Ο καρκίνος, αποτελεί στις μέρες μας μία από τις πιο συνήθεις ασθένειες καθότι προσβάλει ένα μεγάλο μέρος του παγκόσμιου πληθυσμού, ανεξαρτήτου ηλικίας και γι αυτό το λόγο, η θεραπεία του αποτελεί μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της επιστημονικής κοινότητας. Η χορήγηση διαφόρων φαρμάκων έως τώρα, για την αντιμετώπισή του, έχει σαν αποτέλεσμα την προσβολή τόσο των καρκινικών, όσο και των υγειών κυττάρων. Κατά συνέπεια, προκαλούνται ποικίλες παρενέργειες στον ανθρώπινο οργανισμό, ορισμένες πολύ σοβαρές που δεν επιτρέπουν την χορήγηση θεραπευτικών δόσεων. Η νανοτεχνολογία μπαίνει δυναμικά στη μάχη κατά του καρκίνου. Ο σχεδιασμός και η χρήση συστημάτων με μέγεθος στην νανοκλίμακα, προσφέρει νέους τρόπους για τον εντοπισμό, τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου από τα πρώτα κιόλας στάδια και με ελάχιστες παρενέργειες. Τα νανοσωματίδια μακράς κυκλοφορίας (stealth nanoparticles) παρέχουν ένα νέο τρόπο χορήγησης των αντικαρκινικών φαρμάκων, λειτουργώντας ως φορείς που εξαγγειώνονται στην περιοχή του όγκου, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο την εκλεκτική διάθεση του φαρμάκου που περιέχουν στα καρκινικά κύτταρα. Τα σωματίδια αυτά, έχουν την ικανότητα να τροποποιούνται κατάλληλα, ώστε να είναι βιοσυμβατά και να μπορούν να προσκολλούνται στα καρκινικά κύτταρα ή στο μικροπεριβάλλον τους, λειτουργώντας έτσι σαν φορείς στη στοχευμένη χορήγηση αντικαρκινικών φαρμάκων, μειώνοντας την τοξικότητα στους φυσιολογικούς ιστούς. Οι νανοφορείς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, εμφανίζουν σημαντικά προβλήματα, όπως δομική αστάθεια, δομική ετερογένεια και ελλειπή έλεγχο μεγέθους και σχήματος. Κατά συνέπεια, υπάρχει μία συνεχής ανάγκη ανάπτυξης νέων νανοφορέων ή βελτιστοποίηση των ήδη μελετημένων, προκειμένου να μπορούν να αξιοποιηθούν στην κλινική πράξη. Τα φουλλερένια (C60), έχουν κινήσει το ενδιαφέρον των επιστημόνων σε πολλούς τομείς της έρευνας, συμπεριλαμβανομένου της θεραπείας κατά του καρκίνου. Η βιολογική τους σταθερότητα, το μικρό μέγεθος και η ικανότητα πρόσδεσης σε αυτά διαφόρων παραγόντων, όπως πολυμερή, βιοδραστικές ουσίες και μονάδες στόχευσης τα κατέστησε ικανά να λειτουργούν σαν νανοφορείς στη στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων. Το μόνο τους μειονέκτημα είναι η μειωμένη διαλυτότητά τους στο νερό, το οποίο μπορεί να αντιμετωπιστεί με την πρόσδεση σε αυτά υδρόφιλων πολυμερών, όπως είναι η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG). Στην παρούσα εργασία, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της σύνθεσης ενός συζεύγματος πεγκυλιωμένου μορίου φουλλερενίου (C60) με το αντικαρκινικό φάρμακο δοξορουμπικίνη, καθώς και η in vitro αξιολόγηση του τελικού προϊόντος. Στόχος είναι η αύξηση της αποτελεσματικότητας και η μείωση της τοξικότητας του φαρμάκου, μέσω στοχευμένης μεταφοράς στον καρκινικό όγκο. Ένα πεγκυλιωμένο σύζευγμα φουλλερενίου (C60) με δύο μόρια δοξορουμπικίνης (DOX2-C60-PEG, ένωση 4), συντέθηκε επιτυχώς και χαρακτηρίστηκε πλήρως μέσω 1H-NMR, 13C-NMR, IR, UV και TGA. Η δραστικότητα του τελικού προϊόντος, καθώς και ενός ήδη συντεθέντος συζεύγματος με ένα μόριο φαρμάκου DOX-C60-PEG (ένωση 2b), αλλά και του ενδιαμέσου συζεύγματος C60-PEG (ένωση 7) και της υδροχλωρικής δοξορουμπικίνης (DOX•HCl), ενάντια στον καρκίνο ελέγχθηκε in vitro σε καρκινικές σειρές κυττάρων μαστού MCF-7. Τα συζεύγματα DOX2-C60-PEG (4) και DOX-C60-PEG (2b) εμφάνισαν ικανοποιητική δράση αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, συγκρίσιμη με αυτήν του ελεύθερου φαρμάκου, ύστερα από σχετικά μακρό χρόνο επώασης. Μελέτη εντοπισμού της DOX χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι το φάρμακο στην περίπτωση των συζευγμάτων εντοπίζεται πολύ πιο αργά στο πυρήνα του κυττάρου, όπου και μπορεί να εξασκήσει φαρμακολογική του δράση, σε σύγκριση με την ελεύθερη DΟΧ. Αυτό σε συνδυασμό με την αργή απελευθέρωση του φαρμάκου από τα συζεύγματα, όπως έδειξαν πειράματα αποδέσμευσης σε προϊόν λύσης των MCF-7 καρκινικών κυττάρων, ερμηνεύει την συγκριτικά αργή εμφάνιση δράσης στην περίπτωση των συζευγμάτων. Συμπερασματικά στην εργασία συντέθηκαν επιτυχώς φουλλερενικά συζεύγματα δοξορουμπικίνης τα οποία είχαν ικανοποιητική αντικαρκινική δραστικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων ανθρώπινης καρκινικής σειράς. τα αποτελέσματα δικαιολογούν περαιτέρω μελέτες εφαρμογής του φουλλερενίου ως νανοφορέα για την χορήγηση τόσο δοξορουμπικίνης, όσο και άλλων φαρμάκων κατά του καρκίνου. / Until now, the administration of various drugs for its cure, affect both cancer and normal cells. Thus, many serious side effects are caused on the human body, which do not permit the administration of therapeutic doses of potent anticancer drugs. Nanotechnology has entered dynamically”in the battle” against cancer. The design and the use of multifunctional nanoparticulte systems, provides new ways to detect, diagnose and treat cancer in the earliest stages and with minimal side effects. They can extravagate at tumor site, allowing direct drug access selectively to cancer cells. These particles have the capacity to be suitably modified in order to be biocompatible and can be attached to tumor cells or their microenvironment, acting as carriers in targeted delivery of anticancer drugs, reducing toxicity to normal tissues. Drug nanocarriers explored to date, suffer from inherent limitations, including instability, structural heterogeneity and poor control over size and shape. Therefore, there is a continuing need to produce new or optimized, already studied nanocarriers, in order to render possible the use of such advanced nanomedicines in the clinic. Fullerenes (C60), have attracted considerable interest in many fields of research, including the treatment of cancer. Because of their biological stability, their small size, and their ability to be suitably modified, attaching on them biological modifiers and drugs, they can be used as nanocarriers in targeted drug delivery. The main drawback of these carbon particles with regard to their biomedical applications, is their poor solubility to water. We can overcome this problem by attaching on fullerene particles hydrophilic polymers, such as polyethylene glycol (PEG). In the present work, the results of the synthesis and the in vitro biological evaluation of a pegylated fullerene conjugate with the potent anticancer drug Doxorubicin are represented. The main goal is to increase efficacy and reduce toxicity of doxorubicin, through targeted delivery to tumors, by conjugating the drug to pegylated fullerenes. A pegylated fullerene-doxorubicin conjugate with two molecules of drug per fullerene particle (DOX2-C60-PEG, compound 4) has successfully been synthesized and was fully characterized by 1H-NMR, 13C-NMR, IR, UV and TGA. The anticancer activity of conjugates DOX2-C60-PEG (4), DOX-C60-PEG (compound 2b, with one DOX molecule per fullerene particle), and conjugate C60-PEG (control compound 7) and doxorubicin hydrochloride ((DOX•HCl), was evaluated in MCF-7 cancer cells lines. The fullerene-doxorubicin conjugates (2b, 4) exhibited satisfactory anticancer activity (inhibiting cancer cells proliferation), which became comparable to the activity of free drug at relatively long incubation times. In accordance with the relatively slow effect of DOX-C60-PEG conjugates on cells viability, DOX localization studies using fluorescence microscopy indicated that the drug is much more slowly localized in cell nucleus, where the drug can exert its pharmacological action, in the case of conjugates compared to free DOX. In conclusion pegylated fullerene-doxorubicin conjugates were successfully synthesized. These DOX-C60-PEG conjugates exhibited comparable, but with a delayed onset, to free DOX anticancer activity against human cancer cell lines. The results obtained justify further investigation of the potential of these conjugates as anticancer nanomedicines.

Η αντικαρκινική ένωση δοξορουβικίνη χρησιμοποιείται ευρέως είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα, στην αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού, των ωοθηκών, του πνεύμονα αλλά και σε περιπτώσεις οξείας λευχαιμίας και σαρκωμάτων. Σε προηγούμενη έρευνα που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο μας, σε λεμφοκύτταρα ανθρώπου αλλά και στην κυτταρική σειρά ποντικού C2C12, βρέθηκε ότι επάγει το σχηματισμό μικροπυρήνων ως αποτέλεσμα κυρίως χρωμοσωματικής θραύσης. Στην παρούσα εργασία, διερευνήθηκε περαιτέρω η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού καθώς και η ικανότητά της να επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης σε λευχαιμικά κύτταρα ανθρώπου HL-60. Η μελέτη του κερματισμού του DNA λόγω της δράσης της δοξορουβικίνης πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης (SCGE) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Εκτιμήθηκαν οι παράμετροι tail length, % DNA in tail, tail moment, και olive tail moment που αποκαλύπτουν θραύση του DNA. Επιπρόσθετα, η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού αναλύθηκε μέσω δημιουργίας κλάσεων με ελάχιστη έως μέγιστη βλάβη. O μηχανισμός με τον οποίο προκαλεί θραύση του DNA διερευνήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης κάτω από αλκαλικές συνθήκες σε συνδυασμό με τη χρήση των επιδιορθωτικών ενζύμων Fpg και hOOG1. Μετέπειτα, εξετάστηκε η ικανότητα της δοξορουβικίνης να επάγει την απόπτωση. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN). Επίσης, με τη μέθοδο CBMN πραγματοποιήθηκε μελέτη του φαινομένου της χρωμοσωματικής θραύσης. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίον η υπό εξέταση χημική ένωση επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης, αναλύθηκε η ικανότητά της να τροποποιεί την έκφραση της κασπάσης-3, μιας πρωτεΐνης που παίζει σημαντικό ρόλο στον καταρράκτη των μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος ανοσοαποτύπωσης της παραπάνω πρωτεΐνης (Western blot). Με βάση τα ευρήματά μας, η δοξορουβικίνη παρουσιάζει θραυσματογόνο δράση, όπως φάνηκε από την αύξηση της εξόδου του DNA από τους πυρήνες των κυττάρων μετά από ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες. Η δημιουργία των ρηγμάτων είναι ισχυρότερη σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού σχετίζεται με την οξείδωση των βάσεων του DNA, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ασταθών σε αλκαλικές συνθήκες θέσεων (alkali labile sites). Επίσης, προκαλεί οριακή αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν, ενώ δε φαίνεται να επάγει τη δημιουργία των μικροπυρήνων στις υψηλότερες συγκεντρώσεις. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με την ιδιότητά της να προκαλεί μεγαλύτερη συχνότητα ρηγμάτων του DNA στις μικρές συγκεντρώσεις. Επιπρόσθετα, επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης. Η επαγωγή αυτή είναι ισχυρότερη σε υψηλές συγκεντρώσεις και δικαιολογεί τις μειωμένες συχνότητες ρηγμάτων και μικροπυρήνων στις συγκεντρώσεις αυτές. Η κασπάση 3 συμμετέχει στην επαγόμενη από τη δοξορουβικίνη απόπτωση όπως φάνηκε από την αύξηση της έκφρασης της κασπάσης 3, μετά από ανάλυση κατά western, σε κυτταρικές καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία δοξορουβικίνης. / The anticancer drug doxorubicin is widely used, either alone or in combination with other anticancer drugs, in the treatment of solid tumours of the breast, lung, ovary, as well as in acute leukemia and sarcomas. Previous research in our laboratory showed that doxorubicin is able to induce micronucleus generation, in human lymphocytes and mouse cell line C2C12, mainly due to chromosome breakage. In the present study we investigated the clastogenic activity of doxorubicin as well as its ability to induce apoptosis. Ηuman leukemic cells HL-60 were chosen as the cell system to proceed our research. The clastogenic activity of doxorubicin was investigated by alkaline Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE assay-Comet assay). Four parameters were analyzed, tail length, % DNA in tail, tail moment, and olive tail moment, which reveal DNA breakage. Additionally the capacity of doxorubicin to induce DNA fragmentation was analyzed by stratifying the cells into five classes with various degrees of DNA damage, from undamaged DNA to severely damaged DNA. The mechanism by which doxorubicin exerts its clastogenic activity was studied by enzyme linked comet assay. We used Fpg and hOOG1 DNA glycosylases. The ability of doxorubicin to induce apoptosis was studied by Cytokinesis-block Micronucleus assay. Also, the CBMN assay was used to assess the micronucleation on HL-60 due to the action of doxorubicin. To further elucidate the mechanism by which doxorubicin induce apoptosis we examined the ability of this compound to alter the expression of caspase 3, that plays a key role in the cascade of molecular events of programmed cell death. This analysis was performed by Western blot. Our findings indicate that doxorubicin exerts clastogenic activity as it provokes DNA migration from the nucleus after SCG electrophoresis in alkaline conditions. The generation of breaks on DNA strands seems to be more potent at low concentrations. The ability of doxorubicin to induce fragmentation of genetic material is correlated with the oxidation of DNA bases resulting in the formation of alkali labile sites. Furthermore, it induces marginal increase in the frequency of micronuclei at lower concentrations, while it doesn’t seem to induce micronucleation at higher concentrations. This finding is in accordance with the ability of doxorubicin to generate higher frequency of DNA breaks at low concentrations. Additionally, doxorubicin induces apoptosis. This induction is more potent at higher concentrations and is consistent with the reduced frequency of breaks and micronucleus generation at these concentrations. Activation of apoptosis due to doxorubicin treatment seems to be mediated by caspase 3.

Στο τομέα της νανοϊατρικής ένας από τους σημαντικότερους στόχους είναι η ανάπτυξη φαρμακευτικών νανοφορέων που θα μεταφέρουν και θα αποδεσμεύουν εκλεκτικά το φάρμακο στον πάσχοντα ιστό. Η χορήγηση δοξορουβικίνης (Dox), για παράδειγμα, εμφανίζει σημαντικά προβλήματα έλλειψης εκλεκτικότητας και συστημικής τοξικότητας. Μία πιθανή προσέγγιση για την περισσότερο εκλεκτική χορήγηση της Dox στους καρκινικούς όγκους είναι η χορήγηση της μετά τον εγκλεισμό της σε μαγνητικά στοχευόμενους νανοφορείς. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ειδίκευσης ήταν η μελέτη μαγνητικών νανοφορέων με βάση συμπολυμερή πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολύ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) με διαφορετικά χαρακτηριστικά πολυμερικού κελύφους και ο προσδιορισμός εκείνων των χαρακτηριστικών που προσδίδουν στους νανοφορείς βέλτιστη συμπεριφορά. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η σταθερότητα των μαγνητικών νανοφορέων με διαφορετικό μήκος αλυσίδων πολύ(αιθυλενογλυκόλης) και διαφορετική πυκνότητα αρνητικού φορτίου σε διάφορα μέσα όπως υδατικά διαλύματα χλωριούχου νατρίου (ΝαCl), ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS), δοξορουβικίνης καθώς επίσης και σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών pH. Μελετήθηκε επίσης η φόρτωση του φαρμάκου σε αυτούς καθώς επίσης και η αποδέσμευση του από τους συγκεκριμένους νανοφορείς σε διάφορα μέσα (νερό, υδατικό διάλυμα PBS και διάλυμα αλβουμίνης σε PBS). Οι νανοφορείς παρασκευάστηκαν μέσω πρόσδεσης του συμπολυμερούς πολυ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολυ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) στην επιφάνεια νανοκρυσταλλιτών Fe2O3 κατά τη διάρκεια ανάπτυξής τους. Η μελέτη της σταθερότητας έγινε με τη μέθοδο της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Η μελέτη της φόρτωσης και της αποδέσμευσης του φαρμάκου στους και από τους νανοφορείς έγινε με τη μέθοδο της φασματοφωτομετρίας φθορισμού. Στο πρώτο κεφάλαιο παρουσιάζονται συνοπτικά τα διάφορα είδη νανοφορέων, οι ιδιότητες καθώς και οι εφαρμογές αυτών. Γίνεται επίσης μια σύντομη βιβλιογραφική ανασκόπηση σε ότι αφορά τη φόρτωση και αποδέσμευση φαρμάκων από νανοφορείς. Το δεύτερο κεφάλαιο είναι αφιερωμένο στις τεχνικές και τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν στα πλάισια της συγκεκριμένης εργασίας καθώς επίσης και των πειραματικών διαδικασιών.Τέλος, το τρίτο κεφάλαιο αφορά στην παράθεση και τον σχολιασμό των αποτελεσμάτων,τα οποία μπορούν να συνοψιστούν στα εξής συμπεράσματα:  Οι μαγνητικοί νανοφορείς με βάση συμπολυμερή πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολύ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) έχουν ικανοποιητικά 7 χαρακτηριστικά μεγέθους και ζ δυναμικού για παρατεταμένη παραμονή στην κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, γεγονός που αποτελεί προϋπόθεση για την εφαρμογή τους ως συστήματα εκλεκτικής μεταφοράς (στόχευσης) αντικαρκινικών φαρμάκων.  Οι υψηλές τιμές φόρτωσης της δοξορουβικίνης στους νανοφορείς με υψηλή πυκνότητα ανιονικών φορτίων, λόγω ισχυρότερων ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων με το θετικά φορτισμένο φάρμακο αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα των νανοφορέων αυτών σαν συστήματα χορήγησης δοξορουβικίνης.  Η αύξηση του ρυθμού αποδέσμευσης της δοξορουβικίνης από τους νανοφορείς σε διαλύματα αλβουμίνης με ελάττωση του pH είναι σημαντική καθώς παρέχει τη δυνατότητα μιας σχετικά εκλεκτικής διάθεσης του φαρμάκου στους καρκινικούς όγκους όπου επικρατούν συνθήκες χαμηλότερου από το το φυσιολογικό pH. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα που λήφθηκαν δικαιολογούν την περαιτέρω μελέτη των μαγνητικών νανοφορέων δοξορουμπικίνης για την καταλληλότητά τους ως φορείς στοχευμένης χορήγησης του φαρμάκου σε καρκινικούς όγκους. / In the field of nanomedicine, one of the most important targets is the development of functional nanoassemblies which will deliver and release selectively the drug to the suffering tissue. For example, the administration of doxorubicin (Dox) displays lack of selectivity and systemic toxicity issues. A possible approach towards a more selective delivery of Dox to the target tissue is its encapsulation at magnetically targeted nanoparticles. The present postgraduate thesis’ aim was the study of magnetic nanocarriers based on copolymers of poly(methacrylic acid)- graft -poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA -g- EGMA)) with different structural characteristics and the determination of those characteristics, that impart to the nanocarriers the optimal performance. Specifically, the stability of magnetic nanoparticles, with different chain length of poly(ethyleneglycol) and different density of negative charges, was studied at various media such as NaCl, pH and Dox concentration. The drug loading in the nanocarriers was also studied, as well as its release by the specific nanocarriers at various media (distilled water, PBS and albumin solution in PBS). The nanoparticles were prepared via a self-assembly process of the polymers [poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA-g-EGMA)] on the surface of the growing iron oxide nanocrystallites. The stability studies were performed with the use of DLS technique. The study of the drug loading and release from the nanoparticles was followed using the fluorescence spectroscopy. In the first chapter, the various types of nanoparticles, their properties, as well as their applications are presented briefly. Additionally, a short literature review with regard to the loading and release of drugs from nanoparticles is presented. The second chapter refers to the techniques and methods that were utilized in the context of the present thesis, as well as to the experimental procedures. Finally, in the third chapter the experimental results are presented and discussed. Based on the results of this study:  The magnetic nanocarriers based on copolymers poly(methacrylic acid)- graft -poly(ethyleneglycolmethacrylate) (p(MAA -g- EGMA)) have satisfying characteristics of size and z potential for long blood residence time after an intravenous injection, which is a prerequisite for their application as controlled (targeted) delivery systems for anticancer drugs. The high values of doxorubicin loading without stability loss is an important advantage.  The increase in the release rate of doxorubicin by the nanocarriers in albumin solutions with low pH (5-6) is important, since it facilitates a relatively selective release of the drug in cancer tumors which display lower pH than that of the normal tissues. In conclusion, the results of the research justify the further in-vitro study of the suitability of the magnetic doxorubicin nanocarriers as selective delivery systems of the drug to the cancer tumors.

Curcumin (CURC) was incorporated in liposomes as free drug or after formation of hydropropyl-β- or hydroxypropyl-γ-cyclodextrin (HPβCD or HPγCD) complexes prepared by co-precipitation and characterized by X-ray diffractometry. Liposomes encapsulating CURC as free drug or CD-complexes (hybrid formulations) were prepared by the dehydration–rehydration vesicle (DRV) method followed by extrusion, and characterized for size, zeta-potential and CURC loading. CURC stability (at 0.01 and 0.05 mg/mL) in 80% (v/v) fetal bovine serum (FBS) was evaluated at 37 oC. Results demonstrate that HPβCD stabilizes CURC more than HPCD, but liposome encapsulation provides substantially more protection, than CDs. CURC stabilization is similar, when encapsulated as free compound or CD-complex. However, the last method increases CURC loading by 23 times (depending on the lipid composition of liposomes and the CD used), resulting in higher solubility. The stability profile of CURC in serum depends on the composition of liposomes and CURC concentration, since at lower concentrations larger CURC fractions are protected due to protein binding. Compared to the corresponding CD complexes, hybrid formulations provide intermediate CURC solubility (comparable to HPβCD) but profoundly higher stabilization. After identifying that CURC formulations are active against B16 melanoma cells (in vitro), the optimal concentrations of CURC and doxorubicin (DOX) combinations (which provided highest anticancer activity [in vitro]) were identified. In a second step, combination hybrid-liposomal formulations of CURC and DOX were prepared, as a technique to deliver the specific combination of the two drugs to cancer cells following in vivo administration (since the two drugs have different pharmacokinetics and would not reach cancer cells at the same ratio if administered as free drugs). Additionally the effect of ceramide incorporation in the liposomal membrane on the anticancer activity of the later combination-formulations was investigated. The liposomal CURC-DOX combination formulations demonstrated significantly enhanced anticancer activity, compared to liposomes with DOX only. As confirmed by FACS analysis and uptake studies, this enhanced effect was due to increased uptake of DOX by the cells, in the presence of CURC (which was not seen when free compounds were used). Although a positive effect of ceramide addition in liposomal-DOX anticancer activity was demonstrated, in agreement with previous studies, ceramide addition did not result in further increase of the anticancer activity of the CURC-DOX combination formulations, when tested by MTT assay. However, mechanistic studies revealed that the CURC-DOX formulations resulted in higher percentage of early apoptotic cells, compared to the ceramide-DOX formulations which resulted mainly in late-apoptotic cells. When all CURC-DOX and Ceramide were combined in the same formulation, the percentages of early and late apoptotic cells were additive. / Η Κουρκουμίνη (CURC) ενσωματώθηκε σε λιποσώματα ως ελεύθερο μόριο ή ως σύμπλοκο εγκλεισμού με υδροξυπροπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη ή υδροξυπροπυλο-γ-κυκλοδεξτρίνη (HPβCDorHPCD); Τα σύμπλοκα παρασκευάστηκαν με την τεχνική της συγκαταβύθισης και χαρακτηρίστηκαν με ακτίνες-Χ. Συμβατικά λιποσώματα (που ενσωματώνουν την CURC ωε ελεύθερο μόριο) και υβριδικά, που την εγκλωβίζουν ως σύμπλοκο-εγκλεισμού, παρασκευάστηκαν με την τεχνική DRV και εξώθηση διαμέσου μεμβρανών, και αφού χαρακτηρίστηκαν φυσικοχημικά (φόρτωση CURC, μέση διάμετρος, πολυδιασπορά και ζ-δυναμικό), μελετήθηκε η σταθερότητα της CURC (σε συγκέντρωση 0.01 and 0.05 mg/mL), όταν τα παρασκευάσματα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα και ορρό (80% ο/ο FCS) στους 37 oC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HPβCD σταθεροποιεί την CURC περισσότερο από ότι η HPCD, αλλά η ενσωμάτωση σε λιποσώματα προσφέρει σημαντικά μεγαλύτερη σταθεροποίηση από ότι οι CDs (είτε όταν εγκλωβίζετε ως ελεύθερο μόριο ή ως CD-σύμπλοκο). Όμως η τελευταία μέθοδος πετυχαίνει αύξηση της φόρτωσης έως και κατά 23 φορές (ανάλογα με τη λιπιδική σύσταση και το σύμπλοκο που χρησιμοποιείται), με αποτέλεσμα να αυξάνει σημαντικά η διαλυτότητα της CURC. Η σταθερότητα της CURC παρουσία ορρού συνδέεται με την λιπιδική σύσταση των λιποσωμάτων και τη συγκέντρωση της CURC, αφού σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις μεγαλύτερο κλάσμα της CURCfractions προστατεύεται λόγο σύνδεσης στις πρωτεΐνες. Σε σύγκριση με τα σύμπλοκα εγκλεισμού, οι υβριδικές λιποσωμικές μορφές προσφέρουν ενδιάμεση διαλυτότητα στην CURC (συγκρίσιμη με αυτήν της HPβCD) αλλά σημαντικά αυξημένη σταθερότητα. Μετά την απόδειξη ότι οι μορφές της CURC είναι δραστικές κατά κυττάρων μελανώματος B16 (invitro), εντοπίστηκαν οι βέλτιστες συγκεντρώσεις συνδυασμών CURC και δοξορουβικίνης (DOX) που προσφέρουν βέλτιστη αντικαρκινική δράση [invitro]. Σε δεύτερο βήμα, παρασκευάστηκαν υβριδικές λιποσωμικές μορφές συνδυασμών CURC -DOX, ως τεχνική χορήγησης συνδυασμών που θα φθάσουν στα καρκινικά κύτταρα στις αρχικές συγκεντρώσεις (κάτι που δεν θα συμβεί εάν χορηγηθούν ως ξεχωριστά φάρμακα λόγο της διαφορετικής κινητικής τους). Επιπρόσθετα μελετήθηκε η επίδραση της ενσωμάτωσης ceramideς στην λιποσωμική μεμβράνη στην αντικαρκινική δράση των μορφών. Οι μορφές συνδυασμού CURC-DOX έδειξαν αυξημένη αντικαρκινική δράση σε σύγκριση με λιποσώματα που είχαν μόνο DOX (κάτι που δεν παρατηρήθηκε όταν χρησιμοποιήθηκαν ελεύθερα τα δύο μόρια). Όπως επιβεβαιώθηκε με FACSanalysis και με πειράματα κυτταρικής πρόσληψης, αυτή η αυξημένη δράση των μορφών συνδυασμού οφείλετε σε αύξηση της πρόσληψης DOX από τα κύτταρα, παρουσία CURC (πάλι δεν συνέβηκε όταν χρησιμοποιήθηκε ελεύθερη CURC). Εάν και παρατηρήθηκε αυξημένη δραστικότητα λιποσωμικής -DOX όταν τα λιποσώματα είχαν ceramides στη σύσταση τους, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, η προσθήκη, ceramideς δεν είχε θετικό αποτέλεσμα στη δραστικότητα των μορφών συνδυασμού CURC-DOX όταν μετρήθηκε με την τεχνική MTT. Εντούτοις, μηχανιστικές μελέτες έδειξαν ότι οι μορφές συνδυασμού CURC-DOX έδωσαν αυξημένο ποσοστό κυττάρων που είναι σε αρχικά στάδια απόπτωσης, σε σχέση με τα λιποσωματα DOX με ceramides που έδωσαν μεγαλύτερα ποσοστά κυττάρων σε τελικά στάδια απόπτωσης. Στις μορφές που συνδύαζαν τα πάντα, CURC-DOX και Ceramides τα ποσοστά κυττάρων σε πρώιμη και προχωρημένη απόπτωση ήταν αθροιστικά.

Η σισπλατίνη αποτελεί ένας ευρέως διαδεδομένο αντικαρκινικό φάρμακο. Ωστόσο προκαλεί σοβαρές παρενέργειες εξαιτίας της έλλειψης εκλεκτικότητας που παρουσιάζει. Για αυτόν το λόγο, γίνεται προσπάθεια ενκαψακίωσης της σισπλατίνης σε νανοφορείς ώστε να επιτευχθεί η εκλεκτική μεταφορά της στον καρκινικό ιστό με μηχανισμούς παθητικής ή ενεργητικής στόχευσης. Στην παρούσα εργασία, παρασκευάστηκαν μαγνητικοί νανοφορείς σισπλατίνας και ελέγχθησαν οι ιδιότητες φόρτωσης με σισπλατίνη και αποδέσμευσης, η κολλοειδής σταθερότητα και η in vitro αντικαρκινική δραστικότητα. Τα νανοσωματίδια (οι μαγνητικοί νανοφορείς) συντέθηκαν με τη σύνδεση του συμπολυμερούς πολυμεθακρυλικό οξύ – πολυαιθυλενογλυκόλη (poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate)) σε μαγνητικούς νανοκρυσταλλίτες. Ενώ το πολυμεθακρυλικό οξύ παρέχει τις απαραίτητες καρβοξυλομάδες στο σύστημα για τη σύνδεση της σισπλατίνης, οι αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης προσφέρουν στερεοχημική σταθεροποίηση στα νανοσωματίδια. Αρχικά παρασκευάστηκαν μαγνητικοί νανοφορείς με διαφορετικούς τύπους p(MAA-g-EGMA) συμπολυμερών τα οποία διέφεραν ως προς το μήκος και την πυκνότητα των αλυσίδων PEG. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της υδρολυτικής, αλκαλικής καταβύθισης από μία πρόδρομη ένωση δισθενούς σιδήρου παρουσία των παραπάνω συμπολυμερών. Οι νανοφορείς σε επόμενο στάδιο φορτώθηκαν με τη σισπλατίνη μετά από επώαση τους με το φάρμακο. Επιπλέον διερευνήθηκε η επίδραση του pH στην φόρτωση της σισπλατίνης. Οι νανοφορείς χαρακτηρίστηκαν ως προς την υδροδυναμική τους διάμετρο και το επιφανειακό τους φορτίο μέσω της τεχνικής της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) και μικροηλεκτροφόρησης αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης του φαρμάκου από τους νανοφορείς σε διάλυμα φωσφορικών (pH=7.4) στους 37°C. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η επίδραση της εφαρμογής εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου (400 kHz) στην αποδέσμευση της σισπλατίνης από τους νανοφορείς μέσω της πρόκλησης υπερθερμίας. Τέλος, εκτιμήθηκε η κυτταροτοξικότητα των φορτωμένων με σισπλατίνη νανοφορέων και συγκρίθηκε με την κυτταροτοξικότητα των κενών νανοσωματίδιων και του φαρμάκου. Ο έλεγχος κυτταροτοξικότητας πραγματοποιήθηκε μέσω της τεχνικής της κυτταρομετρίας ροής, μετά από χρώση των κυττάρων (Α549, καρκινικά κύτταρα πνεύμονα) με τη χρωστική του ιωδιούχου προπιδίου (PI). Οι p(MAA-g-EGMA) μαγνητικοί φορείς σισπλατίνης που παρασκευάστηκαν στην παρούσα εργασία παρουσίασαν μεγάλη σταθερότητα στο χρόνο ως προς την υδροδυναμική τους διάμετρο και το επιφανειακό τους φορτίο. Επιπλέον παρουσίασαν ικανοποιητική φόρτωση φαρμάκου (6-8%). Η αύξηση του pH (μέχρι 10), η αύξηση των ανιονικών θέσεων (καρβοξυλομάδες) και η μείωση του PEG βρέθηκε να οδηγούν σε αύξηση της φόρτωσης της σισπλατίνης στους νανοφορείς. Παρατηρήθηκε παρατεταμένη αποδέσμευση του φαρμάκου (σισπλατίνης) από τους νανοφορείς, με τον ρυθμό αποδέσμευσης να επηρεάζεται από την πολυμερική σύνθεση των νανοφορέων. Τέλος, οι νανοφορείς παρουσίασαν χαμηλή κυτταροτοξικότητα ενώ οι νανοφορείς φορτωμένοι με σισπλατίνη παρουσίασαν τοξικότητα συγκρίσιμη με αυτήν του φαρμάκου. Με βάση τα ληφθέντα αποτελέσματα, οι p(MAA-g-EGMA) μαγνητικοί νανοφορείς σισπλατίνης έχουν ικανοποιητικές ιδιότητες κολλοειδούς σταθερότητας, φόρτωσης σε φάρμακο και αποδέσμευσης, γεγονός που δικαιολογεί την περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής χρησιμοποίησης τους ως φορείς στοχευμένης χορήγησης σισπλατίνας. / Cisplatin is a potent anticacer agent. However, it exhibits serious side effects due to lack of selectivity. Therefore, a more selective cisplatin delivery to tumors is pursued by incorporating cisplatin in targetable nanocarriers. In this work, hybrid magnetic nano-asssemblies loaded with ciplatin were prepared and evaluated in vitro. The nano-assemblies were synthesized through grafting of poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA-g-EGMA) on magnetite nanocrystallites. Poly(ethylene glycol) chains confer to the nanocarriers bio-repellent properties. The formation of a distinct second inner polymeric corona with an abundance of carboxylate groups provides the binding sites for cisplatin molecules. Different types of p(MAA-g-EGMA) copolymers with varying length and density of PEG chains were synthesized. Core-shell magnetic nano-assemblies were prepared by hydrolytic alkaline precipitation from a single ferrous molecular precursor in the presence of the above p(MAA-g-EGMA) copolymers . The nano-assemblies were loaded with cisplatin by incubating them with cisplatin solutions of different cisplatin concentration. The nano-assemblies were characterized with regard to their size and zeta potential at different salt concentrations using dynamic light scattering (DLS). The effect of pH on cisplatin loading was investigated. Drug release studies were performed spectrophotometrically in phosphate buffered saline (pH 7.4) at 37°C. The influence of applying an AC magnetic field on the release profile of cisplatin was also investigated using a home-made AC (400 kHz) magnetic field generator 5 mT. The cytotoxicity of blank and cisplatin-loaded nano-assemblies against A549 human lung cancer cell line was assessed by flow cytometric measurement of cellular fluorescence after staining with propidium iodide (PI). The nanocarriers had suitable size properties for intravenous administration and accumulation to tumors based on the enhanced permeability and retention phenomenon (EPR effect). They also were found to exhibit very good colloidal stability, satisfactory cisplatin loading efficiency (around 6% w/w at optimum experimental conditions) and sustained drug release properties, with the rate of release to be significantly increased in response to external AC magnetic fields. Furthermore, the blank nanocarriers did not exhibit cytotoxicity whereas the cisplatin-loaded nanocarriers exhibited comparable to the free ciplatin cytotoxicity against A549 cancer cells. The obtained results justify further evaluation of p(MAA-g-EGMA) nanocarriers as targeted drug delivery system of cisplatin.

Η θεραπεία του καρκίνου αποτελεί στις μέρες μας μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της επιστημονικής κοινότητας παγκοσμίως. Τα συμβατικά φάρμακα που κυκλοφορούν εδώ και χρόνια προσβάλλουν τόσο τα καρκινικά όσο και τα υγιή κύτταρα. Το αποτέλεσμα είναι η πρόκληση σοβαρών παρενεργειών, οι οποίες δεν επιτρέπουν τη χορήγηση θεραπευτικών δόσεων. Η ανάπτυξη της νανοτεχνολογίας έχει βοηθήσει κατά πολύ το επιστημονικό πεδίο όσον αφορά τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου. Τα νανοσωματίδια παρέχουν ένα νέο τρόπο χορήγησης των αντικαρκινικών φαρμάκων, λειτουργώντας ως φορείς που εξαγγειώνονται στην περιοχή του όγκου, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο άμεση πρόσβαση στα καρκινικά κύτταρα. Τα συγκεκριμένα σωματίδια μπορούν να τροποποιηθούν κατάλληλα, ώστε να αποκτήσουν τη δυνατότητα να δεσμευθούν στις μεμβράνες των καρκινικών κυττάρων, στο μικροπεριβάλλον τους ή σε κυτταροπλασματικούς ή πυρηνικούς υποδοχείς. Κατά συνέπεια, μεταφέρονται στοχευμένα υψηλές συγκεντρώσεις του φαρμάκου στα καρκινικά κύτταρα και μειώνεται η τοξικότητα στους φυσιολογικούς ιστούς. Η ανάπτυξη τροποποιημένων νανοφορέων για τη χορήγηση των αντικαρκινικών φαρμάκων μπορεί να περιορίσει τα προβλήματα που συνδέονται με τα συμβατικά συστήματα χορήγησης, όπως έλλειψη εκλεκτικότητας και τοξικότητα. Οι νανοφορείς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, εμφανίζουν σημαντικά προβλήματα, όπως δομική αστάθεια, δομική ετερογένεια και ελλειπή έλεγχο μεγέθους και σχήματος. Υπάρχει, συνεπώς, μια αυξανόμενη ανάγκη για ανάπτυξη προηγμένων συστημάτων μεταφοράς αντικαρκινικών φαρμάκων, στα οποία το σχήμα, το μέγεθος και η ικανότητα φόρτωσης να μπορούν να ρυθμιστούν κατάλληλα, προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η αποτελεσματικότητα και να ελαχιστοποιηθεί η τοξικότητα των φαρμάκων. Τα φουλλερένια (C60) ανήκουν στην κατηγορία των νανοφορέων που μελετούνται εκτενώς για τη χορήγηση αντικαρκινικών παραγόντων. Η δυνατότητα των φουλλερενίων για την εκπλήρωση των παραπάνω προδιαγραφών έγκειται στη μεγάλη δυνατότητα τροποποίησης της βασικής τους δομής και την παρασκευή πληθώρας παραγώγων με επιθυμητές ιδιότητες. Το μεγαλύτερο μειονέκτημα αυτών των μορίων είναι η ελάχιστη διαλυτότητά τους στο νερό. Το πρόβλημα αυτό μπορεί να αντιμετωπιστεί με την πρόσδεση σε αυτά υδρόφιλων πολυμερών, όπως είναι η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG). Στην παρούσα εργασία, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της σύνθεσης ενός συζεύγματος πεγκυλιωμένου μορίου φουλλερενίου (C60) με το αντικαρκινικό φάρμακο δοξορουμπικίνη, καθώς και η in vitro αξιολόγηση του τελικού προϊόντος. Στόχος είναι η αύξηση της αποτελεσματικότητας και η μείωση της τοξικότητας του φαρμάκου, μέσω στοχευμένης μεταφοράς στον καρκινικό όγκο. Ένα πεγκυλιωμένο σύζευγμα φουλλερενίου (C60) με δοξορουμπικίνη (FULL-PEG-DOX) συντέθηκε επιτυχώς σε έξι στάδια με συνολική απόδοση 25,7% και χαρακτηρίστηκε με 1H-NMR, IR και UV. Η δραστικότητα του τελικού προϊόντος, καθώς επίσης και δύο ενδιάμεσων προϊόντων (FULL-PEG και FULL-DOX) αλλά και του υδροχλωρικού άλατος της δοξορουμπικίνης ενάντια στον καρκίνο ελέγχθηκε in vitro σε καρκινικές σειρές κυττάρων MCF-7. Το τελικό προϊόν εμφάνισε ικανοποιητική αντικαρκινική δράση, κυρίως μέσω αναστολής του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα της μελέτης μπορούν να θεωρηθούν ιδιαίτερα ενθαρρυντικά και δικαιολογούν τη συνέχιση της ερευνητικής προσπάθειας για στοχευμένη χορήγηση δοξορουμπικίνης σε καρκινικά κύτταρα μέσω της πρόσδεσής της σε τροποποιημένα μόρια φουλλερενίου. / Cancer’s treatment is nowadays one of the most important challenges that the scientific community worldwide has to face. Conventional anticancer drugs, which are in the market many years, affect both cancer and normal cells. Hence, they cause serious side effects, which make the administration of therapeutic drug doses impossible. The development of nanotechnology has changed the scientific landscape in terms of cancer diagnosis and treatment. Nanoparticulate drug carriers provide a new mode of cancer drug delivery. They can extravasate at tumor site, allowing direct drug access to cancer cells. These particles allow exquisite modification for binding to cancer cell membranes, the microenvironment or to cytoplasmic or nuclear receptor sites. This results to the delivery of high drug concentrations to the targeted cancer cells with reduced toxicity to normal (healthy) tissue. The application of engineered nanocarriers for the delivery of anticancer drugs may alleviate the problems associated with conventional anticancer drug delivery systems, such as lack of selectivity and toxicity. Drug nanocarriers explored to date suffer from inherent limitations, including instability, structural heterogeneity and poor control over size and shape. There is an increasing need for advanced delivery agents for the anticancer drugs where shape, size, functionalization and loading capacity can be precisely tuned in order to maximize efficacy and minimize drug toxicity. Among the nanocarriers which are currently studied as drug delivery systems for anticancer agents are fullerenes (C60). The potential of fullerenes to address the above specifications lies in the immense scope for chemical derivatization to the basic structure. Except for their high toxicity to normal cells, the main drawback of these carbon molecules is their poor solubility to water. This problem can be overcome by attaching on fullerene particles hydrophilic polymers, such as polyethylene glycol (PEG). In the present work, the results of synthesis and in vitro biological evaluation of a pegylated fullerene conjugate with the potent anticancer drug Doxorubicin are represented. The main goal is to increase efficacy and reduce toxicity of doxorubicin, through targeted delivery to tumors, by conjugating the drug to pegylated fullerenes. A pegylated fullerene-doxorubicin conjugate has been successfully synthesized in 6 steps with a 25.7 % overall yield and was characterized by 1H-NMR, IR and UV. The final product, two intermediate products and doxorubicin hydrochloride were evaluated in vitro against MCF-7 cancer cells lines. The final product exhibited satisfactory anticancer activity mainly by inhibiting proliferation. The results of this study justify further investigation of the potential of pegylated fullerenes as targeted nanocarriers of doxorubicin.

Οι υπερίτες του αζώτου (nitrogen mustards) συνιστούν μία αποτελεσματική ομάδα φαρμάκων που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατα ευρήματα της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι οι υπερίτες του αζώτου μελφαλάνη (MEL), χλωραμπουκίλη (CAB) και ο δραστικός της μεταβολίτης, το PHE, επιδεικνύουν ισχυρή θραυσματογόνο δράση, αλλά επιπρόσθετα, εμφανίζουν ανευπλοειδογόνο δράση, διαταράσσοντας το χρωμοσωματικό αποχωρισμό μέσω τροποποιήσεων της δομής και λειτουργίας της μιτωτικής συσκευής. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήθηκε περαιτέρω ο μηχανισμός της ανευπλοειδογόνου δράσης των παραπάνω δραστικών ενώσεων και πραγματοποιήθηκε σύγκριση της γενετικής δράσης δύο νέων στεροειδών αναλόγων του PHE, τα ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 με αυτήν των MEL, CAB και PHE. Τα στεροειδή ανάλογα σχεδιάστηκαν με στόχο την αύξηση της εκλεκτικότητας της αντινεοπλασματικής δράσης. Η ικανότητα των MEL, CAB και PHE να προκαλούν φαινόμενα χρωμοσωματικής καθυστέρησης μελετήθηκε σε σύγκριση με τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα in vitro με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN) σε συνδυασμό με τη μέθοδο FISH και τη χρήση πανκεντρομερικού ανιχνευτή. Επιβεβαιώθηκε η θραυσματογόνος και ανευπλοειδογόνος δράση των ενώσεων MEL, CAB και PHE, ενώ φάνηκε ότι τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 προκαλούν αποκλειστικά χρωμοσωματική θραύση. Το φαινόμενο της χρωμοσωματικής καθυστέρησης μελετήθηκε επίσης με τη μέθοδο CREST στην κυτταρική σειρά ποντικού C2C12. Με τη μέθοδο αυτή, επιβεβαιώθηκε η διπλή γενετική δράση των ενώσεων MEL, CAB και PHE. Τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 εμφανίστηκαν ως οι ηπιότεροι επαγωγείς ΜΝ και προκαλούν κυρίως χρωμοσωματική θραύση, ενώ ήπια ανευπλοειδογόνο δράση παρουσίασε μόνο το ανάλογο ΕΑ-92. Ακολούθως, εξετάσθηκε η ικανότητα των υπό εξέταση χημικών ενώσεων ΕΑ-92 και ΕΑ-97, να επηρεάζουν τη δομή και λειτουργία της μιτωτικής συσκευής σε σχέση με αυτήν των ενώσεων MEL, CAB, PHE, με διπλό ανοσοφθορισμό για τη β- και γ-τουμπουλίνη. Παρατηρήθηκε ότι όλες οι ενώσεις, εκτός από το στεροειδές ΕΑ-97 προκαλούν τη δημιουργία πολυπολικών μεταφάσεων, ενώ όλες οι ενώσεις επάγουν το σχηματισμό μεσοφασικών κυττάρων με ανώμαλο αριθμό κεντροσωμάτων. Όλες οι υπό εξέταση χημικές ενώσεις εμφανίζουν κυτταροτοξικότητα και καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων και στα κύτταρα ποντικού C2C12. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η ικανότητα των υπό εξέταση ενώσεων να επάγουν την απόπτωση και μελετήθηκε ο ρόλος της απόπτωσης στην εκδήλωση της γενετικής δράσης των ενώσεων MEL, CAB και PHE. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε στα κύτταρα C2C12 με τη μέθοδο της διπλής χρώσης Αννεξίνης V/Ιωδιούχου προπιδίου και το διπλό ανοσοφθορισμό β- και γ-τουμπουλίνης, ανεξάρτητα, σε κύτταρα ποντικού C2C12, παρουσία του γενικού αναστολέα της δράσης των κασπασών, Z-VAD-FMK, αλλά και αναστολέων της δράσης συγκεκριμένων κασπασών. Όλες οι υπό εξέταση ενώσεις επάγουν χαμηλά ποσοστά απόπτωσης. Οι κασπάσες-3, -6 και -8 συμμετέχουν στην επαγόμενη από τη MEL απόπτωση αλλά δεν συμμετέχουν στην απομάκρυνση των κυττάρων με μικροπυρήνες που επάγονται από τη δράση της ίδιας ένωσης. Η απόπτωση αποτελεί μηχανισμό απομάκρυνσης των κυττάρων με μικροπυρήνες και κανονικό κεντροσωματικό αριθμό που επάγονται από τις ενώσεις MEL, CAB και PHE. Αντίθετα, τα κύτταρα με υπεράριθμα κεντροσώματα, που προκύπτουν από τη δράση των παραπάνω ενώσεων δεν απομακρύνονται μέσω απόπτωσης. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο οι δραστικές ενώσεις MEL και CAB εκφράζουν τις ανευπλοειδογόνες ιδιότητες τους, μελετήθηκε η επίδραση τους στην έκφραση των πρωτεϊνών Aurora-B, survivin, Aurora-A και γ-τουμπουλίνη σε κύτταρα ποντικού C2C12, με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών. Παράλληλα μελετήθηκε η ένωση ΕΑ-97, η οποία σύμφωνα με τα ευρήματα μας, εμφάνισε αποκλειστικά θραυσματογόνο δράση. Οι ενώσεις MEL και CAB, εκδηλώνουν τις ανευπλοειδογόνες ιδιότητες τους προκαλώντας μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών Aurora-B και survivin και επάγοντας την αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Aurora-A. Επιπρόσθετα, η ένωση MEL, προκαλεί αύξηση της έκφρασης της γ-τουμπουλίνης. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν τη συμμετοχή των παραπάνω πρωτεϊνών στην εκδήλωση της ανευπλοειδογόνου δράσης των ενώσεων που μελετήθηκαν. Αντίθετα το στεροειδές ανάλογο ΕΑ-97 που εμφανίζει αποκλειστικά θραυσματογόνο δράση, δεν μεταβάλλει την έκφραση των παραπάνω πρωτεϊνών. / Nitrogen mustards represent an effective class of drugs that are used in chemotherapy. Recent findings of our group have shown that nitrogen mustard analogues, melphalan (MEL), chlorambucil (CAB) and PHE, in addition to their clastogenic activity, they exert their aneugenic potential by affecting chromosome segregation due to modifications of mitotic apparatus. In the present study, we investigated the mechanism by which the above compounds display their aneugenicity in comparison with two new steroidal analogues of PHE, EA-92 and EA-97, which were designed aiming at most effective antineoplasmatic activity. The ability of MEL, CAB and PHE to induce chromosome delay events was studied in comparison with the steroidal analogues EA-92 and EA-97. The mechanism of micronucleation was determined by Cytokinesis Block Micronucleus assay (CBMN assay) in combination with Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) using pancentromeric DNA probe. It was confirmed that MEL, CAB and PHE generated MNi by two mechanisms, chromosome breakage and chromosome delay, while EA-92 and EA-97 induced the formation of MN originated exclusively from chromosome breakage events. The ability of the tested compounds to induce chromosome delay was also investigated in C2C12 mouse cells by CREST analysis. The dual genetic activity of MEL, CAB, and PHE was confirmed in a different biological system. The analogues EA-92 and EA-97 appeared as weaker MN inducers and they induced mainly chromosome breakage, while a weak aneugenic activity was observed for EA-92. The ability of the nitrogen mustard analogues to affect the organization of mitotic apparatus was investigated in comparison with MEL, CAB and PHE by double immunofluorescence of β- and γ-tubulin in C2C12 mouse cells. It was observed that all compounds, except EA-97, induced mutlipolar metaphases, and also generated interphase cells with abnormal centrosome number. All compounds displayed increased cytotoxicity and they caused cell cycle delay in human lymphocyte cultures and in C2C12 mouse cells. The ability of the tested compounds to induce apoptosis was studied by Annexin V/PI assay. It was revealed that all compounds induced apoptosis. The effect of apoptosis on the genetic activity of MEL, CAB and PHE was investigated by inhibition of apoptosis in the presence of the inhibitor Z-VAD-FMK and the use of specific inhibitors for caspase -3, -6, -8 and -1. For this reason Annexin V/PI assay and double immunofluorescence of β- and γ-tubulin were performed, independently in C2C12 mouse cells. Caspases -3, -6 and -8 are involved in melphalan-induced apoptosis, but they are not involved in the elimination of cells in the presence of melphalan. Apoptosis is the responsible mechanism for the exclusion of cells with MNi and normal centrosome number that are induced by MEL, CAB and PHE. On the contrary, cells exerting supernumerary centrosomes are not eliminated by apoptosis in the presence of the above compounds. To further elucidate the mechanisms by which MEL and CAB exert their aneugenic potential, we examined the ability of the compounds to alter the expression of proteins having important role in chromosome segregation, such as the proteins Aurora-B, survivin, Aurora-A and γ-tubulin. The analysis was performed by Western blot method in C2C12 mouse cells. We also studied the steroid analogue EA-97, which according to our findings acts as a pure clastogen and do not exert aneugenic potential as opposed to MEL and CAB. MEL and CAB exert their aneugenic potential by the reduction of Aurora-B and survivin expression and by enhancing the expression of Aurora-A. γ-tubulin was upregulated in the presence of MEL. These findings show the implication of these proteins in chromosome delay events induced by MEL and CAB. On the other hand, the analogue EA-97 did not affect the expression of the above proteins.

Η Πακλιταξέλη (PTX) αποτελεί ένα ευρέως διαδεδομένο αντινεοπλασματικό φάρμακο και ενδείκνυται σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού, καρκίνο ωοθηκών, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και σε σάρκωμα Kaposi ασθενών με AIDS. Παρ’ όλα αυτά, η σημαντική τοξικότητα που εμφανίζει (μυελοκαταστολή, νευροτοξικότητα, αντιδράσεις υπερευαισθησίας), υπογραμμίζει την αναγκαιότητα για μορφοποίησή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων (DDS), με σκοπό τη μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών και την αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας του φαρμάκου. Τα πολυμερικά μικκύλια έχουν μελετεθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια ως Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων. Η ενσωμάτωση υπερπαραμαγνητικών νανοκρυσταλλιτών οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) στον πυρήνα των PTX-μικκυλίων, παρέχει τη δυνατότητα μαγνητικής στόχευσης του φαρμάκου στην επιθυμητή περιοχή δράσης, καθώς και τη θεραπεία του καρκίνου μέσω επαγωγής μαγνητικής υπερθερμίας, με την εφαρμογή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου. Επιπλεόν, η χρήση των SPIONs ως σκιαγραφικά μέσα (Τ2-contrast enhancement) στη μαγνητική τομογραφία πυρηνικού συντονισμού (MRI), εξασφαλίζει το πλεονέκτημα ταυτόχρονης διάγνωσης και θεραπείας (Theranostics), αποκαλύπτοντας την πολυλειτουργικότητα των συστημάτων αυτών. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς, έχοντας μικρό μέγεθος (100-200nm), θεωρούνται κατάλληλοι για να αποφύγουν την οψωνινοποίηση απο τις λιποπρωτεϊνες του αίματος, την επίθεση απο τα φαγοκύτταρα του Δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (RES) καθώς και την ταχεία νεφρική κάθαρση, με αποτέλεσμα την παρατεταμένη κυκλοφορία τους στο αίμα (stealth systems) και την εκλεκτική πρόσληψη τους απο τους συμπαγείς καρκινικούς όγκους, μέσω του φαινομένου της ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης (EPR effect). Οι ιδιότητες αυτές, καθιστούν τα συγκεκριμένα συστήματα πολύτιμα εργαλεία στον τομέα της νανοϊατρικής. Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματεύεται τη σύνθεση υδρόφοβων SPIONs μέσω της τεχνικής της θερμικής αποικοδόμησης. Μελετήθηκαν οι συνθετικές παράμετροι (πρόδρομη ένωση, ποσότητα ελαϊκού οξέος, θερμοκρασία και διάρκεια αντίδρασης, ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας κ.α) που επηρεάζουν το μέγεθος, το σχήμα και τη διασπορά του μεγέθους των σχηματιζομένων νανοκρυσταλλιτών (5-13nm, σ: 10-20%), καθώς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μαγνητική συμπεριφορά των υβριδικών νανονοφορέων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε σύνθεση υβριδικών νανοφορέων με εγκλωβισμό των SPIONs σε πολυμερικά μικκύλια. Η παρασκευή των υπερπαραμαγνητικών μικκυλίων επιτελέστηκε με την τεχνικη solvent diffusion and evaporation (nanoprecipitation), με χρήση του αμφίφιλου συμπολυμερούς πολυ(γαλακτικό οξύ)-πολυ(αιθυλενογλυκόλη) (PLA-PEG). Στον υδρόφοβο πυρήνα των μικκυλίων (PLA) δεσμεύονται υδρόφοβες ενώσεις (PTX, SPIONs), ενώ το υδρόφιλο κέλυφος (PEG) προσδίδει κολλοειδή σταθερότητα σε υδατικά μέσα (δομή πυρήνα-κελύφους). Διερευνήθηκαν διάφορες συνθετικές παράμετροι (μοριακό βάρος συμπολυμερούς, ποσότητα SPIONs, ρυθμός προσθήκης οργανικής φάσης κ.α) και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για την παρασκευή υπερπαραμαγνητικών μικκυλίων μεγέθους <200nm, με αξιοσημείωτη κολλοειδή σταθερότητα (μέχρι και έξι μήνες), σε συνθήκες παρόμοιες με αυτές του ανθρώπινου πλάσματος (pH: 7.4, ιοντική ισχύς: 0.15Μ). Στο επόμενο στάδιο της παρούσας εργασίας, μελετήθηκαν οι παράγοντες που επηρεάζουν τη φόρτωση-ενκαψυλίωση της PTX και των SPIONs στα πολυμερικά μικκύλια (ποσότητα PTX, ποσότητα και μέγεθος SPIONs, μοριακό βάρος PLA-PEG, ρυθμός προσθήκης οργανικής φάσης κ.α), σε φυσιολογικές συνθήκες (pH:7.4, ιοντική ισχύς: 0.15Μ). Αναπτύχθηκε πρωτόκολλο μέσω του οποίου έγινε κατορθωτός ο διαχωρισμός των μαγνητικών νανοφορέων απο τους μη μαγνητικούς, καθώς και ο υπολογισμός της φόρτωσης-ενκαψυλίωσης PTX και SPIONs ξεχωριστά, τόσο στους μαγνητικούς και μη μαγνητικούς νανοφορείς, όσο και στο μέιγμα αυτών. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς χαρακτηρίζονται απο εξαιρετικά υψηλή απόδοση ενκαψυλίωσης φαρμάκου (93 %wt.) και φόρτωση φαρμάκου που ανέρχεται στο 4.8 %wt. Oι αμιγώς μαγνητικοί νανοφορείς επιδεικνύουν υψηλή απόδοση ενκαψυλίωσης νανοκρυσταλλιτών (70 %wt.), ενώ η φόρτωση σε φάρμακο και SPIONs ανέρχεται σε 5.2 και 20 %wt. αντίστοιχα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις οι νανοφορείς, μεγέθους (υδροδυναμική διάμετρος) 170nm, χαρακτηρίζονται απο ικανοποιητική μαγνητική συμπεριφορά. Εξετάστηκε η επίδραση του μεγέθους των νανοκρυσταλλιτών στη μαγνητική συμπεριφορά των νανοφορέων. Οι αμιγώς μαγνητικοί νανοφορείς με μεγαλύτερο μέγεθος SPIONs παρουσιάζουν καλύτερη μαγνητική συμπεριφορά. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης του φαρμάκου σε PBS (0.14Μ, pH:7.4) στους 37oC και διερευνήθηκε η επίδραση της εφαρμογής εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου στην αποδέσμευση της PTX απο τους μαγνητικούς νανοφορείς (Triggered Drug Release). Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε ελεγχόμενη αποδέσμευση του φαρμάκου για 24 ώρες, σε συνθήκες που προσομοιάζουν με αυτές του πλάσματος. Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των νανοφορέων πραγματοποιήθηκε με HPLC, DLS, TGA, TEM και μαγνητοφόρηση. / Paclitaxel (PTX) is one of the most successful anticancer drugs against a broad range of solid tumors, such as metastatic breast cancer, ovarian cancer, non-small-cell lung cancer and AIDS-related Kaposi sarcoma. However, the serious systematic side effects of PTX (myelosuppression, neurotoxicity, hypersensitivity) underline the need for formulation of PTX in Drug Delivery Systems (DDS), in order to reduce the side effects and increase the bioavailability of the drug. Among DDS, polymeric micelles have drawn much attention due to their great flexibility in tuning drug solubility, micelle size, targeted drug delivery and stability. Incorporation of Superparamagnetic Iron Oxide Nanocrystals (SPIONs) inside the core of drug-loaded polymeric micelles, imparts to the final Drug Delivery System the prospect of physical (magnetic) targeting, intrinsic therapeutic function (hyperthermia-based cancer therapy under alternating external magnetic field), T2-based contrast enhancement in magnetic resonance imaging (MRI) and remotely triggered drug release. These core-shell polymeric micelles having small size (100-200nm), are considered appropriate for avoiding both opsonization, macrophages attack by ReticuloEndothelial System (RES) and rapid renal clearance, thus allowing micelles to be taken up preferably by solid tumors through Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect. Therefore, such nanoassemblies encode high potential in nanomedicine, due to their dual nature (Therapeutic+Diagnostic = Theranostics). In particular, we have studied the synthesis of organophilic SPIONs through thermal decomposition. The synthetic parameters (precursor, precursor:oleic acid ratio, reaction temperature and duration, heat rate, etc.) affecting the size, shape and size distribution of the nanocrystals have also been examined thoroughly, since they play a key-role concerning the magnetic behavior of the final hybrid. Nanosized SPIONs with narrow size distribution were synthesized (5-13nm, σ: 10-20%). The preparation of poly(lactic acid)-block-poly(ethyleneglycol) (PLA-PEG) micelles encapsulating hydrophobic SPIONs, by varying the molecular weight of the polymers, the amount of SPIONs and the addition rate during micelle assembly, has also been investigated. The core-shell superparamagnetic micelles were prepared through solvent diffusion and evaporation technique (nanoprecipitation). PTX and SPIONs are being incorporated into the micelle’s hydrophobic core (PLA) through hydrophobic interactions, whereas the hydrophilic shell (PEG) stabilizes the micelles in aqueous dispersions, optimizing their colloidal stability and providing prolonged circulating time. The optimum parameters were determined, conferring to the micelles (Hydrodynamic Diameter < 200nm) high colloidal stability (up to six months) at biorelevant conditions (pH:7.4, ionic strenght: 0.15M). The next phase of the present master thesis focused on studying the factors (amount of PTX and SPIONs, molecular weight of PLA-PEG, addition rate, etc.) affecting the Loading of PTX and SPIONs into the polymeric micelles and how they can be fine-tuned towards high drug loading, while retaining their size at a scale where long circulation would not be precluded. Through protocol establishment, we have managed to separate the magnetic and non magnetic micelles, and to determine individually the loading of PTX and SPIONs for magnetic, non magnetic micelles, as well as for the mixture of them. The micelles’ mixture exhibits very high Drug Encapsulation Efficiency (93 %wt.) and 4.8 %wt. Drug Loading (D.L). Magnetic nanocarriers display high Magnetic Encapsulation Efficiency (70 %wt.), with D.L and Magnetic Loading of 5.2 and 20 %wt. respectively, In both cases, micelles demonstrate adequate magnetic behavior and small sizes (hydrodynamic diameter: 170nm), under conditions which simulate with human plasma (pH:7.4, ionic strenght: 0.15M). The effect of SPIONs’ size on the magnetic behavior of hybrid colloids, was also examined. Magnetic nanocarriers encapsulating SPIONs of greater size exhibit better magnetic behavior. Finally, we have conducted Drug release studies in PBS (0.14M, pH:7.4) at 37oC. The effect of SPIONs presence on the release profile of PTX, including triggered drug-release by application of AC magnetic field, has also been investigated. PTX-magnetic micelles exhibit Controlled Drug release for 24 hours. Several techniques have been used for the characterization of such nanoassemblies, like: HPLC, DLS, TGA, TEM, XRD, Magnetophoresis and Triggered Drug release by application of AC magnetic field.