten Anzahl der lymphozytären b2-Adrenozeptoren und des Isoprenalin-induzierten Anstiegs des intrazellulären cAMP-Gehaltes (p < 0,05, n = 4). Schon 24 Stunden nach der ersten Dexamethasongabe waren beide Parameter von den Durchschnittswerten am Tag vor Behandlungsbeginn statistisch nicht zu unterscheiden. Die Anzahl der lymphozytären b2-Adrenozeptoren stieg sogar ab dem dritten Tag der Dexamethasonbehandlung bis auf das Doppelte bei unbehandelten Tiere an. Nach dem Absetzen der Dexamethasonbehandlung kam es zu einer langsam Abnahme der Rezeptorendichte und ihrer Ansprechbarkeit, wobei die vor der Clenbuterolbehandlung gemessenen Werte erst nach 4 Tagen erreicht wurden. Bei gleichzeitiger Behandlung der Tiere mit Clenbuterol und Dexamethason konnte durch das Glukokortikoid die Clenbuterol-induzierte Abnahme der b2-Adrenozeptorendichte und deren Ansprechbarkeit vollständig verhindert werden. Weder durch die Clenbuterol-abhängige Down-Regulation noch durch die Dexamethason-bedingte Hochregulation kam es zu signifikanten Veränderungen der Dissoziationskonstante (KD) und somit der Affinität von ICYP zu b2-Adrenozeptoren. Die Ergebnisse zeigen, daß es unter Behandlung mit Clenbuterol zu einer schnell einsetzenden, umfangreichen Down-Regulation der b2-Adrenozeptorendichte an Lymphozyten des Pferdes kommt und daß diese Toleranzentwicklung durch Glukokortikoide vollständig wieder aufgehoben oder verhindert werden kann. Zur Therapie der COB von Pferden scheint somit die kombinierte Anwendung von b2-Mimetika und Glukokortikoiden von Vorteil zu sein. / 7. Summary Characterization of b-adrenergic Receptors on Equine Lymphocytes and their Regulation under the Influence of Clenbuterol and Dexamethasone Getu Abraham Institute of Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig, Germany June, 2001 86 pp., 205 ref., 7 tab., 23 fig. b-Adrenoceptors and their regulation by pharmacological active substances have not yet been characterized in equine lymphocytes. In this study, b-adrenoceptors were identified and subclassified by (-)-[125I]-iodocyanopindolol (ICYP) binding, a potent b2-adrenergic antagonist, as well as by their isoprenaline-induced responsiveness using radioimmunoassay in intact viable equine lymphocytes. The specific ICYP binding was rapid, saturable (maximum number of binding sites 320 ± 20 ICYP binding sites/cell, means±SEM, n = 12) and of high affinity (KD-value for ICYP 14.37 ± 1.66 pmol/l, means±SEM, n = 12). The competition binding studies with agonists and antagonists showed the affinity and stereoselectivity to be expected for b-adrenergic receptors. The unlabelled selective b2-adrenoceptor antagonist ICI 118,551 was about 1500 times more potent in inhibiting ICYP binding than was the b1-selective adrenoceptor antagonist CGP 20712A. It is, therefore, concluded that in intact equine lymphocytes ICYP labels a class of functional b-adrenoceptors, that belong predominantly (> 90 %) to the b2-adrenoceptor subtype. A minor (< 10 %) b1-adrenoceptor component, however, cannot be completely ruled out. The binding sites were stereoselective, as the (-)-isomer of propranolol was about 40 times more potent to inhibit ICYP binding than was the (+)-isomer. Agonists competed for specific binding with a rank order of potency (-)-isoprenaline > (-)-adrenaline > (-)-noradrenaline, which is typical for a b2-subtype of adrenergic receptor; the same order of potency was obtained for agonist-induced stimulation of lymphocyte cyclic AMP content. Thus, it can be concluded that ICYP is a promising compound for the reliable determination of the binding characteristics of b-adrenoceptors of equine lymphocytes and besides that, this might give an insight in providing physiologically significant information about the regulation of the b-adrenergic receptor system. Based upon this study, we further investigated, in 12 healthy thoroughbred horses, the effects of the b2-agonist clenbuterol and the glucocorticoid dexamethasone on the lymphocyte b2-adrenenergic receptor density and affinity as well as on its responsiveness (assessed by lymphocyte cyclic AMP responses to 10 µmol/l (-)-isoprenaline). Clenbuterol (2Ž0.8µg/kg/d, i. v. for 12 days) decreased ICYP binding sites only 48 h after application by ~30-40 %; concomitantly, lymphocyte cAMP response to (-)-isoprenaline was significantly reduced (p < 0.05, n = 8). The values remained at these low levels throughout the following 10 days of treatment. After withdrawal of clenbuterol the density and responsiveness of b2-adrenoceptors gradually increased, reaching pre-drug levels after 4 days. Next the effects of dexamethasone on clenbuterol-induced desensitisation were studied. Administration of dexamethasone (1Ž0.1mg/kg/d, i. v. for five days) immediately after clenbuterol withdrawal accelerated b2-adrenergic receptor recovery (p < 0.05, n = 4): only 24 hours after administration dexamethasone restored the number of binding sites and cAMP response to (-)-isoprenaline to levels statistically indistinguishable from the values before starting clenbuterol treatment. Three days after dexamethasone administration the density of lymphocyte b2-adrenoceptors was further increased about two fold the pre-treatment values, and this increase declined gradually after dexamethasone withdrawal, reaching baseline values after 4 days. Furthermore, in groups simultaneously exposed to both drugs dexamethasone completely prevented clenbuterol-induced decrease in lymphocyte b2-adrenoceptor density and responsiveness. No significant change was observed in the dissociation constant and, thus, in the affinity of ICYP to b-adrenoceptors remained unchanged during or after treatment with either clenbuterol or dexamethasone. It is concluded that dexamethasone (glucocorticoids) can reverse and prevent clenbuterol-induced down-regulation of the lymphocyte b2-adrenoceptors and thus, a combined therapy with clenbuterol and dexamethasone may be potentially beneficial in COPD of horses.

Ulm, Univ., Diss., 2003.