Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: The combination of natural and synthetic polymers allow for the synthesis of advanced hybrid copolymers. These hybrid copolymers have applications in biomedical areas, one such area being in drug delivery systems (DDS). In this study, a modular approach was used to prepare amphiphilic block copolymers with the ability to self-assemble into three dimensional structures. Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) was the synthetic tool used to mediate the polymerization of N-vinylpyrrolidone. RAFT is a versatile method to prepare polymers with control over molecular weight and dispersity. A xanthate chain transfer agent (CTA) was used to obtain the hydrophilic poly(N-vinylpyrrolidone) (PVP) block. An aldehyde functionality could be introduced due to the lability of the xanthate moiety, the procedure of which was effectively optimized to produce quantitative conversion. A dixanthate CTA was synthesized to produce a PVP chain which after the modification reaction, resulted in a α,ω-telechelic polymer. A polypeptide was synthesized via the ring-opening polymerization of Ncarboxyanhydrides (ROP NCA). The living and controllable ROP of NCAs is a method which results in polypeptides, but without a well-defined amino acid order. Poly(γ- benzyl-L-glutamate) (PBLG) was synthesized with a narrow dispersity (Đ = 1.10 – 1.15) using conditions that promote the retention of a terminal primary amine. A protected cysteine functionality was introduced via the terminal amine PBLG chain-end, using peptide synthesis techniques. This resulted in the conjugation of the aldehyde functional PVP and the cysteine terminal PBLG using a covalent, non-reducible thiazolidine linkage. The deprotection of the cysteine, more specifically the deprotection of the thiol was a non-trivial procedure. The thiol protecting acetamidomethyl (Acm) group could not be cleaved using traditional methods, but instead a modified procedure was developed to effectively remove the Acm group while inhibiting hydrolysis of the benzyl esters. It was determined that the conjugation reaction could effectively proceed in N,Ndimethylformamide (DMF) at a slightly elevated temperature and so continued to prepare the amphiphilic hybrid block copolymers, PVP-b-PBLG. A structurally different PBLG chain, namely PBLG-b-Cys was conjugated to the ω-aldehyde PVP and the conjugation efficiency was compared to our PBLG-Cys block. In the case of PBLG-b- Cys the in situ deprotection and conjugation as well as a two-step deprotection and conjugation reaction with PVP resulted in very low conjugation efficiency. The cysteine end-functional PBLG resulted in near quantitative conjugation with PVP. The critical micelle concentration (CMC) for PVP90-b-PBLG54 was determined to be 6 μg/mL, using fluorescence spectroscopy. Particle sizes were determined with TEM and DLS and found to range from 25 nm to 120 nm depending on the polymer block lengths as well as hydrophobic/hydrophilic block length ratios. Furthermore, when the micelles were subjected to an increased acidic environment, the labile benzyl ester bonds were hydrolyzed. This was observed with TEM where the particle sizes increased 10-fold to form vesicular structures. Hydrolysis was further confirmed with ATR-FTIR and 1H-NMR spectroscopy. Cytotoxicity tests confirmed that the copolymer micelles had good cell compatibility at high concentrations such as 0.9 mg/mL. Investigation into drug loading using a pyrene probe confirmed the viability of using PVP-b-PBLG as a responsive DDS. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die kombinasie van natuurlike en sintetiese polimere maak dit moontlik vir die sintese van gevorderde hibried kopolimere. Hierdie kopolimere het aanwending in biomediese gebiede, een so 'n gebied is in medisinale vervoer sisteme (MVS). 'n Modulêre benadering is in hierdie studie gebruik om amfifiliese blok kopolimere te berei. Omkeerbare addisie-fragmentasie kettingoordrag (OAFO) is gebruik as die sintetiese tegniek vir die polimerisasie van N-vinielpirolidoon (NVP). OAFO is 'n veelsydige metode om polimere te berei met beheer oor molekulêre gewig en dispersiteit (Đ). 'n Xantaat kettingoordrag agent (KOA) is gebruik om die hidrofiliese poli(N-vinielpirolidoon) (PVP) blok te sintetiseer. ‘n Aldehied endgroep was deur die terminale xantaat funksionaliteit berei, ‘n proses wat geoptimiseer is tot kwantitatiewe omsetting. 'n Di-xantaat KOA is gesintetiseer om, na modifikasie, 'n α, ω-telecheliese polimeer te produseer. Die polipeptied was gesintetiseer deur middel van ’n ringopening polimerisasie van Nkarboksianhidriede (ROP NKA). Die lewende en beheerbare ROP van NKAe is 'n metode wat lei tot polipeptiede sonder ’n gedefinieerde aminosuur volgorde. Poli(γ- benzyl-L-glutamaat) met 'n lae dispersiteit (Đ = 1.10 – 1.15), is gesintetiseer deur gebruik te maak van kondisies wat die behoud van 'n terminale primêre amien bevorder. 'n Beskermde sistien-funksionaliteit is ingebou via die terminale amien met behulp van peptiedsintese tegnieke. Die tiol beskerming van die asetamidometiel (Asm) groep kon nie gekleef word deur gebruik te maak van tradisionele metodes nie, maar ‘n nuwe proses is ontwikkel om die Asm groep te kleef sowel as om die hidrolise van die bensiel esters te inhibeer. Die koppelings reaksie het effektief verloop in DMF by 'n effens verhoogde temperatuur en sodoende is die amfifiliese hibried blok-kopolimere, PVP-b-PBLG berei. Twee verskillende PBLG kettings is gekoppel aan die ω-aldehied PVP en die koppeling doeltreffendheid is vergelyk. Daar is bevind dat net die sistien end-funksionele PBLG tot kwantitatiewe konjugasie kon lei. Die kritiese misel konsentrasie is bepaal vir PVP90-b-PBLG54 as 6 μg/mL met behulp van fluoressensie spektroskopie. Die deeltjie-groottes is bepaal met TEM en DLS en wissel van 25 nm tot 120 nm, afhangende van die polimeer bloklengtes sowel as hidrofobiese / hidrofiliese blok lengte verhoudings. Die miselle is blootgestel aan 'n verhoogde suur omgewing, wat tot die hidrolise van die bensiel ester groepe gelei het. TEM het getoon dat die deeltjie-groottes met 10-voud vergroot het tot vesikulêre strukture. Hidrolise is verder bevestig met ATR-FTIR en 1H-KMR spektroskopie. Sitotoksiese toetse het bevestig dat die miselle geen of min toksisiteit toon teenoor eukariotiese selle nie, selfs teen 'n hoë konsentrasies soos 0.9 mg/ml. Die medisinale behoud vermoë is met behulp van pireen bevestig en dus ook die potensiaal van PVP-b-PBLG as ‘n moontlike MVS.

Yes / Understanding the structure-property relationships of drug delivery system (DDS) components is critical for their development and the prediction of bodily performance. This study investigates the effects of introducing polyethylene oxide (PEO) homopolymers, over a wide range of molecular weights, into Pluronic injectable smart hydrogel formulations. These smart DDSs promise to enhance patient compliance, reduce adverse effects and dosing frequency. Pharmaceutically, Pluronic systems are attractive due to their unique sol-gel phase transition in the body, biocompatibility, safety and ease of injectability as solutions before transforming into gel matrices at body temperature. This paper presents a systematic and comprehensive evaluation of gelation and the interplay of microscopic and macroscopic properties under both equilibrium and non-equilibrium conditions in controlled environments, as measured by rheology in conjunction with time-resolved Small Angle Neutron Scattering (SANS). The non-equilibrium conditions investigated in this work offer a better understanding of the two polymeric systems’ complex interactions affecting the matrix thermo-rheological behaviour and structure and therefore the future release of an active pharmaceutical ingredient from the injectable DDS.

Η Πακλιταξέλη (PTX) αποτελεί ένα ευρέως διαδεδομένο αντινεοπλασματικό φάρμακο και ενδείκνυται σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού, καρκίνο ωοθηκών, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και σε σάρκωμα Kaposi ασθενών με AIDS. Παρ’ όλα αυτά, η σημαντική τοξικότητα που εμφανίζει (μυελοκαταστολή, νευροτοξικότητα, αντιδράσεις υπερευαισθησίας), υπογραμμίζει την αναγκαιότητα για μορφοποίησή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων (DDS), με σκοπό τη μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών και την αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας του φαρμάκου. Τα πολυμερικά μικκύλια έχουν μελετεθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια ως Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων. Η ενσωμάτωση υπερπαραμαγνητικών νανοκρυσταλλιτών οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) στον πυρήνα των PTX-μικκυλίων, παρέχει τη δυνατότητα μαγνητικής στόχευσης του φαρμάκου στην επιθυμητή περιοχή δράσης, καθώς και τη θεραπεία του καρκίνου μέσω επαγωγής μαγνητικής υπερθερμίας, με την εφαρμογή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου. Επιπλεόν, η χρήση των SPIONs ως σκιαγραφικά μέσα (Τ2-contrast enhancement) στη μαγνητική τομογραφία πυρηνικού συντονισμού (MRI), εξασφαλίζει το πλεονέκτημα ταυτόχρονης διάγνωσης και θεραπείας (Theranostics), αποκαλύπτοντας την πολυλειτουργικότητα των συστημάτων αυτών. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς, έχοντας μικρό μέγεθος (100-200nm), θεωρούνται κατάλληλοι για να αποφύγουν την οψωνινοποίηση απο τις λιποπρωτεϊνες του αίματος, την επίθεση απο τα φαγοκύτταρα του Δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (RES) καθώς και την ταχεία νεφρική κάθαρση, με αποτέλεσμα την παρατεταμένη κυκλοφορία τους στο αίμα (stealth systems) και την εκλεκτική πρόσληψη τους απο τους συμπαγείς καρκινικούς όγκους, μέσω του φαινομένου της ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης (EPR effect). Οι ιδιότητες αυτές, καθιστούν τα συγκεκριμένα συστήματα πολύτιμα εργαλεία στον τομέα της νανοϊατρικής. Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματεύεται τη σύνθεση υδρόφοβων SPIONs μέσω της τεχνικής της θερμικής αποικοδόμησης. Μελετήθηκαν οι συνθετικές παράμετροι (πρόδρομη ένωση, ποσότητα ελαϊκού οξέος, θερμοκρασία και διάρκεια αντίδρασης, ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας κ.α) που επηρεάζουν το μέγεθος, το σχήμα και τη διασπορά του μεγέθους των σχηματιζομένων νανοκρυσταλλιτών (5-13nm, σ: 10-20%), καθώς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μαγνητική συμπεριφορά των υβριδικών νανονοφορέων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε σύνθεση υβριδικών νανοφορέων με εγκλωβισμό των SPIONs σε πολυμερικά μικκύλια. Η παρασκευή των υπερπαραμαγνητικών μικκυλίων επιτελέστηκε με την τεχνικη solvent diffusion and evaporation (nanoprecipitation), με χρήση του αμφίφιλου συμπολυμερούς πολυ(γαλακτικό οξύ)-πολυ(αιθυλενογλυκόλη) (PLA-PEG). Στον υδρόφοβο πυρήνα των μικκυλίων (PLA) δεσμεύονται υδρόφοβες ενώσεις (PTX, SPIONs), ενώ το υδρόφιλο κέλυφος (PEG) προσδίδει κολλοειδή σταθερότητα σε υδατικά μέσα (δομή πυρήνα-κελύφους). Διερευνήθηκαν διάφορες συνθετικές παράμετροι (μοριακό βάρος συμπολυμερούς, ποσότητα SPIONs, ρυθμός προσθήκης οργανικής φάσης κ.α) και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για την παρασκευή υπερπαραμαγνητικών μικκυλίων μεγέθους <200nm, με αξιοσημείωτη κολλοειδή σταθερότητα (μέχρι και έξι μήνες), σε συνθήκες παρόμοιες με αυτές του ανθρώπινου πλάσματος (pH: 7.4, ιοντική ισχύς: 0.15Μ). Στο επόμενο στάδιο της παρούσας εργασίας, μελετήθηκαν οι παράγοντες που επηρεάζουν τη φόρτωση-ενκαψυλίωση της PTX και των SPIONs στα πολυμερικά μικκύλια (ποσότητα PTX, ποσότητα και μέγεθος SPIONs, μοριακό βάρος PLA-PEG, ρυθμός προσθήκης οργανικής φάσης κ.α), σε φυσιολογικές συνθήκες (pH:7.4, ιοντική ισχύς: 0.15Μ). Αναπτύχθηκε πρωτόκολλο μέσω του οποίου έγινε κατορθωτός ο διαχωρισμός των μαγνητικών νανοφορέων απο τους μη μαγνητικούς, καθώς και ο υπολογισμός της φόρτωσης-ενκαψυλίωσης PTX και SPIONs ξεχωριστά, τόσο στους μαγνητικούς και μη μαγνητικούς νανοφορείς, όσο και στο μέιγμα αυτών. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς χαρακτηρίζονται απο εξαιρετικά υψηλή απόδοση ενκαψυλίωσης φαρμάκου (93 %wt.) και φόρτωση φαρμάκου που ανέρχεται στο 4.8 %wt. Oι αμιγώς μαγνητικοί νανοφορείς επιδεικνύουν υψηλή απόδοση ενκαψυλίωσης νανοκρυσταλλιτών (70 %wt.), ενώ η φόρτωση σε φάρμακο και SPIONs ανέρχεται σε 5.2 και 20 %wt. αντίστοιχα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις οι νανοφορείς, μεγέθους (υδροδυναμική διάμετρος) 170nm, χαρακτηρίζονται απο ικανοποιητική μαγνητική συμπεριφορά. Εξετάστηκε η επίδραση του μεγέθους των νανοκρυσταλλιτών στη μαγνητική συμπεριφορά των νανοφορέων. Οι αμιγώς μαγνητικοί νανοφορείς με μεγαλύτερο μέγεθος SPIONs παρουσιάζουν καλύτερη μαγνητική συμπεριφορά. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης του φαρμάκου σε PBS (0.14Μ, pH:7.4) στους 37oC και διερευνήθηκε η επίδραση της εφαρμογής εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου στην αποδέσμευση της PTX απο τους μαγνητικούς νανοφορείς (Triggered Drug Release). Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε ελεγχόμενη αποδέσμευση του φαρμάκου για 24 ώρες, σε συνθήκες που προσομοιάζουν με αυτές του πλάσματος. Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των νανοφορέων πραγματοποιήθηκε με HPLC, DLS, TGA, TEM και μαγνητοφόρηση. / Paclitaxel (PTX) is one of the most successful anticancer drugs against a broad range of solid tumors, such as metastatic breast cancer, ovarian cancer, non-small-cell lung cancer and AIDS-related Kaposi sarcoma. However, the serious systematic side effects of PTX (myelosuppression, neurotoxicity, hypersensitivity) underline the need for formulation of PTX in Drug Delivery Systems (DDS), in order to reduce the side effects and increase the bioavailability of the drug. Among DDS, polymeric micelles have drawn much attention due to their great flexibility in tuning drug solubility, micelle size, targeted drug delivery and stability. Incorporation of Superparamagnetic Iron Oxide Nanocrystals (SPIONs) inside the core of drug-loaded polymeric micelles, imparts to the final Drug Delivery System the prospect of physical (magnetic) targeting, intrinsic therapeutic function (hyperthermia-based cancer therapy under alternating external magnetic field), T2-based contrast enhancement in magnetic resonance imaging (MRI) and remotely triggered drug release. These core-shell polymeric micelles having small size (100-200nm), are considered appropriate for avoiding both opsonization, macrophages attack by ReticuloEndothelial System (RES) and rapid renal clearance, thus allowing micelles to be taken up preferably by solid tumors through Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect. Therefore, such nanoassemblies encode high potential in nanomedicine, due to their dual nature (Therapeutic+Diagnostic = Theranostics). In particular, we have studied the synthesis of organophilic SPIONs through thermal decomposition. The synthetic parameters (precursor, precursor:oleic acid ratio, reaction temperature and duration, heat rate, etc.) affecting the size, shape and size distribution of the nanocrystals have also been examined thoroughly, since they play a key-role concerning the magnetic behavior of the final hybrid. Nanosized SPIONs with narrow size distribution were synthesized (5-13nm, σ: 10-20%). The preparation of poly(lactic acid)-block-poly(ethyleneglycol) (PLA-PEG) micelles encapsulating hydrophobic SPIONs, by varying the molecular weight of the polymers, the amount of SPIONs and the addition rate during micelle assembly, has also been investigated. The core-shell superparamagnetic micelles were prepared through solvent diffusion and evaporation technique (nanoprecipitation). PTX and SPIONs are being incorporated into the micelle’s hydrophobic core (PLA) through hydrophobic interactions, whereas the hydrophilic shell (PEG) stabilizes the micelles in aqueous dispersions, optimizing their colloidal stability and providing prolonged circulating time. The optimum parameters were determined, conferring to the micelles (Hydrodynamic Diameter < 200nm) high colloidal stability (up to six months) at biorelevant conditions (pH:7.4, ionic strenght: 0.15M). The next phase of the present master thesis focused on studying the factors (amount of PTX and SPIONs, molecular weight of PLA-PEG, addition rate, etc.) affecting the Loading of PTX and SPIONs into the polymeric micelles and how they can be fine-tuned towards high drug loading, while retaining their size at a scale where long circulation would not be precluded. Through protocol establishment, we have managed to separate the magnetic and non magnetic micelles, and to determine individually the loading of PTX and SPIONs for magnetic, non magnetic micelles, as well as for the mixture of them. The micelles’ mixture exhibits very high Drug Encapsulation Efficiency (93 %wt.) and 4.8 %wt. Drug Loading (D.L). Magnetic nanocarriers display high Magnetic Encapsulation Efficiency (70 %wt.), with D.L and Magnetic Loading of 5.2 and 20 %wt. respectively, In both cases, micelles demonstrate adequate magnetic behavior and small sizes (hydrodynamic diameter: 170nm), under conditions which simulate with human plasma (pH:7.4, ionic strenght: 0.15M). The effect of SPIONs’ size on the magnetic behavior of hybrid colloids, was also examined. Magnetic nanocarriers encapsulating SPIONs of greater size exhibit better magnetic behavior. Finally, we have conducted Drug release studies in PBS (0.14M, pH:7.4) at 37oC. The effect of SPIONs presence on the release profile of PTX, including triggered drug-release by application of AC magnetic field, has also been investigated. PTX-magnetic micelles exhibit Controlled Drug release for 24 hours. Several techniques have been used for the characterization of such nanoassemblies, like: HPLC, DLS, TGA, TEM, XRD, Magnetophoresis and Triggered Drug release by application of AC magnetic field.