Μελέτες έχουν δείξει ότι το νευροστεροειδές διυδροεπιανδροστερόνη (DHEA) προστατεύουν τους νευρώνες από ανοξία και απόπτωση. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι το DHEA ενισχύει την κινητική δραστηριότητα πιθήκων με τη νόσο του Parkinson, ενώ επίσης σε συνδυασμό με την αλλοπρεγνανολόνη προκαλεί δημιουργία νευρώνων σε αρκετά πειραματικά μοντέλα. Τα λιποσώματα είναι σφαιρικά σωματίδια αποτελούμενα από ενυδατωμένες διπλοστοιβάδες φωσφολιπιδίων οι οποίες σχηματίζονται αυθόρμητα κατά τη διασπορά λιπιδίων στο νερό, εγκλωβίζοντας υδατικό διάλυμα στο εσωτερικό τους. Οι κυκλοδεξτρίνες είναι ολιγοσακχαρίτες με ειδική δομή κώνου, που έχουν υδρόφιλη πολική επιφάνεια και μη πολική εσωτερική κοιλότητα, έχουν τη δυνατότητα να ενσωματώνουν λιπόφιλα φάρμακα στην εσωτερική τους κοιλότητα (με τη δημιουργία συμπλόκων) και να αυξάνουν την υδατική διαλυτότητά τους. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τρία παράγωγα του νευροστεροειδούς DHEA, που έχουν τροποποιηθεί στις θέσεις C3 και C17 με σκοπό να βελτιώσουν την αντιαποπτωτική και νευροπροστατευτική δράση τους, καθώς και την αναστολή της μετατροπής τους σε ανδρογόνα και οιστρογόνα. Τα παράγωγα αυτά είναι εξαιρετικά λιπόφιλα και έχουν μικρό μοριακό βάρος και πολύ χαμηλή διαλυτότητα, γεγονός που καθιστά αδύνατη την χορήγησή τους. Για να αντιμετωπιστεί το πρόβλημα της χαμηλής διαλυτότητας, δοκιμάστηκαν δύο μέθοδοι: (1) H παρασκευή σύμπλοκων με υδροξυ-προπυλ-β-κυκλοδεξτρίνη (HP-beta-CD), και (2) Η ενσωμάτωσν των νευροστεροειδών στη λιπιδική μεμβράνη μικρών μονοστoιβαδιακών λιποσωμάτων (SUV) διαφόρων λιπιδικών συστάσεων. Μετά από τροποποίηση μιας ειδικής τεχνικής μέτρησης των στεροειδών, υπολογίστηκαν οι συγκετρώσεις που ενσωματώθηκαν στα λιποσώματα, καθώς και στα σύμπλοκα με τη κυκλοδεξτρίνη. Οι λιποσωμικές μορφές των παραγώγων δεν είχαν την αναμενόμενη ικανότητα ενσωμάτωσης τους, με αποτέλεσμα η συγκέντρωση των λιποσωμικών διαπορών να μην είναι αρκετά υψηλή για in vivo χορήγηση. Αντίθετα η HP-β-CD έδωσε σύμπλοκα που αύξησαν την υδατική διαλυτότητα των παραγώγων θεαματικά.Τα σύμπλοκα χαρακτηρίστηκαν με διάφορες τεχνικές, για να πιστωποιηθεί ο σχηματισμός τους. Με σκοπό να παρασκευαστούν μορφές με δυνατότητα ελεγχόμενης αποδέσμευσης των στεροειδών, μελετήθηκε στο επόμενο στάδιο της διατριβής, η ανάπτυξη υβριδικών μορφών που περιλαμβάνουν τον συνδυασμό συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης και λιποσωμάτων, δηλαδή: λιποσώματα που στην εσωτερική τους κοιλότητα εγκλωβίζουν τα υδατοδιαλυτά σύμπλοκα των παραγώγων με κυκλοδεξτρίνες. Τα υβριδικά αυτά συστήματα είχαν αυξημένη ενσωμάτωση των νευροστεροειδών σε σύγκριση με τα συμβατικά λιποσώματα και κατάλληλα χαρακτηριστικά για in vivo χορήγηση. / Studies have shown that the neuroactive steroid dehydroepiandrosterone (DHEA) protects neurons from anoxia and apoptosis. It has also been demonstrated that DHEA is able to potentiate locomotor activity of hemi – Parkinsonian monkeys, and in conjunction with allopregnanolone can induce neurogenesis in various experimental models. Liposomes are spherical particles composed of hydrated bilayers of phospholipids which are formed spontaneously during the dispersion of lipids in water, entrapping aqueous solution inside. Cyclodextrins are oligosaccharides with specific cone structure that have the ability to incorporate lipophilic drugs and increase their aqueous solubility. In the present study, three DHEA analogues were used, which have been modified at positions C3 and C17 in order to improve the antiapoptotic and neuroprotective activity, and to inhibit of their conversion into androgens and estrogens. These derivatives are highly lipophilic and have small molecular weight. In order to find a solution for their very low aqueous solubility which is a problem for their in vivo administration, two methodologies were investigated: (1) The formation of soluble complexes with hydroxy-propyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD), and (2) the incorporation of the steroids in the lipid bilayer of small unilamellar liposomes (SUV) of various lipid compositions. After adjusting a special measurement technique for the neurosteroids, we calculated the concentration of the neurosteroids incorporated into liposomes, as well as in complexes with the cyclodextrin.The liposomal forms of the derivatives did not have the expected integration ability, resulting in a concentration of liposomal dispersion which is not high enough for in vivo administration. On the other hand, the HP-β-CD complexes increased the aqueous solubility of the derivatives to a significant extent. The complexes were characterized by various techniques, in order to verify their existence. With the aim of preparing formulations with the ability of controlled release of steroids, we investigated in the last part of this thesis, the possibility to develop hybrid systems that consist of liposomes which entrap the highly soluble steroid-cyclodextrin complexes in their internal cavity. These hybrid systems had better integration capacity compared to conventional liposomes and were suitable for in vivo administration (for both intravenous and intravitreal administration). These hybrid systems can also ensure controlled release of the steroid analogues.

Είναι γνωστό ότι τα λιποσώματα παρέχουν πολλά πλεονεκτήματα για τη χορήγηση και /ή τη στόχευση φαρμάκων (Lasic 1993, Gregoriadis 1988). Κατά τη χορήγηση λιποσωμικών φαρμακομορφών για τοπική (topical) εφαρμογή ή εφαρμογή σε επιθήλια (mucosal) (Rollan 1993, Schreier and Bouwstra 1994) είναι απαραίτητο οι ρεολογικές και βλεννοσυγκολητικές ιδιότητες των λιποσωμικών διασπορών να ρυθμίζονται ανάλογα με την επιδιωκόμενη οδό χορήγησης. Αυτό μπορεί εύκολα να επιτευχθεί με τη προσθήκη παραγόντων αύξησης ιξώδους (gelling agents) στις λιποσωμικές διασπορές. Συνεπώς προκύπτουν σύνθετες φαρμακοτεχνικές μορφές που από δομικής σύστασης είναι διασπορές λιποσωμικών μορφών φάρμακων σε συστήματα γελών (drug-in-liposome-in-gel). Ανάλογα με το βαθμό συγκράτησης του φαρμάκου στα λιποσώματα μετά τη διασπορά των λιποσωμάτων στην επιθυμητή φαρμακοτεχνική μορφή, μπορεί να τροποποιηθεί και ο ρυθμός απελευθέρωσης του φαρμάκου από τέτοια συστήματα. Αυτό συνδέεται σε μεγάλο βαθμό κυρίως με δύο ομάδες παραγόντων: • Πρώτον με τη σταθερότητα των λιποσωμάτων (ακεραιότητα μεμβράνης και μηχανική σταθερότητα) κατά τη διασπορά σε ημι-στερεές φαρμακοτεχνικές μορφές, κάτι το οποίο συνδέεται τόσο με την σκληρότητα (rigidity) της μεμβράνης του λιποσωμικού φορέα όσο και με τις φυσικές ιδιότητες του ημι-στερεού συστήματος (ιξώδες και ρεολογικές ιδιότητες). • Δεύτερον, με τις φυσικοχημικές ιδιότητες του προς μορφοποίηση φάρμακου. Όσο πιο λιπόφιλο είναι ένα φάρμακο και όσο μικρότερη η διαλυτότητα του στο νερό, τόσο μεγαλύτερος θα είναι λογικά ο χρόνος συγκράτησης του στις λιπιδικές διπλοστοιβάδες των λιποσωμάτων συγκριτικά με αμφίφιλα φάρμακα που έχουν σημαντικά υψηλότερη διαλυτότητα στο νερό. Επειδή σε ανάλογα σύνθετα (φάρμακο-σε-λιπόσωμα-σε-γέλες) συστήματα χορήγησης είναι πιθανόν να πρέπει να συνυπάρχουν εκτός από τον παράγοντα αύξησης του ιξώδους και άλλα έκδοχα, κυρίως παράγοντες που αυξάνουν τη διαλυτότητα διάφορων ουσιών ή επιφανειοδραστικά, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εξέταση της επίδρασης τέτοιων εκδοχών κατά την προσθήκη τους στα παραπάνω συστήματα. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκε η επίδραση των εξής εκδόχων: Transcutol, Propylene-glycol, Cremophor και Labrafac στη σταθερότητα λιποσωμικών μορφών φαρμάκων και στο ρυθμό απελευθέρωσης υδρόφιλων και λιπόφιλων μορίων από συστήματα διασποράς λιποσωμικών μορφών τέτοιων ουσιών σε γέλες (drug-in-liposome-in-gel). Τα έκδοχα αυτά μόνα ή σε συνδυασμό μεταξύ τους καθως και σε συνδυασμό με άλλους φορείς προσφέρονται για την παρασκευή κατάλληλων φαρμακοτεχνικών μορφών που αποβλέπουν στην αύξηση διαλυτότητας, απορρόφησης και τελικά της βιοδιαθεσιμότητας δυσδιάλυτων φαρμάκων Για την εκτίμηση του βαθμού επίδρασης των πιο πάνω αναφερθέντων εκδοχών στη σταθερότητα λιποσωμικών μορφών φαρμάκων και στο ρυθμό απελευθέρωσης τόσο των υδρόφιλων όσο και λιπόφιλων φάρμακων από συστήματα διασποράς λιποσωμικών μορφών τους σε γέλες (drug-in-liposome-in-gel). χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο υδρόφιλων μορίων η καλσεΐνη ενώ ως μοντέλο υδρόφοβων ουσιών η γκριζεοφουλβίνη. Εδώ ως παράγοντες αύξησης του ιξώδους για την παρασκευή των σύνθετων φαρμακευτικών μορφών, φάρμακο-σε-λιπόσωμα-σε-γέλες χρησιμοποιήθηκαν: (Ι) το πολυμερές του ακρυλικού οξέος, carbopol 974PNF, (ΙΙ) το πολυμερές υδροξυ-αιθυλ-κυτταρίνης (HEC-Hydroxyethylcellulose) καθως και (ΙΙΙ) μίγμα των δυο πολυμερών. Γενικά από τη μελέτη αυτή συμπεραίνουμε ότι: Η επίδραση των προς εξέταση παραγόντων στη σταθερότητα των λιποσωμάτων εξαρτάται από: τη λιπιδική σύσταση, την προσθήκη χοληστερόλης κατά την παρασκευή των λιποσωμάτων, τη λιποφιλικότητα του εκδόχου και τη συγκέντρωσή του. Σχετικά με τη σταθερότητα των λιποσωμάτων παρουσία των εκδόχων που μελετήθηκαν: 1. Tα PC λιποσώματα σπάνε πολύ εύκολα με και χωρίς την παρουσία των εκδοχών στο φορέα υδρογέλης. 2. Τα πιο ανθεκτικά λιποσώματα DSPC/Chol 1:1 φαίνεται να έχουν μεγαλύτερη σταθερότητα. Όμως και στις δυο περιπτώσεις (PC και DSPC/Chol) η σταθερότητα των λιποσωμάτων στους παράγοντες αυτούς μειώνεται ακολουθώντας την εξής σειρά: Transcutol ≈ Propylene-glycol < Cremophor < Labrafac. 3. To Labrafac διαταράσσει στο μεγαλύτερο βαθμό τις λιπιδικές διπλοστοιβάδες προκαλώντας τη μεγαλύτερη διαρροή των εγκλωβισμένων μορίων προκαλώντας σημαντικές δομικές μεταβολές στα λιποσώματα. 4. H χοληστερόλη αυξάνει την σταθερότητα των λιποσωμάτων κυρίως παρουσία των εκδοχών με μια σχετική ασθενή δράση αλλά όχι σημαντικά παρουσία του εκδόχου Labrafac. Σχετικά με τη κινητική απελευθέρωσης ουσιών από λιποσωμικές τους μορφές που διασπείρονται σε γέλες παρουσία των εκδόχων που μελετήθηκαν: 1. Ένα σημαντικό εύρημα είναι ότι υπάρχει μεγάλη διαφορά στη συμπεριφορά απελευθέρωσης λιπόφιλων και υδρόφιλων μορίων από λιποσωμικές μορφές τους όταν τα τελευταία διασπείρονται σε συστήματα υδρογέλων παρουσία και απουσία των εκδόχων καθως και στη μεταξύ τους απελευθέρωση. 2. Σε γενικές γραμμές η απελευθέρωση των εγκλωβισμένων στα λιποσώματα ουσιών, όταν αυτά διασπείρονται στις γέλες που περιέχουν έκδοχα, φαίνεται να συνδέεται-επηρεάζεται από τη σταθερότητα των λιποσωμάτων παρουσία αυτών των εκδόχων, όπως ευρέθηκε στο πρώτο μέρος της μελέτης. Η κινητική απελευθέρωσης λιπόφιλων φαρμάκων από σύνθετα συστήματα όπως αυτά που μελετήθηκαν μπορεί να επιβραδύνεται σημαντικά όταν μέσα στις μορφές προστίθενται έκδοχα με υψηλή λιπόφιλα (Labrafac- γκριζεοφουλβίνη) (πιθανή κατανομή της γκριζεοφουλβίνης σε λιπόφιλες περιοχές). Κλείνοντας επισημαίνουμε ότι η ανακάλυψη νέων συστημάτων χορήγησης φαρμάκων αποτελεί σήμερα τη μεγαλύτερη πρόκληση για τους επιστήμονες. Οι πιο πάνω φορείς συγκαταλέγονται ανάμεσα στα πιο σπουδαία συστήματα χορήγησης φαρμάκων όχι μόνο λόγω συμβατότητας τους ως προς το ανθρώπινο οργανισμό αλλά και εξαιτίας της μεγάλης δυνατότητας εφαρμογών που προσφέρουν. Απώτερος σκοπός αυτής της μελέτης είναι η καταχώρηση στη βιβλιογραφία νέων στοιχείων σχετικά με την επίδραση αυτών των εκδοχών και συνεπώς η διευκόλυνση κατά την επιλογή των καταλληλότερων συνδυασμών φορέων-εκδοχών στο σχεδιασμό επιθυμητών φαρμακοτεχνικών μορφών. / It is well known that liposomes offer many advantages for the delivery and/or targeting of drugs (Lasic 1993, Gregoriadis 1988). When mucosal or topical delivery of liposomal formulations is considered (Rollan 1993, Schreier and Bouwstra, 1994), it is essential that rheological and/or mucoadhesive properties of the liposome dispersions are adjusted accordingly, depending on the intended route of administration. This can be easily dome by adding gelling agents in the liposomal dispersions. Thereby, eventually a drug-in-liposome-in gel complex formulation is developed. Depending on the retention of the drug in the liposomes after the liposomes are dispersed in the preferred formulation, the release rate of the drug may be modified. This is highly related with two major groups of factors; • First the stability of the liposomes (membrane integrity and mechanical stability) during dispersion in the semi-solid formulation that may be related to the vesicle-membrane rigidity as well as the semisolid system physical properties (viscosity and rheological properties). • Second, the physicochemical properties of the drug formulated. A more lipophilic drug with low aqueous solubility should be logically retained for longer time periods in liposome lipid bilayers when compared with amphiphillic drugs with considerable high aqueous solubility (that will be the driving force to move drug molecules to partition in the aqueous environments until saturation occurs). In some cases, in addition to the gelling agents it is essential to have also other excipients in the complex drug-in-liposome-in-gel systems, as solubilizers, surfactants, co-surfactants et.c. Herein, we evaluate the effect of such excipients on the release of drugs from complex systems. We chose to use trancutol, propylene glycol, cremophor and labrafac-hydro, that are commonly used excipients in pharmaceutical formulations. In order to evaluate the extent to which these compounds can affect the release rate of drugs from drug-in-liposome-in-gel systems we followed the release of two model compounds, one hydrophilic dye (calcein) and one lipophilic drug (griseofulvin). The effect of the rigidity of liposomal membranes was evaluated by testing two different liposome lipid compositions for each case of encapsulated compounds, one that is known to be what is called “leaky”, which is the plain PC (egg lecithin) composition, and one which is very rigid, which is the DSPC/Chol (1:1 mol/mol) composition. Additionally, we also evaluated the effect of the gel composition and characteristics, by studying the release of both drugs from liposomes that have been dispersed in systems with different properties. For this we used gels composed of the acrylic acid based polymer Carbopol 974, which is a substance of many commercially available semisolid formulations, at two different concentrations (same rheological properties and different viscosity) as well as a cellulose based gel, composed of hydroxyethyl-cellulose (different rheological properties). Additionally we evaluated also a mixture of the two polymers, which has been proposed as a formulation base with several advantages, for vaginal delivery of drugs. In addition, we studied the stability of liposomes during incubation in the presence of the plain excipients (in 2 different concentrations, 10% and 25%) in order to see if this can be correlated on the effect of the same agents on drug release from the complex systems. The general conclusion extracted from the experimental results of this study is that the effect of the excipients on liposome stability depend on (i) the lipid composition of the liposomal membranes, (ii) the inclusion of cholesterol in the liposomes or not, (iii) the lipophilicity of the excipient and (iv) the concentration of the excipient. More analytically: In respect to liposome stability: 1. PC liposomes are easily disrupted with or without the presence of the excipients in the gels. 2. The very rigid DSPC/Chol (1:1 mol/mol) liposomes demonstrate higher stability. 3. In both cases the effect of the excipients follows the sequence: Transcutol ≈ Propylene-glycol < Cremophor < Labrafac. 4. Labrafac has the highest effect on liposome stability it practically dissolves liposomal membranes. 5. Cholesterol inclusion in liposomal membranes results in increased stability, however even the most stable DSPC/Chol (1:1) liposomes are very unstable in presence of Labrafac. In respect to the release of liposomal drugs from the complex systems in presence of the excipients studied: 3. A significant finding is that there is a difference in the release pattern and rate between lipophilic and hydrophilic liposome-encapsulated molecules, in the presence of excipient or not (control studies).. 4. In general, there seems to be a correlation between the stability of liposomes in presence of excipients and the effect that the specific excipient has on the release kinetics of liposome encapsulated molecules from complex drug-in-liposome-in-gel systems. 5. The release of lipophilic molecules (that are encapsulated in the lipospmes) from complex systems can be substantially sustained when lipophilic excipients are added in the gel (as is the case of griseofulvin and labrafac). Concluding, we stress the fact that the invention of new drug delivery systems with better performance is a great challenge for scientists involved in pharmaceutics. The systems studied here are offering many advantages due to their biocompatible nature and the extended number of applications they may have. The final scope of this study is the entry of new data about the effect of excipients on the properties of complex drug delivery systems. As the availability similar data in the related literature increases, it will become more easy to make the best selection of excipients during the development of better formulations for existing of new drugs.

Τις τελευταίες δεκαετίες υπάρχει μια αυξανόμενη ζήτηση για βιοσυμβατά υλικά ικανά να χρησιμοποιηθούν σαν πρόσθετα στο ανθρώπινο σώμα, σαν βάσεις για ελεγχόμενη χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων, σαν εμφυτεύματα κ.α. χωρίς να προκαλούν ανοσοποιητική αντίδραση από τον αργανισμό. Μέχρι και σήμερα δεν έχει βρεθεί το υλικό που θα ξεγελάσει τους αμυντικούς μηχανισμούς του σώματος, με άλλα λόγια, να είναι αόρατο από το σώμα. Έχουν γίνει πολλές προσπάθειες και έχουν εφαρμοστεί διάφορες προσεγγίσεις. Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερες ερευνητικές ομάδες επενδύουν σε υλικά τα οποία απελευθερώνουν ελεγχόμενα βιοδραστικές ουσίες που καταστέλουν την αντίδραση του οργανισμού. Μια τέτοια ουσία είναι η ηπαρίνη, ένα φυσικό αντιπηκτικό το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αύξηση της αιμοσυμβατότητας αρτηριακών ενδοπροσθέσεων. Αναπτύξαμε μια μέθοδο για την ομοιοπολική, μη αναστρέψιμη πρόσδεση λιποσωμάτων σε μεταλλικές επιφάνειες, οι οποίες έχουν υποστεί επεξεργασία με τεχνολογία πλάσματος. Οι επιφάνειες φέρουν ελεύθερες καρβοξυλομάδες τις οποίες μπορούμε να εκμεταλλευτούμε για να συζεύξουμε πάνω τους λιποσώματα με αμινομάδες στην επιφάνειά τους (functionalized), μέσω δημιουργίας αμιδικού δεσμού. Οι μεταλλικές επιφάνειες που χρησιμοποιήσαμε ήταν SS-316 μεταλλικοί δίσκοι επεξεργασμένοι με τεχνολογία πλάσματος, και τις προμηθευτήκαμε από το Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών και από το τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου του Μπάρι. Χρησιμοποιήσαμε μικρά μονοστιβαδιακά λιποσώματα (SUV) διαμέτρου της τάξης των 100 nm, με διάφορες λιπιδικές συστάσεις (PC, PC:Chol 4:1, DSPC:Chol 2:1). Χαρακτηρίσαμε τα functionalized λιποσώματά ως προς την ικανότητά τους να εγκλωβίζουν ηπαρίνη, το μέγεθος, τη διασπορά μεγέθους, το φορτίο της επιφάνειάς τους και τη σταθερότητά τους σε διάφορες συνθήκες. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι γενικά τα functionalized λιποσώματα συμπεριφέρονται σαν τυπικά λιποσώματα που φέρουν λιπίδιο με PEG ομάδα (pegylated λιποσώματα), ενώ για βέλτιστο εγκλωβισμό ηπαρίνης σημαντικό είναι το στάδιο λυοφιλοποίησης / επανασύστασης κατά την παρασκευή τους. Αποδείξαμε ότι τα functionalized λιποσώματα μπορούν να προσδεθούν σε μεταλλικές επιφάνειες (κατάλληλα επεξεργασμένες) διατηρώντας τη δομή τους και φέροντας ηπαρίνη ή άλλη υδρόφιλη ουσία στο εσωτερικό τους. Εφαρμόσαμε ένα απλό πρωτόκολλο δημιουργίας αμιδικού δεσμού, και το βελτιστοποιήσαμε ώστε να πάρουμε μέγιστη απόδοση στη σύνδεση των λιποσωμάτων στις επιφάνειες (58,4 ± 8.6 μg λιπιδίου ανά cm2 επιφάνειας). / Over the last couple of decades there has been an increasing need for more biocompatible, more “body friendly” materials that can be used in cases of subcutaneous, endoarterial or other type of implantations, as artificial body parts, drug releasing bases or biosensor implantations. The main desired quality of these materials is the lack to trigger the body’s defensive mechanisms and foreign body response reactions. Up to this date there has not been a material with the ability to camouflage itself and be invisible to the human body. Lately, scientists show an increasing interest in materials that can elute bioactive molecules, which can suppress the body’s immune reactions. One substance with this capability is heparin, a natural anticoagulant that can (and is currently being) used in order to improve the haemocombatibility of stents. We developed a method to covalently attach liposomes on metallic surfaces that have been treated with plasma technology so that they demonstrate free carboxyl- groups. We can manipulate these groups to attach amino-group containing liposomes (functionalized) on the metallic surfaces via amidic bond formation. The metallic surfaces that were used were SS-316 metallic rods treated with plasma. They were provided by two different research laboratories, one in the University of Patras (department of Chemical Engineering) and one in the University of Bari (department of Chemistry). The two groups employed different plasma treatment procedures. We used Small Unilamellar Vesicles (SUV liposomes) whose diameter was in the range of 100 nm and were consisted of various lipid compositions (PC, PC:Chol 4:1, DSPC:Chol 2:1). The functionalized liposomes were physicochemically characterized (size, size distribution, ζ potential, drug retention) under various conditions. We discovered that the amino-liposomes demonstrate typical pegylated liposome behavior. Moreover, we found that the amount of heparin trapped in the vesicles dramatically increases when a step of freeze-drying / rehydration is included in their preparation protocol. We encapsulated a hydrophilic dye, calcein, in the liposomes. This allowed us to easily detect the presence of intact liposomes on the metallic surfaces, as well as to accurately quantify the amount of lipid attached. We applied a simple and widely used protocol to create an amidic bond between the amino group of the liposomes and the carboxyl group of the metallic surfaces and we further optimized it to achieve the optimum reaction efficacy. (58,4 ± 8.6 μg lipid per cm2 surface)

Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η παρασκευή και μελέτη λιποσωμάτων διπλής στόχευσης με το μονοκλωνικό αντίσωμα Ox-26 και με πεπτιδικό ανάλογο της Απολιποτρωτεΐνης Ε3 (ApoE3) στην επιφάνειά τους, για στόχευση των υποδοχέων της τρανσφερρίνης (TfR) και της Απολιποτρωτεΐνης (LDL) αντίστοιχα, και η μελέτη πιθανής συνεργικής δράσης των δύο προσδετών. Για την ακινητοποίηση των προσδετών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων, χρησιμοποιήθηκαν δύο μεθοδολογίες. Η αλληλεπίδραση βιοτίνης-στρεπταβιδίνης-βιοτινυλιωμένου αντισωματος για την πρόσδεση του Ox-26 και η τεχνική της δημιουργίας θειοαιθερικού δεσμού (μέσω πρόσδεσης της κυστεΐνης του πεπτιδίου σε ομάδα μαλεϊμίδιου που υπάρχει σε λιπιδικό παράγωγο πολθαιθυλενογλυκόλης, το οποίο προστίθεται στη λιπιδική μεμβράνη κατα τη διάρκεια παρασκευής των λιποσωμάτων). Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε η απόδοση της πρόσδεσης αυτών, ακολουθώντας δύο πορείες με σκοπό την επίτευξη μέγιστης πρόσδεσης και για τους δύο προσδέτες. Τα λιποσώματα χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος, το ζ-δυναμικό, καθώς και τη σταθερότητά τους παρουσία πρωτεϊνών ορού. Το μέσο μέγεθος των λιποσωμάτων προσδιορίστηκε μεταξύ 150-200nm. Τόσο το μέγεθος, όσο και η σταθερότητα των λιποσωμικών μορφώμ Πραγματοποιήθηκαν μελέτες πρόσληψης με τη χρήση ανθρώπινων αθανατοπιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων του εγκεφάλου, hCMEC/d3, όπου η πρόσληψη των λιποσωμάτων που φέρουν και τους δύο προσδέτες παρουσιάζεται μεγαλύτερη συγκριτικά με τα λιποσώματα που φέρουν μόνο έναν προσδέτη στην επιφάνεια τους, όπως επίσης και σε σύγκριση με απλά λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας στο αίμα, που δεν φέρουν κανένα ειδικό προσδέτη. Πραγματοποιήθηκαν, επίσης, μελέτες τοξικότητας όλων των λιποσωμικών μορφών, οι οποίες απέδειξαν πως όλοι οι τύποι λιποσωμάτων που αναπτύχθηκαν δεν εμφανίζουν τοξικότητα προς τα κύτταρα, σε συνθήκες παρόμοιες με αυτές στις οποίες πραγματοποιήθηκαν τα in vitro πειράματα, αποδεικνύοντας ότι το πειραματικό αποτέλεσμα (αυξημένη πρόσληψη των λιποσωμάτων με διπλό σύστημα προσδετών από κύτταρα του εγκεφάλου) δεν οφείλεται σε τοξικότητα. Τελικό συμπέρασμα της παρούσας διατριβής είναι ότι η χρήση δύο διαφορετικών προσδετών στο ίδιο λιπόσωμα προσφέρει μεγαλύτερη ικανότητα στόχευσης του αιματεγκεφαλικού φραγμού, και πιθανώς μεγαλύτερη δυνατότητα διαπέρασης στον εγκέφαλο. / The aim of this study is the preparation of dually decorated liposomes with Ox26 monoclonal antibody and ApoE 3 derivative peptide on their surface and the investigation of a higher targeting potential of Blood Brain Barrier (BBB), as they are targeting both transferrin (Tfr) and apolipoprotein (LDLr) receptors. Two methods were used for the preparation of dually decorated liposomes. Biotin-streptavidin-biotinilated Mab, for Ox26 aattachement, and maleimide-cysteine-peptide for attachment of the ApoE3 peptide derivative. Two procedures were followed in order to achieve high attachment yield of both ligands, as calculated by ELISA technique for Ox26 and fluorescence intensity for ApoE. All types of liposomes were characterized for their size, z-potential and their stability in PBS or in the presence of serum proteins. Mean diameter of all types of liposomes was between 150-200nm, and their integrity and stability were found to be adequate for in vivo use. Uptake studies were performed by using hCMEC/d3 cell line. The uptake of ApoE liposomes or Ox26 liposomes, is demonstrated to be higher compare to the uptake of plain pegylated liposomes, while the uptake is further increased when both two ligands are immobilized on the same vesicle. MTT studies were also performed for all types of liposomes and proved that all the liposomal types developed herein were non toxic for the cells, in the same conditions as used in all in-vitro studies.

Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ακινητοποίηση λιποσωμάτων με εγκλωβισμένη Tobramycin σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες, με σκοπό την παρασκευή αντιμικροβιακών ενδοπροθέσεων του ουροποιητικού, που αποδεσμεύουν φάρμακο με ελεγχόμενο ρυθμό. / The aim of this study is to covalently link liposomes on metallic surfaces, as a method to prepare antimicrobial controlled (release) drug-eluting stents, using Tobramycin (TOB) as an anti-microbial drug. As a preliminary step for immobilization of TOB, different types of liposomes were constructed and evaluated for TOB loading efficiency, size distribution and ζ-potential. TOB concentrations were measured by a chemiluminescence immunoassay (ADVIA Centaur, Siemens), after modulating the technique as required for the specific samples. Results show that extruded DRV liposomes with similar sizes (mean diameter) with that of SUV liposomes (~95 nm), have 4 times higher drug loading efficiency.

Ο μυϊκός νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης (nAChR), είναι ένα πενταμερές κανάλι ιόντων νατρίου, το οποίο εδράζεται στους σκελετικούς μύες στη νευρομυϊκή σύναψη και μετατρέπει τις νευρικές ώσεις σε μυϊκές συσπάσεις. Το κανάλι αυτό γίνεται στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος, που παράγει στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας αντισώματα εναντίον του. Η συχνότητα της ασθένειας αυτής στο γενικό πληθυσμό είναι 125-400 περιπτώσεις/εκατομμύριο, με αναλογία ανδρών/γυναικών ασθενών 1:2. Τα πρώτα συμπτώματα της νόσου είναι διπλωπία και βλεφαρόπτωση που εξελίσσονται σε γενική μυϊκή αδυναμία και εύκολη κόπωση έως παράλυση των άκρων ή ακόμα και των αναπνευστικών μυών. Οι καθιερωμένες σήμερα θεραπείες της βαριάς μυασθένειας περιλαμβάνουν χορήγηση αντιχολινεστερασικών, ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, θυμεκτομή, πλασμαφαίρεση, καθώς και ενδοφλέβια χορήγηση ανθρωπίνων ανοσοσφαιρινών σε μεγάλες δόσεις. Όμως κοινός παρονομαστής όλων αυτών των θεραπειών είναι η έλλειψη εκλεκτικότητας καθώς και οι παρενέργειες. Τα παραπάνω προβλήματα έχουν κάνει φανερή την ανάγκη για εξεύρεση νέων και πιο εξειδικευμένων θεραπειών, όπως θεραπείες στις οποίες τα παθολογικά αυτοαντισώματα θα αφαιρούνται εκλεκτικά από την κυκλοφορία. Η μελέτη που έγινε στοχεύει στην εκλεκτική αφαίρεση των παθολογικών αντισωμάτων από το αίμα μυασθενών, με μυϊκούς nAChRs ή τμήματα αυτών, που είτε θα χορηγούνται ενδοφλεβίως, είτε θα βρίσκονται ομοιοπολικά προσδεμένα σε στήλες χρωματογραφίας από όπου θα περνά ο ορός. Στο πρώτο μέρος της μελέτης δημιουργήθηκαν παρασκευάσματα που περιείχαν το μυϊκού τύπου nAChR από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica (Τ. nAChR). Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε Τ. nAChR ο οποίος ήταν διαλυμένος σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), σε PBS/Χολικό νάτριο 2% (PBS/Χ.Ν.2%) καθώς επίσης και ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG), με στόχο την παράταση του χρόνου ημιζωής στον οργανισμό και τη μείωση της αντιγονικότητας. Τα παρασκευάσματα συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητά τους να δεσμεύουν το μονοκλωνικό αντίσωμα mAb35 (ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που προσδένεται σε μυϊκούς nAChRs) καθώς και I125-α-μπουγκαροτοξίνη (I125-α-Bgt) (πρωτεΐνη-συστατικό του δηλητηρίου του φιδιού Bungarus multicinctus και ανταγωνιστής ακετυλοχολίνης, ραδιοσημασμένη με I125), σε διάφορα χρονικά διαστήματα από την παρασκευή τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τη μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης έχει το παρασκεύασμα στο οποίο ο Τ. nAChR είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν τα ποσοστά του mAb35, τα οποία δεσμεύτηκαν in vivo σε αρουραίους από τα ίδια παρασκευάσματα με Τ. nAChR. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι μόνο ο Τ. nAChR που ήταν διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2% μπόρεσε να δεσμεύσει ποσοτικά το mAb35. Τέλος έγιναν πειράματα βιοκατανομών, του Τ. nAChR ραδιοσημασμένου με I125-α-Bgt, στα παραπάνω παρασκευάσματα, σε αρουραίους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μέγιστο χρόνο ζωής in vivo έχει ο ενσωματωμένος υποδοχέας σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν εξωκυτταρικά τμήματα του ανθρωπίνου μυϊκού nAChR (ECDs), εκφρασμένα στο ζυμομύκητα Pichia pastoris και σε κύτταρα εντόμων High Five (από τις ωοθήκες του εντόμου Trichoplusia ni). Τα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητα να δεσμεύουν αντισώματα από ορούς μυασθενών χρησιμοποιώντας τη ραδιοανοσολογική μέθοδο. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με ορούς 5 ασθενών, έδειξαν ότι το High Five α1 ECD δεσμεύει υπερδιπλάσια ποσοστά αυτοαντισωμάτων σε σχέση με το Pichia pastoris α1 ECD. Από τα πειράματα αυτά φαίνεται πως το High Five α1 ECD πλεονεκτεί του Pichia pastoris α1 ECD ποιοτικά. Συνολικά από τη μελέτη που έγινε, προέκυψε μια σειρά από συμπεράσματα. Κατ’ αρχήν αποδείχθηκε ότι nAChRs, όπως ο Τ. nAChR, μπορούν να ενσωματωθούν σε πολλά διαφορετικά παρασκευάσματα όπως σε PBS, PBS/Χ.Ν.2% και λιποσώματα, τα οποία επηρεάζουν τις ιδιότητές τους, όπως την ικανότητα δέσμευσης mAb35 και I125-α-Bgt και το χρόνο ημιζωής στον οργανισμό. Όπως αποδείχθηκε ο Τ. nAChR μπορεί να δεσμεύει mAb35 σε οποιαδήποτε από τα παραπάνω παρασκευάσματα in vitro, ενώ in vivo μπορεί να το δεσμεύει όταν είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης φάνηκε ότι μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής in vivo έχει ο Τ. nAChR ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Τέλος αποδείχθηκε ότι ανασυνδυασμένα ECDs της ανθρώπινης α1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR, δεσμεύουν αυτοαντισώματα από τον ορό μυασθενών και ότι η ικανότητα δέσμευσης των τμημάτων αυτών, επηρεάζεται από το σύστημα στο οποίο εκφράζονται. Η πληροφορία αυτή πρέπει να ληφθεί υπόψη στη κατασκευή ανοσοπροσροφητικών στηλών για τη θεραπεία της βαριάς μυασθένειας. / The muscle nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is a pentameric cation channel, which is located at the neuromuscular synapse and converts neuronal impulses into muscle contractions. In myasthenia gravis patients, this particular channel is targeted by the immune system, which produces antibodies against it. The incidence of the disease is about 125-400 cases per million. The first symptoms of the disease are diplopia and blepharoptosis, which may shift to general weakness and fatigability. The established therapies for myasthenia gravis, include administration of acetylcholinesterase inhibitors, immunosuppresive drugs, thymectomy, plasmaphaeresis and administration of intravenous immunoglobulins (IVIGs). Unfortunately all these therapies are not specific and have many serious side effects. This has made clear the need for more specific therapies, in which pathological autoantibodies will not be produced or will be removed selectively. This project aims at the specific aphaeresis of pathological autoantibodies from the patients’ blood by using the muscle nAChR or extracellular domains (ECDs) of its subunits. These molecules will either be administered i.v. or will be covalently conjugated on chromatography beads, forming a column by which the serum could pass and be cleaned from autoantibodies. In the first part of this project, formulations of nAChR, from the electric organs of fish Torpedo californica (T. nAChR), were prepared. Particularly T. nAChR was diluted in PBS and PBS/Sodium Cholate 2% (PBS/S.Ch.2%) and incorporated into liposomes coated by polyethylenoglycol (PEG) chains in different percentages, in order to achieve longer half-life in vivo. Their ability to bind mAb35 (a monoclonal antibody that binds muscle nAChRs) and I125-α- bungarotoxin (I125-labeled toxin from the poison of the snake Bungarus multicinctus, a well studied nAChR antagonist) were compared. The results showed that T. nAChR has the best binding capacity in vitro in the PBS/S.Ch.2%. Apart from the in vitro mAb35 binding measurements, in vivo binding experiments were also performed, using Lewis rats. Results indicate that only T. nAChR in the PBS/S.Ch.2% formulation binds mAb35 quantitatively in vivo. Finally, the biodistribution of T. nAChR in several formulations was also studied in rats. T. nAChR formulations were radiolabelled using I125-α-bungarotoxin and administered i.v. The results indicate that T. nAChR has the longest half-life time when incorporated into PEG-coated liposomes. In the second part of this project, ECDs of human muscle nAChR α1 subunit, expressed in the yeast Pichia pastoris and High Five insect cells were used. Pichia pastoris and High Five α1 ECDs were measured and compared for their ability to bind autoantibodies from myasthenic patients’ sera using radioimmunoassay. The results from 5 patients’ sera indicate that High Five α1 ECD binds more than twice more autoantibodies than Pichia pastoris α1 ECD. In conclusion, it was proved that nAChRs can be incorporated to many different formulations, like PBS, PBS/S.Ch.2% and liposomes, which affect its binding capacity and half-life time. It was shown that Τ. nAChR, when incorporated into any of the above formulations, can bind mAb35 in vitro, while in vivo only in PBS/S.Ch.2% formulation. In addition, it was proved that Τ. nAChR has longer half-life time in vivo when incorporated in PEG-coated liposomes. In the last part of the project, it was shown that ECDs of human nAChR α1 subunit binds autoantibodies from myasthenia gravis patient’s serum and their binding capacity is strongly affected by the expression system.

Η λυοφιλοποίηση θεωρείται ιδανική μέθοδος για βραχύχρονη ή/ και μακρόχρονη αποθήκευση λιποσωμάτων. Στόχος αυτής της μελέτης ήταν να ευρεθούν οι ποσότητες κρυοπροστατευτικού που μπορεί να αυξήσουν τη συγκράτηση πρωτεϊνικών μορίων σε λιποσώματα τα οποία είναι ασταθή (δηλ. χάνουν μεγάλο τμήμα της εγκλωβισμένης πρωτεΐνης) μετά από λυοφιλοποίηση. Η μέθοδος παρασκευής των λιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκε ήταν η DRV μέθοδος. Είναι η πλέον κατάλληλη στην περίπτωση εγκλωβισμού πρωτεϊνικών μορίων καθώς επιτυγχάνει υψηλά ποσοστά εγκλωβισμού και επίσης χρησιμοποιεί ήπιες συνθήκες οπότε προστατεύεται η τριτοταγής δομή των πρωτεϊνών. Η διαδικασία βασίζεται στην αφυδάτωση μίγματος “άδειων” SUV (μικρών μονοστοιβαδιακών) λιποσωμάτων παρουσία του διαλύματος πρωτεΐνης που πρόκειται να εγκλωβιστεί. Μετά από ελεγχόμενη επανενυδάτωση της ξηρής κόνης σχηματίζονται τα DRV λιποσώματα. (από τις λέξεις dried-rehydrated vesicles που μεταφράζονται ως αφυδατωμένα-επανενυδατωμένα σωματίδια). Ως υλικά για την παρασκευή των λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα εξής: Φωσφατιδυλοχολίνη αυγού (egg PC), διστεαροϋλο-γλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC), διπαλμιτοϋλο-γλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DPPC), διμυριστοϋλο-γλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DΜPC), φωσφατιδυλογλυκερόλη (PG) και χοληστερόλη (CHOL). Παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο DRV λιποσώματα διαφόρων λιποσωμικών συστάσεων προκειμένου να μελετηθεί η ικανότητα εγκλωβισμού για κάθε λιποσωμική σύσταση και να επιλεγούν αυτές που είναι πλέον ασταθείς για περαιτέρω μελέτη. Ως πρωτεΐνη μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η αλβουμίνη βόειου ορού (BSA). Μελετήθηκε η επίδραση της λυοφιλοποίησης σε διάφορα DRV λιποσώματα παρουσία ή/ και απουσία κρυοπροστατευτικού παράγοντα (τρεαλόζη). Σε κάποιες περιπτώσεις προστέθηκε τρεαλόζη εντός των λιποσωμάτων κατά την αρχική παρασκευή των DRV (στο στάδιο της ανασύστασης). Επίσης, προκειμένου να αποκτήσουμε περαιτέρω πληροφορίες για τα λιποσώματα που μελετούσαμε, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός του μεγέθους των ορισμένων λιποσωμικών σειρών και μορφολογική μελέτη με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. Στη συνέχεια, με βάση τα αρχικά αποτελέσματα με την αλβουμίνη, επιλέχθηκαν ορισμένες λιποσωμικές συστάσεις προκειμένου να μελετηθεί η σταθερότητα λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν ένα βιοδραστικό μόριο, το t-PA (ιστικού τύπου ενεργοποιητή πλασμινογόνου) σε ξηρή μορφή. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με δείκτη τη διατήρηση της ενεργότητας του μορίου μετά από FD και προσθήκη ή όχι τρεαλόζης. Απώτερος σκοπός αυτής της εργασίας είναι η δυνατότητα παρασκευής σταθερών t-PA- λιποσωμικών μορφών σε ξηρή μορφή προκειμένου να μελετηθεί η δράση τους στη θεραπεία θρομβώσεων του αμφιβληστροειδούς. Τα βασικά συμπεράσματα της μελέτης είναι τα εξής: Σχετικά με αποτελέσματα πειραμάτων με BSA: * Τα PC:PG:CHOL DRV λιποσώματα σταθεροποιούνται ικανοποιητικά αν πριν τη λυοφιλοποίηση προσθέσουμε αναλογία treh/lipid=5/1 στη λιποσωμική διασπορά. * Η καλύτερη σταθεροποίηση επιτυγχάνεται με παρουσία σακχάρου στο εσωτερικό και εξωτερικό των λιποσωμάτων * Πιθανή αλληλεπίδραση λαμβάνει χώρα μεταξύ των PC λιποσωμάτων και της αλβουμίνης, δίνοντας ψευδή υψηλά τελικά ποσοστά συγκράτησης μετά τη λυοφιλοποίηση Σχετικά με αποτελέσματα πειραμάτων με t-PA * Τα αποτελούμενα από DSPC DRV λιποσώματα παραμένουν πολύ σταθερά διατηρώντας την ενεργότητα του t-PA μετά τη λυοφιλοποίηση και χωρίς την προσθήκη κρυοπροστατευτικού. * Τα ασταθή PC:PG:CHOL και PC λιποσώματα σταθεροποιούνται ικανοποιητικά με προσθήκη τρεαλόζης πριν το FD. / Lyophilization is considered to be an ideal technique for both short-term and long-term storage of liposomes. The objective of this study was to investigate the stability of liposomes encapsulating protein molecules and the effect of freeze-drying (FD) on the stability of dehydrated-rehydrated vesicles (DRV) with and without cryoprotective agents (CPA). Τhe liposomes were prepared by the DRV method. This is considered to be the most appropriate in the cases that entrapment of proteins is desired, since it gives liposomes with high encapsulation efficiencies and by using mild conditions it protects the tertiary structure of proteins retaining thus their biological activity. The procedure followed here was based on dehydration of a mixture of “empty” SUV liposomes and the protein solution (BSA) which is to be entrapped, followed by controlled rehydration of the dry powder. The materials used for the preparation of the liposomes were: Egg-PC (phosphatidylcholine), distearoyloglycerophosphatidylcholine(DSPC), (DPPC) dipalmitoylglycerophosphatidylcholine, (DΜPC) dimyristoylglycerophosphatidylcholine, PG (phosphatidylglycerol) and CHOL (cholesterol). Liposomes of various lipid compositions were prepared so that the most unstable liposome compositions are found and available for further study. BSA was used as a protein model in these experiments. Furthermore, the influence of lyophilization for liposomes of various compositions was studied using trehalose as a cryoprotective agent. In some experiments, the dissacharide was added during the reconstitution of DRV. In order to have some more information about the liposomes under investigation, we conducted particle size determination (zetasizer) and morphological study by SEM (scanning electron microscopy. Eventually, based on the primary results with albumin, the stability of liposomes bearing a bioactive protein was studied. The protein used here was t-PA (tissue type plasminogen activator). We investigated the influence of FD on the stability of liposomes with or without the addition of a cryoprotective agent (trehalose) as a function of bioactivity retention. A long-term objective of our studies is to prepare stable after FD liposomal- tPA-formulations that may be active for therapy of ocular thrombosis cases. The mail conclusions of this study were: Concerning the results obtained with BSA: * PC:PG:CHOL DRV liposomes are adequately stabilized when trehalose in mass ratio treh/PC=5/1 is added in the liposomal dispersion * Maximum retention of BSA is achieved when trehalose is added on both sides of liposomal membrane. * There is a possible interaction between BSA and PC liposomes, which results in false estimation of BSA retention after FD. Concerning the results obtained with t-PA: * DSPC DRV liposomes are very stable after FD and they preserve t-PA activity even in absence of cryoprotectant. * Unstable PC:PG:CHOL and PC liposomes can be adequately stabilized by trehalose.

Προκειμένου να παρεμποδιστεί διάδοση του σεξουαλικά μεταδιδόμενου HIV είναι απαραίτητη η ανάπτυξη κατάλληλης κολπικής φαρμακομορφής για τοπική χορήγηση η οποία θα αποτρέπει την μετάδοση του ιού σε υγιείς ανθρώπους. Το κολπικό αυτό σκεύασμα είναι σημαντικό να αποτελείται από κατάλληλη βιολογικώς δραστική ουσία και ως τέτοια μπορεί να θεωρηθεί το MC-1220 και το δραστικό (R)-εναντιομερές του (MC-εναντιομερές). Πρόκειται για μικροβιοκτόνα της κατηγορίας των DABOs (3,4-Dihyro-2-Alkoxy-6-Benzyl-4-OxopyrimidineS–DABOs) αναστολέων και ανήκουν στην κατηγορία των μη-νουκλεοτιδικών αναστολέων της αντίστροφης μεταγραφάσης (NNRTI). Η εξαιρετικά χαμηλή διαλυτότητα του MC σε υδατικά διαλύματα (< 3 ppm) μας οδήγησε στην ανάπτυξη μικρογαλακτωμάτων των MC και MC-εναντιομερούς. Τα μικρογαλακτώματα αυτά χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή φαρμακομορφών (απλές γέλες) στις οποίες η συγκέντρωση του MC και MC-εναντιομερούς ήταν ~1.000 και 7.000 ppm αντίστοιχα. Αντιθέτως η ανάπτυξη κατάλληλης λιποσωμικής μορφής του MC (DRV_HPC/Chol(2:1) λιποσώματα) με υψηλές τιμές εγκλωβισμού MC, μας έδωσε την δυνατότητα παρασκευής τελικών σκευασμάτων (σύνθετες - λιποσωμικές γέλες) με εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις MC (~15.000 ppm). Επιπλέον και προκειμένου να αυξηθεί η συγκέντρωση του MC στις τελικές φαρμακομορφές (λιποσωμικές γέλες), αναπτύχθηκαν σύμπλοκα υδροξυπροπυλ-β-κυκλοδεξτρίνης/MC (HP-β-CD/MC), τα οποία επίσης ενσωματώθηκαν κατάλληλα στις τελικές λιποσωμικές φαρμακομορφές. Τέλος αναπτύχθηκαν κατάλληλες in vitro μέθοδοι, προκειμένου να γίνει συγκριτική αξιολόγηση των νέων φαρμακομορφών, ως προς την δυνατότητα σταδιακής αποδέσμευσης του MC στην περιοχή ενδιαφέροντος. Οι νέες φαρμακομορφές μελετήθηκαν in vivo σε πειραματόζωα (μακάκους), με ιδιαίτερα επιτυχή αποτελέσματα ως προς την πρόληψη και θεραπεία από τον HIV. / -

Τα λιποσώματα αποτελούν ένα από τα πιο διαδεδομένα συστήματα μεταφοράς φαρμάκων. Ένα από τα κυριότερα προβλήματά τους αποτελεί η γρήγορη απομάκρυνσή τους από τον οργανισμό που αντιμετωπίστηκε με την επικάλυψη της επιφάνειάς τους με πολυμερή και κυρίως πολυαιθυλενογλυκόλες (PEG). Η ύπαρξη του PEG στην επιφάνεια αύξησε κατά πολύ τον χρόνο παραμονής των λιποσωμάτων στον οργανισμό αλλά λόγω μειονεκτημάτων, όπως το φαινόμενο αυξημένης εκκαθάρισης απ’τον οργανισμό μετά την δεύτερη δόση όπως και η ύπαρξη πολλών πατεντών, δημιουργούν την ανάγκη για την διερεύνηση νέων μορφών επικάλυψης των λιποσωμάτων. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η σύνθεση νέων λιπιδικών παραγώγων από κυκλοδεξτρίνες και αιθέρες στέμματος και ο σχηματισμός λιποσωμάτων από αυτά τα παράγωγα. Έναυσμα για την χρήση αυτών των χημικών ουσιών αποτέλεσε η ήδη χρησιμοποίηση τους στην μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων καθώς και οι χημικές ιδιότητές τους. Θεωρητικά η ύπαρξη ογκωδών υποκαταστατών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων προκαλεί στερεοχημική παρεμπόδιση στις αλληλεπιδράσεις με ουσίες στον οργανισμό, που θα μπορούσαν να προκαλούν την γρήγορη εκκαθάριση από τον οργανισμό, αυξάνοντας έτσι τον χρόνο παραμονής τους. Αρχικά συντέθηκαν τα λιπιδικά παράγωγα από DSPE (δι-στεάρυλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη) και 18-crown-6-ether καθώς και β-κυκλοδεξτρίνη όμως ο καθαρισμός του παραγώγου με την κυκλοδεξτρίνη δεν κατέστει δυνατός και έτσι σχηματίστηκαν λιποσώματα μόνο από το λιπιδικό παράγωγο του αιθέρα στέμματος. Ως υλικά για την παρασκευή των λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκαν φωσφατιδυλοχολίνη αυγού (egg-PC), το λιπιδικό παράγωγο του αιθέρα, δι-στεάρυλοφωσφατιδυλοαιθανολαμινη-πολυαιθυλενογλυκόλη(DSPE-PEG) και χοληστερόλη (CHOL) Παρασκευάστηκαν με την μέθοδο του λεπτού υμενίου πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (MLVs) και με την χρήση υπέρηχων (probe sonicator) μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (SUVs) και στη συνέχεια μελετήθηκε η σταθερότητα αυτών σε ορό αίματος χοίρου (FCS) Επίσης, προκειμένου να αποκτηθούν περισσότερες πληροφορίες για τα λιποσώματα που μελετήθηκαν, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός του μεγέθους καθώς και του ζ-δυναμικού. Η μελέτη σταθερότητας των λιποσωμάτων που περιείχαν το λιπιδικό παράγωγο με τον αιθέρα στέμματος έδειξε ότι σε ποσοστά αντίστοιχα με αυτά του PEG ο αιθέρας στέμματος δεν προσδίδει μεγαλύτερη σταθερότητα. Θα μπορούσε να μελετηθεί μια σειρά λιποσωμάτων με μεγαλύτερο ποσοστό του λιπιδικού παραγώγου ούτως ώστε να αυξηθεί ο όγκος των υποκαταστατών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων και συνεπώς η παρεμπόδιση των αλληλεπιδράσεων. / Liposomes are one of the most common drug delivery systems. One of their main problems is their rapid clearance from the blood stream which was encountered by coating the surface with polymers and especially poly-ethylenoglyglycols (PEG). The coating of the surface with PEG increased the time of stay of liposomes in the blood stream but due to disadvantages, such as the phenomenon of increased clearance after the second dose as well as the existence of many patents, created the need for new forms of coating of the liposomes. The main purpose of this thesis was the synthesis of new lipidic derivatives from cyclodextrins and crown ethers as well as the formation of liposomes from these novel derivatives. The reason behind the choice of these chemical substances was that they are already being used in drug delivery as well as their chemical properties. In theory the existence of bulk substituents on the surface of liposomes causes stereochemical hindrance in interactions with substances in the body, which could cause the rapid clearance from the body, thereby increasing the time of stay in the blood stream. Initially lipid derivatives from DSPE (di-stearylophosphatidylethanolamine) and 18-crown-6-ether-and β-cyclodextrin were synthesized but the purification of the cyclodextrin derivative was not made possible and thus liposomes were formed only from the crown ether lipid-derivative. As starting material for the formation of liposomes was used egg phosphatidylcholine (egg-PC), the crown ether lipid-derivative, di-stearylophosphatidylethanolamine- polyethyleneglycol (DSPE-PEG) and cholesterol (CHOL). Multilamellar vesicles (MLVs) were prepared by the thin film method and with the use of ultrasounds (probe sonicator) small unilamellar vesicles (SUVs) were formed, and then their stability in fetal calf serum (FCS) was studied. In addition, in order to obtain more information about the liposomes that were formed, measurements were carried to determine their size as well as magnitude of the z-potential. The study on the stability of liposomes containing the lipid derivative with the crown ether showed that coating of the surface with the crown ether derivative in percentages equivalent to those of PEG does not confer greater stability on the contrary their stability is the same with conventional liposomes. Α study of liposomes with a higher proportion of the lipid derivative in order to increase the bulkiness of the substituents on the surface of the liposomes and thus preventing interactions resulting in the increase of the stability should be considered.

Η παρούσα εργασία εστιάζει στην παρασκευή και μελέτη ανοσολιποσωμάτων είτε για στόχευση των υποδοχέων τρανσφερρίνης του ΑΕΦ είτε με εξειδίκευση για τα Αβ πεπτίδια. Για την πρόσδεση των αντισωμάτων στην επιφάνεια των λιποσωμάτων εφαρμόσαμε μια τεχνική βασισμένη στο σύστημα πρόσδεσης βιοτίνης/στρεπταβιδίνης. Έχει πρόσφατα προταθεί ότι νανοσυστήματα που φέρουν πολλόυς προσδέτες στην επιφάνεια ίσως είναι πιο κατάλληλα για στόχευση ασθενειών ή βιολογικών φραγμών. Σε αυτές τις περιπτώσεις πρέπει να διασφαλιστεί ότι η ικανότητα στόχευσης ενός προσδέτη δεν θα επηρεαστεί από την παρουσία και δευτερου. Σκοπός είναι η παρασκευή ΟΧ-26 (κατά του υποδοχέα τρανσφερρίνης μονοκλωνικό αντίσωμα) νανολιποσωμάτων, η μελέτη διαφόρων παραγόντων κατά την παρασκευή τους και οι μελέτες πρόσληψης από μοντέλο του ΑΕΦ. Ο συγκεκριμένος τύπος ανοσολιποσωμάτων επιλέχθηκε γιατί είναι γνωστό ότι στοχεύουν σε κύτταρα που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα της τρανσφερρίνης (TfR). Πρώτος στόχος είναι η παρασκευή ανοσολιποσωμάτων που φέρουν προσδεδεμένο στην επιφάνεια το μονοκλωνικό αντίσωμα ΟΧ-26 που στοχεύει στον υποδοχέα της τρανσφερρίνης και έγιναν μελέτες της πρόσληψης των ΟΧ-26 ανοσολιποσωμάτων από την αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά hCMEC/D3. Εκτός από τις μελέτες πρόσληψης έγιναν και μελέτες κυτταρικού εντοπισμού του περιεχομένου των λιποσωμάτων με σκοπό να διασαφηνίσουμε το μηχανισμό πρόσληψης. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η πρόσληψη των ανοσολιποσωμάτων από τα κύτταρα hCMEC/D3 είναι αρκετά υψηλή σε σύγκριση με την πρόσληψη ανοσολιποσωμάτων που φέρουν IgG αντίσωμα στην επιφάνειά τους. Επίσης, η δέσμευση είναι δοσοεξαρτώμενη και εξαρτάται και από την ποσότητα του αντισώματος στην επιφάνεια των λιποσωμάτων. Οσον αφορά στον μηχανισμό πρόσληψης τα αποτελέσματα δείχνουν ότι έχουμε λυσοσωματικό εντοπισμό του περιεχομένου των λιποσωμάτων συνεπώς μπορούμε να ισχυριστούμε ότι η πρόσληψη γίνεται μέσω υποδοχέα και ακολουθεί μεταφορά στα λυσοσώματα. Δεύτερος στόχος είναι η παρασκευή λιποσωμάτων με εξειδίκευση για τα Αβ πεπτίδια. Παρασκευάστηκαν λιποσώματα που φέρουν κουρκουμίνη εγκλωβισμένη στη λιπιδική διπλοστιβάδα και μελετήθηκε η ικανότητα τους να αναστέλουν τη συσσωμάτωση Αβ1-40 μονομερών ή ολιγομερών ή και να αποσσυσωματώνουν ινιδικές μορφές του Αβ1-42 πεπτιδίου. Για τον λόγο αυτό εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο θειοφλαβίνης Τ, με τη χρήση του οποίου μπορούμε να ανιχνεύουμε την ύπαρξη β-δομών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η λιποσωμική κουρκουμίνη έχει μεγαλύτερη ικανότητα αναστολής της συσσωμάτωσης και αποσσυσωμάτωσης των δομών των Αβ πεπτιδίων σε σύγκριση με την ίδια ποσότητα ελεύθερης κουρκουμίνης. Παρασκευάστηκαν επίσης και αnti-Abeta ανοσολιποσώματα και έγιναν μελέτες προσδιορισμού της συγγένειας πρόσδεσης αυτών σε ακινητοποιημένα μονομερή Αβ πεπτίδια καθώς και σε ινίδια με την τεχνική SPR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συγγένεια πρόσδεσης των ανοσολιποσωμάτων στα Αβ πεπτίδια και ινίδια είναι υψηλή καθώς και ότι η σταθερά δέσμευσης των ανοσολιποσωμάτων στα Αβ πεπτίδια εξαρτάται από την ποσότητα του αντισώματος στη λιποσωμική επιφάνεια. / This work focuses on the manufacture and study of immunoliposomes either for targeting of transferrin receptors of blood Brain Barrier or with specialization for Aβ peptides. For the attachment of antibodies in the surface of liposomes applied a technique based on the biotin/streptavidin linkage. It has been recently proposed that perhaps multiligant-decorated nanosystems may be more efficient to target specific diseases or biological barriers.insuch cases,it is important to be sure that the targeting potential of one ligand will not be negatively affected by the presence of the second on the same nanosystem. OX-26 (anti-transferrin momoclonal antibody) nanoliposomes werw prepared and after evaluation of several preparative aspects their brain targeting potential was studied on a cellular model of BBB. Manufactured pegylated immunoliposomes coated with the monoclonal antibody OX-26 aimed transferrin receptor and studies of uptake of OX-26 immunoliposomes from cell line hCMEC/D3 were done. Also studies of cell tracking content of immunoliposomes were done in order to clarify the mechanism of intake. Our results showed that the uptake of immunoliposomes from hCMEC/D3 cell line is quite high in comparison with the uptake of immunoliposomes coated with IgG antibody. Moreover the uptake of immunoliposomes is dosedependent and depends on the quantity of antibody in the liposomal surface. With regard to the mechanism of intake, results show that there is lysosomatic localization of the liposomal content so we can say that uptake is achievied through receptor and then followed shipment to lysosomes. In the second part, manufactured liposomes and immunoliposomes with specialization for Ab peptides. In the first case prepared liposomes with curcumin incorporated into the lipid bilayer and the ability to inhibit the linking of Aβ1-40 monomers or oligomers or even to disagreggate fibrillar forms of Aβ1-42 peptide was studied. For this purpose applied the thioflavin–T protocol, using which we can prove the existence of β-structures. The results showed that liposomal curcumin is more capable to inhibit the agreggation or to disaggregate structures of Aβ peptides compared with the same amount of free curcumin. In the second case, prepared anti-Abeta immunoliposomes and studies for the determination of the affinity for immobilized Aβ peptides monomers and fibrils were done with the SPR technique. The results showed that the affinity of immunoliposomes for Aβ monomers and fibrils is high and that the Ka of immunoliposomes in Aβ peptides depends on the amount of antibodies that is tethered on the liposomal surface.