Ο μυϊκός νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης (nAChR), είναι ένα πενταμερές κανάλι ιόντων νατρίου, το οποίο εδράζεται στους σκελετικούς μύες στη νευρομυϊκή σύναψη και μετατρέπει τις νευρικές ώσεις σε μυϊκές συσπάσεις. Το κανάλι αυτό γίνεται στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος, που παράγει στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας αντισώματα εναντίον του. Η συχνότητα της ασθένειας αυτής στο γενικό πληθυσμό είναι 125-400 περιπτώσεις/εκατομμύριο, με αναλογία ανδρών/γυναικών ασθενών 1:2. Τα πρώτα συμπτώματα της νόσου είναι διπλωπία και βλεφαρόπτωση που εξελίσσονται σε γενική μυϊκή αδυναμία και εύκολη κόπωση έως παράλυση των άκρων ή ακόμα και των αναπνευστικών μυών. Οι καθιερωμένες σήμερα θεραπείες της βαριάς μυασθένειας περιλαμβάνουν χορήγηση αντιχολινεστερασικών, ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, θυμεκτομή, πλασμαφαίρεση, καθώς και ενδοφλέβια χορήγηση ανθρωπίνων ανοσοσφαιρινών σε μεγάλες δόσεις. Όμως κοινός παρονομαστής όλων αυτών των θεραπειών είναι η έλλειψη εκλεκτικότητας καθώς και οι παρενέργειες. Τα παραπάνω προβλήματα έχουν κάνει φανερή την ανάγκη για εξεύρεση νέων και πιο εξειδικευμένων θεραπειών, όπως θεραπείες στις οποίες τα παθολογικά αυτοαντισώματα θα αφαιρούνται εκλεκτικά από την κυκλοφορία. Η μελέτη που έγινε στοχεύει στην εκλεκτική αφαίρεση των παθολογικών αντισωμάτων από το αίμα μυασθενών, με μυϊκούς nAChRs ή τμήματα αυτών, που είτε θα χορηγούνται ενδοφλεβίως, είτε θα βρίσκονται ομοιοπολικά προσδεμένα σε στήλες χρωματογραφίας από όπου θα περνά ο ορός. Στο πρώτο μέρος της μελέτης δημιουργήθηκαν παρασκευάσματα που περιείχαν το μυϊκού τύπου nAChR από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica (Τ. nAChR). Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε Τ. nAChR ο οποίος ήταν διαλυμένος σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), σε PBS/Χολικό νάτριο 2% (PBS/Χ.Ν.2%) καθώς επίσης και ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG), με στόχο την παράταση του χρόνου ημιζωής στον οργανισμό και τη μείωση της αντιγονικότητας. Τα παρασκευάσματα συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητά τους να δεσμεύουν το μονοκλωνικό αντίσωμα mAb35 (ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που προσδένεται σε μυϊκούς nAChRs) καθώς και I125-α-μπουγκαροτοξίνη (I125-α-Bgt) (πρωτεΐνη-συστατικό του δηλητηρίου του φιδιού Bungarus multicinctus και ανταγωνιστής ακετυλοχολίνης, ραδιοσημασμένη με I125), σε διάφορα χρονικά διαστήματα από την παρασκευή τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τη μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης έχει το παρασκεύασμα στο οποίο ο Τ. nAChR είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν τα ποσοστά του mAb35, τα οποία δεσμεύτηκαν in vivo σε αρουραίους από τα ίδια παρασκευάσματα με Τ. nAChR. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι μόνο ο Τ. nAChR που ήταν διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2% μπόρεσε να δεσμεύσει ποσοτικά το mAb35. Τέλος έγιναν πειράματα βιοκατανομών, του Τ. nAChR ραδιοσημασμένου με I125-α-Bgt, στα παραπάνω παρασκευάσματα, σε αρουραίους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μέγιστο χρόνο ζωής in vivo έχει ο ενσωματωμένος υποδοχέας σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν εξωκυτταρικά τμήματα του ανθρωπίνου μυϊκού nAChR (ECDs), εκφρασμένα στο ζυμομύκητα Pichia pastoris και σε κύτταρα εντόμων High Five (από τις ωοθήκες του εντόμου Trichoplusia ni). Τα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητα να δεσμεύουν αντισώματα από ορούς μυασθενών χρησιμοποιώντας τη ραδιοανοσολογική μέθοδο. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με ορούς 5 ασθενών, έδειξαν ότι το High Five α1 ECD δεσμεύει υπερδιπλάσια ποσοστά αυτοαντισωμάτων σε σχέση με το Pichia pastoris α1 ECD. Από τα πειράματα αυτά φαίνεται πως το High Five α1 ECD πλεονεκτεί του Pichia pastoris α1 ECD ποιοτικά. Συνολικά από τη μελέτη που έγινε, προέκυψε μια σειρά από συμπεράσματα. Κατ’ αρχήν αποδείχθηκε ότι nAChRs, όπως ο Τ. nAChR, μπορούν να ενσωματωθούν σε πολλά διαφορετικά παρασκευάσματα όπως σε PBS, PBS/Χ.Ν.2% και λιποσώματα, τα οποία επηρεάζουν τις ιδιότητές τους, όπως την ικανότητα δέσμευσης mAb35 και I125-α-Bgt και το χρόνο ημιζωής στον οργανισμό. Όπως αποδείχθηκε ο Τ. nAChR μπορεί να δεσμεύει mAb35 σε οποιαδήποτε από τα παραπάνω παρασκευάσματα in vitro, ενώ in vivo μπορεί να το δεσμεύει όταν είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης φάνηκε ότι μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής in vivo έχει ο Τ. nAChR ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Τέλος αποδείχθηκε ότι ανασυνδυασμένα ECDs της ανθρώπινης α1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR, δεσμεύουν αυτοαντισώματα από τον ορό μυασθενών και ότι η ικανότητα δέσμευσης των τμημάτων αυτών, επηρεάζεται από το σύστημα στο οποίο εκφράζονται. Η πληροφορία αυτή πρέπει να ληφθεί υπόψη στη κατασκευή ανοσοπροσροφητικών στηλών για τη θεραπεία της βαριάς μυασθένειας. / The muscle nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is a pentameric cation channel, which is located at the neuromuscular synapse and converts neuronal impulses into muscle contractions. In myasthenia gravis patients, this particular channel is targeted by the immune system, which produces antibodies against it. The incidence of the disease is about 125-400 cases per million. The first symptoms of the disease are diplopia and blepharoptosis, which may shift to general weakness and fatigability. The established therapies for myasthenia gravis, include administration of acetylcholinesterase inhibitors, immunosuppresive drugs, thymectomy, plasmaphaeresis and administration of intravenous immunoglobulins (IVIGs). Unfortunately all these therapies are not specific and have many serious side effects. This has made clear the need for more specific therapies, in which pathological autoantibodies will not be produced or will be removed selectively. This project aims at the specific aphaeresis of pathological autoantibodies from the patients’ blood by using the muscle nAChR or extracellular domains (ECDs) of its subunits. These molecules will either be administered i.v. or will be covalently conjugated on chromatography beads, forming a column by which the serum could pass and be cleaned from autoantibodies. In the first part of this project, formulations of nAChR, from the electric organs of fish Torpedo californica (T. nAChR), were prepared. Particularly T. nAChR was diluted in PBS and PBS/Sodium Cholate 2% (PBS/S.Ch.2%) and incorporated into liposomes coated by polyethylenoglycol (PEG) chains in different percentages, in order to achieve longer half-life in vivo. Their ability to bind mAb35 (a monoclonal antibody that binds muscle nAChRs) and I125-α- bungarotoxin (I125-labeled toxin from the poison of the snake Bungarus multicinctus, a well studied nAChR antagonist) were compared. The results showed that T. nAChR has the best binding capacity in vitro in the PBS/S.Ch.2%. Apart from the in vitro mAb35 binding measurements, in vivo binding experiments were also performed, using Lewis rats. Results indicate that only T. nAChR in the PBS/S.Ch.2% formulation binds mAb35 quantitatively in vivo. Finally, the biodistribution of T. nAChR in several formulations was also studied in rats. T. nAChR formulations were radiolabelled using I125-α-bungarotoxin and administered i.v. The results indicate that T. nAChR has the longest half-life time when incorporated into PEG-coated liposomes. In the second part of this project, ECDs of human muscle nAChR α1 subunit, expressed in the yeast Pichia pastoris and High Five insect cells were used. Pichia pastoris and High Five α1 ECDs were measured and compared for their ability to bind autoantibodies from myasthenic patients’ sera using radioimmunoassay. The results from 5 patients’ sera indicate that High Five α1 ECD binds more than twice more autoantibodies than Pichia pastoris α1 ECD. In conclusion, it was proved that nAChRs can be incorporated to many different formulations, like PBS, PBS/S.Ch.2% and liposomes, which affect its binding capacity and half-life time. It was shown that Τ. nAChR, when incorporated into any of the above formulations, can bind mAb35 in vitro, while in vivo only in PBS/S.Ch.2% formulation. In addition, it was proved that Τ. nAChR has longer half-life time in vivo when incorporated in PEG-coated liposomes. In the last part of the project, it was shown that ECDs of human nAChR α1 subunit binds autoantibodies from myasthenia gravis patient’s serum and their binding capacity is strongly affected by the expression system.

Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης είναι ο σημαντικότερος στόχος στην αυτοάνοση νόσο βαριά μυασθένεια. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (85%) ανιχνεύονται αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε διαταραχή της μεταγωγής του κινητικού ερεθίσματος. Σε αυτή την μελέτη στόχος είναι η κατασκευή και έκφραση των εξωκυτταρικών περιοχών των υπομονάδων α και β του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε κύτταρα εντόμων μετά από επιμόλυνση με βακιλοϊό. Στα ίδια πλαίσια πραγματοποιήθηκε η σύνδεση των υπομονάδων α και β με πεπτιδικό συνδέτη για την δημιουργία του συγκαταμερούς β-α. Τα ανασυνδυασμένα αυτά πεπτίδια απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν σε διαλυτή μορφή. Σε επόμενο στάδιο έγινε η ακινητοποίηση τους σε υπόστρωμα σεφαρόζης και ο έλεγχος της ικανότητας πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορό μυασθενών με απώτερο στόχο τηv χρήση τους ως πιθανοί ανοσοπροσροφητές σε μια καινούρια θεραπευτική προσέγγιση για την μυασθένεια. / Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease caused in the majority of patients (85%) by autoantibodies against the human muscle acetylcholine receptor (AChR),a post-synaptic ligand-gated ion-channel located at the neuromuscular junction.Autoantibodies against the AChR cause loss of the available and functional AChRs leading to muscle weakness and fatigability.An attractive therapeutic approach is the extracorporeal specific removal of the pathogenic autoantibodies using AChR-based immunoadsorbents. In this study, the N-terminal extracellular domains (ECD) of AChR the subunits α1 and β1 were cloned into baculovirus expression vectors and heterologously expressed using insect SF9 cells.Additionally, the two subunits were linked by the use of a flexible peptide linker to form the β1-α1 concatamer.The recombinant proteins were expressed as soluble polypeptides, purified and characterized.Furthermore, they were immobilised on sepharose beads in order to test them as immunoadsorbents using sera from MG patients. They were all found to bind anti-AChR autoantibodies, albeit to varying degrees. They, thus, pose as potential candidates for the therapeutic antigen-specific clearance of MG sera.

Οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (AChRs) είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες ενεργοποιούμενες με τη δέσμευση της ακετυλοχολίνης (ACh). Με κριτήρια, όπως η χημική συγγένεια που εμφανίζουν για σηματοδότικά μόρια και οι φαρμακολογικές τους ιδιότητες, ταξινομούνται στην ομάδα των νικοτινικών AChRs και στην ομάδα των μουσκαρινικών AChRs. Οι νικοτινικού τύπου υποδοχείς δημιουργούνται από τη συναρμογή πέντε ομόλογων υπομονάδων και υποδιαιρούνται σε μυϊκού τύπου, ευρισκόμενους κυρίως στους σκελετικούς μύες των σπονδυλωτών και σε νευρικού τύπου, απαντώμενους κατά κύριο λόγο στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα. Οι AChRs σχετίζονται με σειρά παθολογικών καταστάσεων, μεταξύ των οποίων και η βαρειά μυασθένεια (Myasthenia Gravis-MG). Η μυασθένεια χαρακτηρίζεται από χρόνια μυϊκή αδυναμία, προκαλούμενη από τη δράση αντισωμάτων υψηλής συγγένειας έναντι του μυϊκού τύπου AChR. Με απώτερο σκοπό τη διερεύνηση της παθογονικότητας των αυτοαντισωμάτων έναντι μεμονωμένων υπομονάδων του AChR, προχωρήσαμε στην παραγωγή ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδικών τμημάτων των υπομονάδων στο ζυμομύκητα Pichia pastoris. Τα πολυπεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν στην παρασκευή χρωματογραφικών-ανοσοπροσροφητικών στηλών, που εφαρμόστηκαν ακολούθως για την απομόνωση αυτοαντισωμάτων από επιλεγμένους ορούς μυασθενικών ατόμων. Η παθογόνος δράση των απομονωμένων αυτοαντισωμάτων ελέχθηκε μέσω της προκαλούμενης απώλειας υποδοχέων (αντιγονική τροποποίηση-antigenic modulation) σε κυτταρική σειρά (ΤΕ671) που εκφράζει τον AChR και μέσω της χορήγησή τους σε πειραματόζωα και τον έλεγχο της εμφάνισης χαρακτηριστικών συμπτωμάτων της νόσου. Εκτενής συγκριτική μελέτη μεταξύ τεσσάρων επιλεγμένων ορών και αντισωμάτων έναντι της α1 και της β υπομονάδας του υποδοχέα, που απομονώθηκαν από τους συγκεκριμένους ορούς, έδειξαν πως τα αυτοαντισώματα ευθύνονται για δράση των ορών στους υποδοχείς των κυττάρων. Τόσο οι ολικοί οροί όσο και τα απομονωμένα-καθαρά αυτοαντισώματα έναντι των υπομονάδων α1 και β, προκάλεσαν δοσοεξαρτώμενη απώλεια υποδοχέων στα κύτταρα και μάλιστα τα αντι-α1 αντισώματα εμφανίστηκαν περίπου τέσσερις φορές δραστικότερα από τα αντι-β. Η ικανότητα των μερικώς απαλλαγμένων από αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα ορών να προκαλούν απώλεια υποδοχέων στα κύτταρα, φάνηκε να ποικίλλει και να συσχετίζεται άμεσα με το είδος των αντισωμάτων που έχουν παραμείνει στον ορό, υποστηρίζοντας μια διαφορετικότητα στην παθογονικότητα των επιμέρους αντισωμικών κλασμάτων. Με σκοπό την επιβεβαίωση και ενίσχυση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από τα in vitro πειράματα, ακολούθησαν προσπάθειες για την πρόκληση πειραματικής μυασθένειας σε πειραματόζωα, με τη χορήγηση ορών μυασθενικών και καθαρών αυτοαντισωμάτων έναντι διαφόρων υπομονάδων του υποδοχέα. Η χορήγηση σε ζώα τόσο του ολικού ορού, όσο και καθαρών αντισωμάτων έναντι της α1-υπομονάδας του υποδοχέα, προκάλεσαν σημαντική απώλεια βάρους και εμφάνιση έντονων συμπτωμάτων μυϊκής αδυναμίας, μέχρι και το θάνατο. Πειραματόζωα που ενέθηκαν με το κλάσμα του ορού από το οποίο έχουν απομακρυνθεί τα συγκεκριμένα αντισώματα εμφάνισαν πολύ ηπιότερα ή και καθόλου συμπτώματα, ενώ απουσία συμπτωμάτων καταγράφηκε και κατά τη χορήγηση ορού που περιείχε αποκλειστικά αντισώματα έναντι της β υπομονάδας, αλλά και απομονωμένων αντι-β αντισωμάτων. Η παρούσα μελέτη υπέδειξε τα αυτοαντισώματα έναντι του AChR ως τον μοναδικό παθογόνο παράγοντα στον ορό μυασθενικών ατόμων, συμβάλλοντας στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου. Επιβεβαίωσε την υπεροχή των αντι-α1 αντισωμάτων έναντι των αντι-β, ως πρός την παθογονικότητά τους, τόσο in vitro όσο και in vivo, με την επιφύλαξη βέβαια που επιβάλλει ο μικρός αριθμός δειγμάτων που μελετήθηκαν. Η δυνατότητα λήψης αντισωμάτων που στοχεύουν σε συγκεκριμένη υπομονάδα μπορεί να συμβάλλει στη λεπτομερή μελέτη της δραστικότητας του κλάσματος και να οδηγήσει στη συσχέτισή του με την εμφάνιση συγκεκριμένων συμπτωμάτων της νόσου. / Acetylcholine receptors (AChRs) are integral membrane proteins that respond to the binding of acetylcholine (ACh), which is synthesized, stored and finally released by cholinergic neurons. Like other transmembrane receptors, AChRs have been classified according to either their pharmacological properties or their relative affinities for various molecules, and can therefore be further divided into: i) nicotinic AChRs, which are particularly responsive to nicotine and ii) muscarinic AChRs, which are particularly responsive to muscarine. AChRs are involved in myasthenia gravis (MG) and many other physiological disorders, mainly affecting the central and peripheral nervous system. In MG, autoantibodies are directed against the nicotinic AChR at the neuromuscular junction. The disease is characterized by various symptoms, including muscle weakness and fatigability, due to defective neuromuscular transmission. To obtain an insight into the role of the various anti-AChR antibody specificities in MG, we isolated and studied the in vitro and in vivo activity of autoantibodies targeting individual AChR subunits. Using recombinant proteins corresponding to extracellular domains (ECDs) of individual AChR subunits as immunoadsorbents; we isolated autoantibodies which specifically bind to these subunits. We then used the well established TE671 human muscle cell line to examine the in vitro functions of subunit-specific autoantibody populations through their ability to induce nAChR antigenic modulation. Isolated subunit-specific autoantibodies were also used to determine their capacity to passively transfer experimental MG into lab animals. Our results clearly demonstrated that autoantibodies against the α1 or β subunit can cause AChR loss via antigenic modulation in a dose-dependent manner, the anti-α1 autoantibodies being much more effective than the anti-β autoantibodies. Furthermore, we showed that the autoantibody-depleted sera were much less effective, or were completely inactive, at causing AChR loss. In in vivo experiments, the administration of MG sera derivatives to lab animals showed that sera enriched in anti-α1 autoantibodies, as well as the corresponding pure anti-α1 autoantibodies from two individuals, are efficient in inducing MG like symptoms to the animals. A single serum contained almost 100% anti-β antibodies and the corresponding purified antibodies did not cause any clinical MG symptoms. The depleted fraction of MG sera tested, induced mild symptoms or no symptoms were observed, and this is in agreement with the in vitro results, strongly suggesting that the anti-AChR autoantibodies in MG sera and mainly the anti-α1 specificities are the sole pathogenic factor in anti-AChR antibody-seropositive MG.

Η βαριά μυασθένεια (Myasthenia Gravis, MG) είναι μια αυτοάνοση νόσος η οποία χαρακτηρίζεται από διαταραχή στη νευροδιαβίβαση στο επίπεδο της νευρομυϊκής σύναψης. Η διάγνωση της MG βασίζεται στην κλινική συμπτωματολογία η οποία συνεπικουρείται από φαρμακολογικές, ηλεκτροφυσιολογικές και απεικονιστικές δοκιμασίες και επιβεβαιώνεται συνήθως από την ορολογική ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι συστατικών της νευρομυϊκής σύναψης. Οι σύγχρονες διαγνωστικές δοκιμασίες είναι συνήθως ικανές προς ανίχνευση της παρουσίας αντισωμάτων στο 85-90% περίπου των μυασθενών με γενικευμένη MG και στο 50% περίπου των ασθενών με οφθαλμική MG. Το κενό αυτό στη διάγνωση της MG δημιουργεί ένα σημαντικό πρόβλημα στις περισσότερες περιπτώσεις που ελέγχονται επειδή ένα αρνητικό αποτέλεσμα (το οποίο είναι το συχνότερο αποτέλεσμα στη συνήθη εργαστηριακή διάγνωση της MG) αφήνει μία ασάφεια σχετικά με την ύπαρξη MG. Πράγματι, ακόμη και ένας πολύ χαμηλός τίτλος θα μπορούσε να είναι επαρκής για να εξηγήσει την παρουσία της μυασθένειας, δεδομένου ότι δεν έχει διαπιστωθεί σημαντική συσχέτιση μεταξύ του τίτλου των αντισωμάτων και της σοβαρότητας της νόσου στον πληθυσμό των ασθενών. Ως εκ τούτου, υπάρχει αυξανόμενη ανάγκη για την ανάπτυξη ιδιαίτερα ευαίσθητων διαγνωστικών μεθόδων, για την αναμφισβήτητη απόδειξη της νόσου. Η πλέον ευαίσθητη διαγνωστική δοκιμασία είναι η ραδιολογική ανοσοκαθίζηση (Radioimmunoprecipitation assay, RIPA) και ο πλέον σημαντικός περιοριστικός παράγων για την ανίχνευση χαμηλού τίτλου αντισωμάτων, είναι η αδυναμία χρήσης μεγάλου όγκου ορού (μέγιστο είναι ~5-20 μl), η οποία θα καθιστούσε αναγκαία την επακόλουθη χρήση υψηλού όγκου αντί-ορού και η οποία θα οδηγούσε σε υπερβολικά μεγάλα άνοσο-ιζήματα, τα οποία με τη σειρά τους συνδέονται με απαράδεκτα επίπεδα μη ειδικού θορύβου υπόβαθρου. Με την ανάπτυξη στην παρούσα μελέτη της RIPA δύο-σταδίων ξεπεράσθηκαν σε μεγάλο βαθμό τα προβλήματα αυτά. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στην ακινητοποίηση του αντιγόνου-στόχου σε ένα αδιάλυτο υπόστρωμα, ακολουθούμενη από την επώαση με μεγάλους όγκους (π.χ. 0,1-1ml) του προς εξέταση ορού και την επακόλουθη απελευθέρωση των προσδεμένων αντισωμάτων με μικρό όγκο διαλύματος χαμηλού pH, τα οποία στη συνέχεια ανιχνεύονται και τιτλοδοτούνται με απλή RIPA με τη χρήση 125I-σημασμένων αντιγόνων. Δηλαδή χρησιμοποιήθηκε η αρχή του καθαρισμού με χρωματογραφία συγγένειας με όχι αυστηρό αλλά με απλό και εύκολο τρόπο, προκειμένου να εμπλουτισθεί ο ορός σε μεγάλο βαθμό στα ειδικά για το αντιγόνο αντισώματα πριν από τον προσδιορισμό και την τιτλοποίηση τους με τις συνήθεις ανοσολογικές δοκιμασίες. Έγινε προσπάθεια ανάπτυξης της προσέγγισης αυτής για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του AChR και έναντι της MuSK. Έγιναν πολλές προσπάθειες για την εφαρμογή της για την ανίχνευση αντί-AChR αυτοαντισωμάτων. Σημειώθηκε μεγάλη πρόοδος, αλλά απαιτούνται επιπρόσθετες βελτιώσεις για την εφαρμογή της στην διάγνωση ρουτίνας. Για την ανίχνευση των αντί-MuSK αυτοαντισωμάτων με την προσέγγιση αυτή επετεύχθη σημαντικότερη βελτίωση. Η παρούσα συστηματική προσέγγιση απεδείχθη τουλάχιστον 20-50 φορές περισσότερο ευαίσθητη από την κλασική RIPA. Όλοι οι οροί οι οποίοι είχαν χαρακτηρισθεί προηγουμένως ως θετικοί ή αρνητικοί με την κλασική RIPA βρέθηκαν όπως αναμενόταν επίσης θετικοί ή αρνητικοί αντίστοιχα. Επιπλέον όμως μερικοί εκ των ορών οι οποίοι στο παρελθόν είχαν χαρακτηρισθεί ως αμφίβολοι βρέθηκαν σαφώς θετικοί, ή μερικοί άλλοι οι οποίοι είχαν χαρακτηρισθεί ως αρνητικοί αλλά παρουσίαζαν τίτλους ελαφρά υψηλότερους του μηδενός, αλλά όχι στατιστικά σημαντικούς ώστε να αξιολογηθούν ως υψηλότεροι του υπόβαθρου, βρέθηκαν θετικοί, ενώ άλλοι εξακολουθούν να παραμένουν αρνητικοί. Η δοκιμασία που αναπτύξαμε ήταν αρχικά περισσότερο επίπονη από ότι η κλασική RIPA, αλλά με την ανάπτυξη σημαντικών βελτιώσεων, η διαδικασία αυτή έχει απλουστευθεί ώστε να είναι δυνατός ο ταυτόχρονος έλεγχος μεγάλου όγκου (0,1-1 ml) πολλαπλών δειγμάτων ορών και έχει καταστεί δυνατή η χρήση της στην καθημερινή διάγνωση. Η βελτιωμένη αυτή μέθοδος εφαρμόζεται σήμερα για την ανίχνευση αντί-MuSK αντισωμάτων και αποσκοπεί στην ανίχνευση πολύ μικρών ποσοτήτων αυτοαντισωμάτων στον ορό των μυασθενικών οι οποίοι έχουν χαρακτηρισθεί ως οροαρνητικοί ή αμφίβολοι. / Myasthenia Gravis (MG), is an autoimmune disease, characterized by impairment in neurotransmission at the neuromuscular junction level. The diagnosis of MG is based on clinical symptomatology, assisted by pharmacological, electrophysiological and imaging tests and is usually confirmed by serological detection of autoantibodies to components of the neuromuscular junction. The available diagnostic tests are usually able to detect the presence of antibodies in 85-90% of myasthenic patients with generalized MG and 50% of patients with ocular MG. This gap in the diagnosis of MG creates a major problem in most cases during diagnosis because a negative result (which is the most common result in ordinary laboratory diagnosis of MG) leaves an ambiguity regarding the existence of MG. Even a very low titer of specific antibodies, would be sufficient to explain the presence of myasthenia, since there has been no significant correlation between the titer of antibodies and the severity of disease among patients. Therefore, there is increasing need for the development of highly sensitive diagnostic methods for the unambiguous confirmation of the disease. The most sensitive diagnostic test so far, is the radiological immunoprecipitation assay (Radioimmunoprecipitation, RIPA) and the most important limiting factor for detecting low antibody titer, is the inability to use large volumes of serum (maximum is ~ 5- 20 ml), which would require the subsequent use of high-volume of anti-serum, which will result in excessively large immuno-sediments, which in turn are associated with unacceptable levels of nonspecific background values. With the development of two-step RIPA assay in this study we have largely overcome these problems. This test is based on the immobilization of target antigen to an insoluble substrate, followed by incubation with large volume (eg 0,1-1ml) of the test serum and release of bound antibodies with small volume of low pH solution, which are then detected and titrated with simple RIPA using 125I-labeled antigens. We used the principle of enrichment of serum to a large extent in antigen-specific antibodies by affinity purification with no strict but simple and easy way, before the final identification and titration of specific antibodies with standard immunoassays. We attempted the development of this approach in order to detect antibodies against AChR and MuSK. Numerous efforts have been made to implement this method in order to detect AChR autoantibodies, but although there was substantial progress, additional improvements are required for its application in routine diagnosis. With this approach we achieved significant improvement for detection of anti- MuSK autoantibodies. This systematic approach was proved to be at least 20-50 times more sensitive than classical RIPA. All sera which were previously classified as positive or negative with standard RIPA were also positive and negative respectively, as expected. In addition some of the sera which were previously classified as ambiguous were clearly positive and some others who were classified as negative but were slightly higher than zero, but not statistically significant so as to assess them as higher than the background, were positive, while others still remain negative. This newly developed test was originally more laborious than the classical RIPA, but with the development of significant improvements, the process has been simplified and allows the simultaneous testing of large volumes (0,1-1 ml) of multiple serum samples and its use has been made possible in everyday diagnosis. This improved method is currently applied to detect anti-MuSK antibodies and is designed to detect very small amounts of autoantibodies in the serum of myasthenic patients who are classified as seronegative or ambiguous.