Stress urinary incontinence (SUI) is a distressing condition characterised by urine leakage upon physical effort, coughing or sneezing and may affect up to half of adult women. Despite this there are no globally approved pharmacotherapies. A common approach is the targeting of lower urinary tract (LUT) α₁-adrenoceptors, which however can lead to unwanted increases in blood pressure and reflex bradycardia.

Η συσχέτιση της πρωτεΐνης PSP94 με τον καρκίνο του προστάτη είναι γνωστή, καθώς μειωμένα επίπεδα της PSP94 σχετίζονται με τα προχωρημένα, μεταστατικά στάδια καρκίνου του προστάτη, και υποτίθεται ότι η πλήρης έκφρασή της συμβάλλει στην αναχαίτιση της καρκινικής ανάπτυξης. Το PCK3145, ένα συνθετικό δεκαπενταμερές πεπτίδιο, του οποίου η αλληλουχία αμινοξέων είναι ταυτόσημο με την αλληλουχία των αμινοξέων 31 έως 45 της PSP94, επιλέχτηκε μεταξύ 12 διαφορετικών πεπτιδίων που προέκυψαν από την PSP94 καθώς εδείχθη οτι ανακεφαλαιώνει in vitro και in vivo τις λειτουργίες και ιδιότητες της PSP94, και άρα είναι ένα μόριο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην καταστολή της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, φαρμακοκινητικές μελέτες σε ζώα και ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, κατέδειξαν ταχεία κάθαρση και μικρό χρόνο ημιζωής. Προκειμένου να ενισχυθεί το φαρμακοκινητικό προφίλ του πεπτιδίου PCK3145 και ως εκ τούτου να βελτιωθεί η φαρμακοδυναμική του, υπέστη χημική τροποποίηση με προσθήκη πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG). Η πειραματική εργασία παρουσιάζει τα αποτελέσματα μιας συστηματικής μελέτης σχετικά με την επίδραση της πεγκυλίωσης στο PCK3145 συγκρίνοντας την πρωτεολυτική σταθερότητα και βιολογική δράση δύο πεγκυλιωμένων συζευγμάτων του με την καθαρή μορφή του. Για την ποσοτικοποίηση και για τα πειράματα σταθερότητας χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης HPLC αποτελούμενο από μια αντλία Ultimate (Dionex). Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός επιτεύχθηκε με μια στήλη ανάστροφης φάσης C18. Επετεύχθη για πρώτη φορά η ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας HPLC για τον προσδιορισμό των πεγκυλιωμένων αναλόγων με υψηλού βαθμού γραμμικότητα, ειδικότητα, επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα. Η πρωτεολυτική σταθερότητα των συζευγμάτων PEG σε ανθρώπινο πλάσμα προσδιορίστηκε με χρήση υγρής χρωματογραφίας HPLC και αποκαλύφθηκε μείωση του ποσοστού αποδόμησης και ενίσχυσξ της σταθερότητας του πεπτιδικών μορίων σε ανθρώπινο πλάσμα. H μελέτη επιβίωσης της κυτταρικής σειράς καρκίνου του προστάτη PC3 μετά την προσθήκη των πεπτιδικών μορίων υπό μελέτη υπολογίστηκε με τις μεθόδους ΜΤΤ και Trypan blue. 50% αναστολή της κυτταρικής αύξησης/μεταβολισμού επετεύχθη με τις συγκεντρώσεις των 10μg/ml και για τα τρία πεπτίδια. Ωστόσο, τα πεγκυλιωμένα ανάλογα επέφεραν ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση στην κυτταρική αύξηση σε μικρότερες δόσεις. Παρόμοια ενθαρρυντικά αποτελέσματα υπήρξαν και για την δράση των μορίων στη καρκινική σειρά του μαστού MCF-7. Τα αποτελέσματα της μελέτης συνοψίζονται στην ικανότητα της πεγκυλίωσης να βελτιώνει τη σταθερότητα του PCK3145 και έτσι να ενισχύει τη βιολογική του δράση. Μελλοντικά πειράματα θα αποσαφηνίσουν περισσότερο τόσο την δράση των μορίων σε καρκινικές σειρές πέραν του προστάτη αλλά και την φαρμακοκινητική συμπεριφορά των πεπτιδικών αναλόγων μέσω πειραμάτων in vivo της βιοκατανομής και μεταβολισμού τους. / PSP94, protein is known to have specific implications with prostate cancer where a down-regulation of PSP94 levels is associated with advanced metastatic prostate cancer and it is supposed that the full expression contributes to the inhibition of tumor growth. PCK3145 is a synthetic 15-mer peptide that matches the natural sequence of amino acids 31 to 45 of PSP94 and was selected from 12 other peptides derived from PSP94 as it exhibited the best in vitro and animal in vivo properties similar to PSP94. Thus, it is a molecule hat can be used to suppress the growth of prostate cancer.However pharmacokinetics studies in animals and in patients with prostate cancer showed rapid clearance and a short half-life. In order to alter the pharmacokinetic profile of the peptide, and thereby to improve its pharmacodynamic potential PCK3145 was chemically modified with polyethylene glycol (PEG).This experimental work presents the results of a systematic study on the influence of the PEGylation of PCK3145 peptides on the proteolytic stability and biological activity of these conjugates compared to the wild-type peptide. For the quantification and stability assays an HPLC system was used consisted of an Ultimate 3000 Pump (Dionex). Chromatographic separation was achieved on RP, C18 column. An HPLC method development for the determination of the PEG-peptide conjugates was assessed for the first time. A high degree of linearity, specificity as well as repeatability and reproducibility were also achieved. The proteolytic stability of the PEG-peptide conjugates in human plasma was assessed by HPLC chromatography, which revealed a significant decrease in the degradation. Proliferation of PC3 cancer cell line was measured using the MTT and Trypan blue test. A 50% inhibition of the cell metabolism/growth was achieved by the concentrations of 10 μg/ml of the three peptides. However, at lower concentrations stronger growth inhibitory effect was observed for the PEG-peptides. Similar encouraging results have also seen for the action of molecules in cancer cell lines MCF-7.The results of this study emphasize the ability of PEGylation to improve the stability of PCK3145 and thus to enhance the biological activity. Future experiments willi clarify more the action of molecules in cancer cell lines beyond the prostate and the pharmacokinetic behavour of peptide analogs through in vivo experiments of biodistribution and metabolism.

Η ακεραιότητα και η λειτουργία της μιτωτικής συσκευής διαδραματίζει ουσιώδη ρόλο για τον ορθό προσανατολισμό και την ολίσθηση των χρωμοσωμάτων στους πόλους της ατράκτου, οδηγώντας στον ισομερή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά τη μιτωτική ή μειωτική διαίρεση. Τροποποιήσεις του δικτύου των μικροσωληνίσκων (α- και β-τουμπουλίνη) και των κέντρων οργάνωσης αυτών (ΜΤΟC, γ-τουμπουλίνη) είναι δυνατόν να προκαλέσουν βλάβες στη μιτωτική συσκευή, διαταράσσοντας το χρωμοσωματικό αποχωρισμό, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ανευπλοειδικών κυττάρων. Η διουρητική φαρμακευτική ένωση υδροχλωροθειαζίδιο (HCTZ) χορηγείται κατά της υπέρτασης και είναι γνωστό ότι προκαλεί μη αποχωρισμό σε διπλοειδή στελέχη του μύκητα Aspergillus nidulans. Πρόσφατες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι επάγει αυξημένες συχνότητες μικροπυρήνων και διαταράσσει το χρωμοσωματικό αποχωρισμό σε καλλιέργειες ανθρωπίνων λεμφοκυττάρων in vitro. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση του HCTZ στην οργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων κατά τη μεσόφαση και τη μίτωση, με συνδυασμένη εφαρμογή μεθόδων διπλής ανοσοσήμανσης των πρωτεϊνών των μικροσωληνίσκων, του κεντροσώματος και του κινητοχώρου. Εφαρμόστηκε επίσης in situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα (FISH), με α-satellite πανκεντρομερικό ανιχνευτή, για τον εντοπισμό μη ενσωματωμένου (lagging) χρωμοσωματικού υλικού. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικές σειρές μυός C2C12 και ανθρώπου HFFF2. Παρατηρήθηκε ότι το HCTZ προκαλεί μείωση του ρυθμού διαίρεσης, αποδιοργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων και αυξημένη συχνότητα ανώμαλων μεταφάσεων με ποικίλο αριθμό σημάτων γ-τουμπουλίνης. Αυξάνει το ποσοστό των μεταφάσεων και μειώνει το ποσοστό των ανα-τελοφάσεων, προκαλώντας συσσώρευση των κυττάρων στο στάδιο της μετάφασης. Επίσης, επάγει τη χρωμοσωματική καθυστέρηση, καθώς αυξάνει τη συχνότητα των μικροπυρήνων που παρουσιάζουν τόσο σήμα κινητοχώρου όσο και σήμα κεντρομέρους. Η γενετική δράση του στα κύτταρα C2C12 δε φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά από τη χρονική διάρκεια έκθεσης των κυττάρων σ’ αυτό. Από τις δυο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν φαίνεται ότι τα κύτταρα C2C12 είναι περισσότερο ευαίσθητα στην απόκριση στο HCTZ. Τα αποτελέσματα μας, υποδεικνύουν ανευπλοειδογόνο δράση της φαρμακευτικής ένωσης, επιβεβαιώνοντας και ενισχύοντας προηγούμενα ευρήματα της ερευνητικής μας ομάδας. / The integrity and function of mitotic apparatus play essential role for the equitable orientation and the slipping of chromosomes to the spindle poles, indicating normal distribution of chromosomes during mitotic or meiotic division. Modifications of the microtubule network (α- and β- tubulin) and microtubule-organizing centers (MTOC, γ- tubulin) may cause severe damage to the mitotic apparatus, disturbing the segregation of chromosomes and resulting to aneuploid cells. The diuretic drug hydrochlorothiazide (HCTZ) is used for the treatment of hypertension and has been found to induce non-disjunction in diploid strains of Aspergillus nidulans. Recent studies of our team have shown that HCTZ produces increased frequencies of micronuclei and disturbs chromosome segregation in human lymphocytes cultures treated in vitro. In the present study was investigated the effect of HCTZ on the organization of the microtubule network during mesophase and mitosis, with combined application of double immunofluorescence staining assay, for the visualization of microtubules, centrosomes and kinetochore proteins. Fluorescence in situ hybridization (FISH), with α-satellite pancentromeric probe, was also applied, for the localization of not integrated (lagging) nuclear material. The study was realized in C2C12 mouse cells and HFFF2 human cells. Our results revealed that HCTZ causes decrease of the cell division rate, disorganization of the microtubule network and increased frequency of abnormal metaphases with various γ-tubulin signals. HCTZ increases the percentage of metaphases and decreases the percentage of ana-telophases, indicating a metaphase arrest. Also, induces chromosome delay, as was shown from the high frequency of micronuclei that presents kinetochore and centromere signal. The genetic activity of HCTZ in C2C12 cells does not appear to be significantly influenced by the duration of the cell’s exposure time to the drug. It appears that C2C12 mouse cells are more sensitive in their response to the HCTZ. These results indicate aneugenic activity of this drug, confirming and enhancing our previous findings.