Οι μικροσωληνίσκοι της μιτωτικής ατράκτου είναι υπεύθυνοι για τον αποχωρισμό των αδελφών χρωματιδίων κατά την Ανάφαση. Τροποποίηση ή καταστολή της δυναμικής του δικτύου των μικροσωληνίσκων συνεπάγεται αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης μέσω ενεργοποίησης του σημείου ελέγχου της Μίτωσης. Έτσι, ενώσεις που προσδένονται στο μόριο της β-τουμπουλίνης και σταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους, όπως το paclitaxel και η griseofulvin, ή τους αποσταθεροποιούν, όπως η nocodazole, αποτελούν αποτελεσματικά φάρμακα έναντι του καρκίνου, αλλά και άλλων ασθενειών. Η πρόσδεση των φαρμάκων στους μικροσωληνίσκους έχει ως αποτέλεσμα, την αναστολή της αλληλεπίδρασης μικροσωληνίσκων-κινητοχώρου, βλάβες στη λειτουργία της μιτωτικής ατράκτου και ανώμαλο χρωμοσωματικό αποχωρισμό, με συνέπεια την εμφάνιση ανευπλοειδικών κυττάρων. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η συγκριτική διερεύνηση της ανευπλοειδογόνου δράσης των φαρμακευτικών ενώσεων nocodazole, paclitaxel και griseofulvin σε τρία κυτταρικά συστήματα in vitro: στους μυοβλάστες ποντικού C2C12, στους ινοβλάστες ανθρώπου HFFF2 και στα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπου MCF-7. Η συγκριτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη μελέτη επαγωγής μικροπυρήνων και του μηχανισμού προέλευσης τους, μέσω της διπλής ανοσοσήμανσης πρωτεϊνών του κινητοχώρου (CREST) και του δικτύου του κυτταροσκελετού (α- τουμπουλίνη). Ακολούθησε μελέτη της ακεραιότητας της μιτωτικής συσκευής, μέσω συνδυασμένης ανοσοσήμανσης πρωτεϊνών του κεντροσώματος (γ- τουμπουλίνη & Aurora A) και του δικτύου των μικροσωληνίσκων (β- τουμπουλίνη). Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο χρωμοσωματικό αποχωρισμό, όπως οι Aurora A, β- και γ-τουμπουλίνη, μέσω της μεθόδου της ανοσοαποτύπωσης (Western Blot Analysis). Με την ολοκλήρωση της μελέτης παρατηρείται ότι και οι τρεις χημικές ενώσεις: επάγουν το φαινόμενο της χρωμοσωματικής καθυστέρησης, κατάσταση που υποδηλώνει την ύπαρξη ολόκληρου χρωμοσώματος, με αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων με κινητοχώρο στο εσωτερικό τους και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Επίσης, προκαλούν αύξηση του ποσοστού πολυπύρηνων μεσοφασικών κυττάρων και στα τρία κυτταρικά συστήματα. Προκαλούν αύξηση του μιτωτικού δείκτη και συσσώρευση των κυττάρων στο στάδιο της Μετάφασης στα κύτταρα C2C12, HFFF2 και MCF-7. Η συσσώρευση αυτή συνοδεύεται με ταυτόχρονη μείωση των Ανατελοφάσεων. Αποδιοργανώνουν, ακόμα, το δίκτυο των μικροσωληνίσκων, τόσο στα μεσοφασικά όσο και στα μιτωτικά κύτταρα. Ειδικότερα, η nocodazole επάγει την αύξηση του ποσοστού μεσοφασικών κυττάρων με πολύ συμπυκνωμένο δίκτυο και κατεστραμμένο (στικτό) γενετικό υλικό στα κύτταρα ποντικού C2C12. Επίσης, και οι τρεις ενώσεις επηρεάζουν τον κεντροσωματικό πολλαπλασιασμό, με την εμφάνιση ανώμαλων Μεταφάσεων και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Η nocodazole επάγει το σχηματισμό μονοπολικών Μεταφάσεων, αντίθετα το paclitaxel σχηματίζει πολυπολικές Μεταφάσεις. Η griseofulvin παρουσιάζει κυτταρική εξειδίκευση με την πρόκληση μονοπολικών Μεταφάσεων στα κύτταρα C2C12, πολυπολικών Μεταφάσεων στα καρκινικά κύτταρα MCF-7 και κατά πλειονότητα μη-ομαδοποιημένων Μεταφάσεων στα κύτταρα HFFF2. Οι εν λόγω μελετηθείσες χημικές ενώσεις τροποποιούν επίσης την έκφραση των πρωτεϊνών Aurora A, β- & γ-τουμπουλίνης και στα τρία κυτταρικά συστήματα. Κύριο χαρακτηριστικό της δράσης της nocodazole είναι η μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών Aurora A και β-τουμπουλίνης. Αντίθετα το paclitaxel και η griseofulvin οδηγούν σε υπερέκφραση των Aurora A, β- και γ-τουμπουλίνη. Και οι τρεις φαρμακευτικές ενώσεις παρουσιάζουν κυτταρική εξειδίκευση ως προς τον επηρεασμό της έκφρασης των πρωτεϊνών που μελετήθηκαν. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν τη συμμετοχή των τριών πρωτεϊνών στην εκδήλωση της ανευπλοειδογόνου δράσης των τριών χημικών ενώσεων. Τα παραπάνω συμπεράσματα επιβεβαιώνουν και ερμηνεύουν την ανευπλοειδογόνο δράση των φαρμακευτικών ενώσεων, nocodazole, paclitaxel και griseofulvin. / The microtubules of the mitotic apparatus are responsible for the chromosome segregation during Anaphase. Modification or inhibition of the dynamics of the microtubules results to the activation of the mitotic checkpoint. Chemicals that bind at the molecule of β-tubulin and stabilize microtubules, like paclitaxel and griseofulvin or destabilize them, like nocodazole, act as drugs against cancer or other diseases. This binding results to the inhibition of microtubule-kinetochore interactions, damage of the organization of the mitotic spindle, abnormal chromosome segregation and thus the generation of aneuploid cells. In the present study we comparatively investigated the aneugenic potential of three chemical compounds, nocodazole, paclitaxel and griseofulvin in three cell lines in vitro: C2C12 mouse fibroblasts, HFFF2 human myoblasts and MCF-7 human epithelial cancer cells. The comparative analysis was established by three different experimental procedures. The study of micronucleus induction and their generation mechanism was accomplished by CREST analysis in combination with immunostaining of α- tubulin. The ability of the chemicals to affect the organization of mitotic apparatus was investigated by double immunofluorescence of microtubule network (β-tubulin) and centrosomes (γ-tubulin & Aurora A) in all cell lines. Finally, to understand further the mechanisms by which nocodazole, paclitaxel and griseofulvin exert their aneugenic potential, we examined the ability of these compounds to modulate the expression of proteins that participate in chromosome segregation, such as Aurora A, β- and γ-tubulin, by Western blot analysis in C2C12, HFFF2 and MCF-7 cells. Our results revealed that the three chemical compounds:  Induce chromosome delay, showing a high frequency of micronuclei with kinetochore, indicating the presence of intact chromosome in every studied cell line. In addition, all the drugs evoke induction of multinucleated cells in all cell lines.  Increase the mitotic index with simultaneous Metaphase arrest. The cell accumulation at the Metaphase is accompanied with reduction of Anatelophases in all cell lines.  Promote disorganization of the microtubule network. Especially, nocodazole causes induction of abnormal interphase cells with very condensed network (bundled cells) and punctuated genetic material in C2C12 mouse cell line.  Affect the centrosome proliferation, increasing the frequency of abnormal Metaphases in the three cell lines. Nocodazole induces high frequency of monopolar Metaphases, whereas paclitaxel generates polypolar Metaphases. Griseofulvin produces monopolar Metaphases in C2C12 cells, polypolar Metaphases in cancer MCF-7 cells and mainly non-congressed Metaphases in HFFF2 cells, exhibiting cell specificity.  Modify the expression of the proteins Aurora A, β- and γ-tubulin in all cell lines. Nocodazole reduces Aurora’s A expression in C2C12, HFFF2 and MCF-7 cell lines. The same is observed for β- tubulin’s expression, as for C2C12 and MCF-7 cells. Paclitaxel exerts its aneugenic potential by enhancing the expression of Aurora A and γ-tubulin in all cell lines, whereas enhancing β- tubulin’s expression is only noticed in C2C12 and MCF-7 cells. Griseofulvin increases the expression of Aurora A and β-tubulin in human cancer cells MCF-7. As for γ-tubulin’s expression, is elevated only in the human cell lines HFFF2 and MCF-7. Thus, we suggest that the activity of the pharmaceutical compounds on the expression of the above proteins, exhibit cell specificity. These findings implicate that the aneugenic potential of the studied drugs is mediated through changes in the expression of these proteins. The conclusions above confirm and explain the aneugenic potential of the pharmaceutical compounds, nocodazole, paclitaxel and griseofulvin.

- / -

Η ακεραιότητα και η λειτουργία της μιτωτικής συσκευής διαδραματίζει ουσιώδη ρόλο για τον ορθό προσανατολισμό και την ολίσθηση των χρωμοσωμάτων στους πόλους της ατράκτου, οδηγώντας στον ισομερή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά τη μιτωτική ή μειωτική διαίρεση. Τροποποιήσεις του δικτύου των μικροσωληνίσκων (α- και β-τουμπουλίνη) και των κέντρων οργάνωσης αυτών (ΜΤΟC, γ-τουμπουλίνη) είναι δυνατόν να προκαλέσουν βλάβες στη μιτωτική συσκευή, διαταράσσοντας το χρωμοσωματικό αποχωρισμό, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ανευπλοειδικών κυττάρων. Η διουρητική φαρμακευτική ένωση υδροχλωροθειαζίδιο (HCTZ) χορηγείται κατά της υπέρτασης και είναι γνωστό ότι προκαλεί μη αποχωρισμό σε διπλοειδή στελέχη του μύκητα Aspergillus nidulans. Πρόσφατες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι επάγει αυξημένες συχνότητες μικροπυρήνων και διαταράσσει το χρωμοσωματικό αποχωρισμό σε καλλιέργειες ανθρωπίνων λεμφοκυττάρων in vitro. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση του HCTZ στην οργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων κατά τη μεσόφαση και τη μίτωση, με συνδυασμένη εφαρμογή μεθόδων διπλής ανοσοσήμανσης των πρωτεϊνών των μικροσωληνίσκων, του κεντροσώματος και του κινητοχώρου. Εφαρμόστηκε επίσης in situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα (FISH), με α-satellite πανκεντρομερικό ανιχνευτή, για τον εντοπισμό μη ενσωματωμένου (lagging) χρωμοσωματικού υλικού. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικές σειρές μυός C2C12 και ανθρώπου HFFF2. Παρατηρήθηκε ότι το HCTZ προκαλεί μείωση του ρυθμού διαίρεσης, αποδιοργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων και αυξημένη συχνότητα ανώμαλων μεταφάσεων με ποικίλο αριθμό σημάτων γ-τουμπουλίνης. Αυξάνει το ποσοστό των μεταφάσεων και μειώνει το ποσοστό των ανα-τελοφάσεων, προκαλώντας συσσώρευση των κυττάρων στο στάδιο της μετάφασης. Επίσης, επάγει τη χρωμοσωματική καθυστέρηση, καθώς αυξάνει τη συχνότητα των μικροπυρήνων που παρουσιάζουν τόσο σήμα κινητοχώρου όσο και σήμα κεντρομέρους. Η γενετική δράση του στα κύτταρα C2C12 δε φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά από τη χρονική διάρκεια έκθεσης των κυττάρων σ’ αυτό. Από τις δυο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν φαίνεται ότι τα κύτταρα C2C12 είναι περισσότερο ευαίσθητα στην απόκριση στο HCTZ. Τα αποτελέσματα μας, υποδεικνύουν ανευπλοειδογόνο δράση της φαρμακευτικής ένωσης, επιβεβαιώνοντας και ενισχύοντας προηγούμενα ευρήματα της ερευνητικής μας ομάδας. / The integrity and function of mitotic apparatus play essential role for the equitable orientation and the slipping of chromosomes to the spindle poles, indicating normal distribution of chromosomes during mitotic or meiotic division. Modifications of the microtubule network (α- and β- tubulin) and microtubule-organizing centers (MTOC, γ- tubulin) may cause severe damage to the mitotic apparatus, disturbing the segregation of chromosomes and resulting to aneuploid cells. The diuretic drug hydrochlorothiazide (HCTZ) is used for the treatment of hypertension and has been found to induce non-disjunction in diploid strains of Aspergillus nidulans. Recent studies of our team have shown that HCTZ produces increased frequencies of micronuclei and disturbs chromosome segregation in human lymphocytes cultures treated in vitro. In the present study was investigated the effect of HCTZ on the organization of the microtubule network during mesophase and mitosis, with combined application of double immunofluorescence staining assay, for the visualization of microtubules, centrosomes and kinetochore proteins. Fluorescence in situ hybridization (FISH), with α-satellite pancentromeric probe, was also applied, for the localization of not integrated (lagging) nuclear material. The study was realized in C2C12 mouse cells and HFFF2 human cells. Our results revealed that HCTZ causes decrease of the cell division rate, disorganization of the microtubule network and increased frequency of abnormal metaphases with various γ-tubulin signals. HCTZ increases the percentage of metaphases and decreases the percentage of ana-telophases, indicating a metaphase arrest. Also, induces chromosome delay, as was shown from the high frequency of micronuclei that presents kinetochore and centromere signal. The genetic activity of HCTZ in C2C12 cells does not appear to be significantly influenced by the duration of the cell’s exposure time to the drug. It appears that C2C12 mouse cells are more sensitive in their response to the HCTZ. These results indicate aneugenic activity of this drug, confirming and enhancing our previous findings.

Οι υπερίτες του αζώτου (nitrogen mustards) συνιστούν μία αποτελεσματική ομάδα φαρμάκων που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατα ευρήματα της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι οι υπερίτες του αζώτου μελφαλάνη (MEL), χλωραμπουκίλη (CAB) και ο δραστικός της μεταβολίτης, το PHE, επιδεικνύουν ισχυρή θραυσματογόνο δράση, αλλά επιπρόσθετα, εμφανίζουν ανευπλοειδογόνο δράση, διαταράσσοντας το χρωμοσωματικό αποχωρισμό μέσω τροποποιήσεων της δομής και λειτουργίας της μιτωτικής συσκευής. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήθηκε περαιτέρω ο μηχανισμός της ανευπλοειδογόνου δράσης των παραπάνω δραστικών ενώσεων και πραγματοποιήθηκε σύγκριση της γενετικής δράσης δύο νέων στεροειδών αναλόγων του PHE, τα ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 με αυτήν των MEL, CAB και PHE. Τα στεροειδή ανάλογα σχεδιάστηκαν με στόχο την αύξηση της εκλεκτικότητας της αντινεοπλασματικής δράσης. Η ικανότητα των MEL, CAB και PHE να προκαλούν φαινόμενα χρωμοσωματικής καθυστέρησης μελετήθηκε σε σύγκριση με τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα in vitro με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN) σε συνδυασμό με τη μέθοδο FISH και τη χρήση πανκεντρομερικού ανιχνευτή. Επιβεβαιώθηκε η θραυσματογόνος και ανευπλοειδογόνος δράση των ενώσεων MEL, CAB και PHE, ενώ φάνηκε ότι τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 προκαλούν αποκλειστικά χρωμοσωματική θραύση. Το φαινόμενο της χρωμοσωματικής καθυστέρησης μελετήθηκε επίσης με τη μέθοδο CREST στην κυτταρική σειρά ποντικού C2C12. Με τη μέθοδο αυτή, επιβεβαιώθηκε η διπλή γενετική δράση των ενώσεων MEL, CAB και PHE. Τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 εμφανίστηκαν ως οι ηπιότεροι επαγωγείς ΜΝ και προκαλούν κυρίως χρωμοσωματική θραύση, ενώ ήπια ανευπλοειδογόνο δράση παρουσίασε μόνο το ανάλογο ΕΑ-92. Ακολούθως, εξετάσθηκε η ικανότητα των υπό εξέταση χημικών ενώσεων ΕΑ-92 και ΕΑ-97, να επηρεάζουν τη δομή και λειτουργία της μιτωτικής συσκευής σε σχέση με αυτήν των ενώσεων MEL, CAB, PHE, με διπλό ανοσοφθορισμό για τη β- και γ-τουμπουλίνη. Παρατηρήθηκε ότι όλες οι ενώσεις, εκτός από το στεροειδές ΕΑ-97 προκαλούν τη δημιουργία πολυπολικών μεταφάσεων, ενώ όλες οι ενώσεις επάγουν το σχηματισμό μεσοφασικών κυττάρων με ανώμαλο αριθμό κεντροσωμάτων. Όλες οι υπό εξέταση χημικές ενώσεις εμφανίζουν κυτταροτοξικότητα και καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων και στα κύτταρα ποντικού C2C12. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η ικανότητα των υπό εξέταση ενώσεων να επάγουν την απόπτωση και μελετήθηκε ο ρόλος της απόπτωσης στην εκδήλωση της γενετικής δράσης των ενώσεων MEL, CAB και PHE. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε στα κύτταρα C2C12 με τη μέθοδο της διπλής χρώσης Αννεξίνης V/Ιωδιούχου προπιδίου και το διπλό ανοσοφθορισμό β- και γ-τουμπουλίνης, ανεξάρτητα, σε κύτταρα ποντικού C2C12, παρουσία του γενικού αναστολέα της δράσης των κασπασών, Z-VAD-FMK, αλλά και αναστολέων της δράσης συγκεκριμένων κασπασών. Όλες οι υπό εξέταση ενώσεις επάγουν χαμηλά ποσοστά απόπτωσης. Οι κασπάσες-3, -6 και -8 συμμετέχουν στην επαγόμενη από τη MEL απόπτωση αλλά δεν συμμετέχουν στην απομάκρυνση των κυττάρων με μικροπυρήνες που επάγονται από τη δράση της ίδιας ένωσης. Η απόπτωση αποτελεί μηχανισμό απομάκρυνσης των κυττάρων με μικροπυρήνες και κανονικό κεντροσωματικό αριθμό που επάγονται από τις ενώσεις MEL, CAB και PHE. Αντίθετα, τα κύτταρα με υπεράριθμα κεντροσώματα, που προκύπτουν από τη δράση των παραπάνω ενώσεων δεν απομακρύνονται μέσω απόπτωσης. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο οι δραστικές ενώσεις MEL και CAB εκφράζουν τις ανευπλοειδογόνες ιδιότητες τους, μελετήθηκε η επίδραση τους στην έκφραση των πρωτεϊνών Aurora-B, survivin, Aurora-A και γ-τουμπουλίνη σε κύτταρα ποντικού C2C12, με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών. Παράλληλα μελετήθηκε η ένωση ΕΑ-97, η οποία σύμφωνα με τα ευρήματα μας, εμφάνισε αποκλειστικά θραυσματογόνο δράση. Οι ενώσεις MEL και CAB, εκδηλώνουν τις ανευπλοειδογόνες ιδιότητες τους προκαλώντας μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών Aurora-B και survivin και επάγοντας την αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Aurora-A. Επιπρόσθετα, η ένωση MEL, προκαλεί αύξηση της έκφρασης της γ-τουμπουλίνης. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν τη συμμετοχή των παραπάνω πρωτεϊνών στην εκδήλωση της ανευπλοειδογόνου δράσης των ενώσεων που μελετήθηκαν. Αντίθετα το στεροειδές ανάλογο ΕΑ-97 που εμφανίζει αποκλειστικά θραυσματογόνο δράση, δεν μεταβάλλει την έκφραση των παραπάνω πρωτεϊνών. / Nitrogen mustards represent an effective class of drugs that are used in chemotherapy. Recent findings of our group have shown that nitrogen mustard analogues, melphalan (MEL), chlorambucil (CAB) and PHE, in addition to their clastogenic activity, they exert their aneugenic potential by affecting chromosome segregation due to modifications of mitotic apparatus. In the present study, we investigated the mechanism by which the above compounds display their aneugenicity in comparison with two new steroidal analogues of PHE, EA-92 and EA-97, which were designed aiming at most effective antineoplasmatic activity. The ability of MEL, CAB and PHE to induce chromosome delay events was studied in comparison with the steroidal analogues EA-92 and EA-97. The mechanism of micronucleation was determined by Cytokinesis Block Micronucleus assay (CBMN assay) in combination with Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) using pancentromeric DNA probe. It was confirmed that MEL, CAB and PHE generated MNi by two mechanisms, chromosome breakage and chromosome delay, while EA-92 and EA-97 induced the formation of MN originated exclusively from chromosome breakage events. The ability of the tested compounds to induce chromosome delay was also investigated in C2C12 mouse cells by CREST analysis. The dual genetic activity of MEL, CAB, and PHE was confirmed in a different biological system. The analogues EA-92 and EA-97 appeared as weaker MN inducers and they induced mainly chromosome breakage, while a weak aneugenic activity was observed for EA-92. The ability of the nitrogen mustard analogues to affect the organization of mitotic apparatus was investigated in comparison with MEL, CAB and PHE by double immunofluorescence of β- and γ-tubulin in C2C12 mouse cells. It was observed that all compounds, except EA-97, induced mutlipolar metaphases, and also generated interphase cells with abnormal centrosome number. All compounds displayed increased cytotoxicity and they caused cell cycle delay in human lymphocyte cultures and in C2C12 mouse cells. The ability of the tested compounds to induce apoptosis was studied by Annexin V/PI assay. It was revealed that all compounds induced apoptosis. The effect of apoptosis on the genetic activity of MEL, CAB and PHE was investigated by inhibition of apoptosis in the presence of the inhibitor Z-VAD-FMK and the use of specific inhibitors for caspase -3, -6, -8 and -1. For this reason Annexin V/PI assay and double immunofluorescence of β- and γ-tubulin were performed, independently in C2C12 mouse cells. Caspases -3, -6 and -8 are involved in melphalan-induced apoptosis, but they are not involved in the elimination of cells in the presence of melphalan. Apoptosis is the responsible mechanism for the exclusion of cells with MNi and normal centrosome number that are induced by MEL, CAB and PHE. On the contrary, cells exerting supernumerary centrosomes are not eliminated by apoptosis in the presence of the above compounds. To further elucidate the mechanisms by which MEL and CAB exert their aneugenic potential, we examined the ability of the compounds to alter the expression of proteins having important role in chromosome segregation, such as the proteins Aurora-B, survivin, Aurora-A and γ-tubulin. The analysis was performed by Western blot method in C2C12 mouse cells. We also studied the steroid analogue EA-97, which according to our findings acts as a pure clastogen and do not exert aneugenic potential as opposed to MEL and CAB. MEL and CAB exert their aneugenic potential by the reduction of Aurora-B and survivin expression and by enhancing the expression of Aurora-A. γ-tubulin was upregulated in the presence of MEL. These findings show the implication of these proteins in chromosome delay events induced by MEL and CAB. On the other hand, the analogue EA-97 did not affect the expression of the above proteins.