Η Πακλιταξέλη αποτελεί ένα από τα πιο ευρέως διαδεδομένα χημειοθεραπευτικά φάρμακα και ενδείκνυται κυρίως σε καρκίνο του πνεύμονα, του μαστού, των ωοθηκών, καθώς και σε σάρκωμα Kaposi ασθενών με AIDS. Ωστόσο, η χρήση της συνδέεται με αρκετές παρενέργειες, γεγονός που επέβαλε την τροποποίησή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης (DDS). Τα συγκεκριμένα συστήματα επιτρέπουν την εκλεκτική μεταφορά του φαρμάκου στον καρκινικό ιστό με μηχανισμούς παθητικής ή ενεργητικής στόχευσης, καθώς και τον έλεγχο του φαρμακοκινητικού προφίλ. Ιδιαίτερα ελπιδοφόρα φαίνεται να είναι η ενσωμάτωση της PTX σε πολυμερικές νανοκάψουλες. Η δομή πυρήνα - κελύφους των νανοκαψακίων καλύπτει τη χορήγηση μίας μεγάλης ποικιλίας ενεργών συστατικών, με το ενδιαφέρον να εστιάζεται σε αντινεοπλασματικά, αντιφλεγμονώδη, αντιικά και ανοσοκατασταλτικά. Η εισαγωγή των φαρμάκων στα νανοκαψάκια μπορεί να οδηγεί σε αύξηση της αποτελεσματικότητας και σταθερότητας των δραστικών ουσιών, καλύτερη in vivo συμπεριφορά και υψηλότερη ενδοκυτταρική πρόσληψη. Ορισμένες μελέτες προτείνουν την εγκαψακίωση νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) σε συστήματα χορήγησης φαρμάκων, τα οποία έχουν αποδειχθεί πολύτιμα εργαλεία τόσο στον τομέα της διάγνωσης (μαγνητική τομογραφία πυρηνικού συντονισμού), όσο και της θεραπείας. Με εφαρμογή εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου καθίσταται εφικτή η συσσώρευση των μαγνητικών νανοφορέων στον ιστό - στόχο (μαγνητική στόχευση), ενώ η θεραπεία επέρχεται μέσω επαγωγής μαγνητικής υπερθερμίας. Η εν λόγω μεταπτυχιακή διατριβή πραγματεύεται την εγκαψακίωση της ΡΤΧ και των SPIONs σε πολυμερικές νανοκάψουλες, παρασκευασμένες από το συμπολυμερές πολυ(γαλακτικού οξέος) – πολυ(αιθυλενογλυκόλης) (PLA-PEG). Το PLA αποτελεί ένα βιοαποικοδομήσιμο πολυμερές, το οποίο δημιουργεί έναν πυρήνα, ικανό να εγκαψακιώσει και να προστατέψει υδρόφοβες ουσίες. Από την άλλη μεριά, το PEG είναι ένα υδρόφιλο, βιοσυμβατό πολυμερές, το οποίο προσδίδει στερεοχημική σταθεροποίηση στα συστήματα και παρατείνει το χρόνο κυκλοφορίας τους. Πιο συγκεκριμένα, παρασκευάστηκαν μαγνητικά νανοκαψάκια με συμπολυμερή PLA-PEG, διαφορετικού μοριακού βάρους, με τη μέθοδο της καθίζησης (nanoprecipitation). Οι μαγνητικοί νανοκρυσταλλίτες συντέθηκαν με την τεχνική της θερμικής αποικοδόμησης, ενώ ως πρόδρομη ένωση χρησιμοποιήθηκε ελαϊκός σίδηρος [Fe(Olate)3]. Διερευνήθηκαν διάφορες παράμετροι σχετικά με την σύνθεση (ποσότητα SPIONs, αναλογία πολυμερούς/ελαίου, ποσότητα φαρμάκου), έτσι ώστε να δημιουργηθούν βέλτιστοι νανοφορείς. Επιπλέον, εξετάστηκε η σταθερότητα των διασπορών τόσο στο χρόνο, όσο και στην παρουσία ηλεκτρολυτών (NaCl) με μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου και του επιφανειακού φορτίου, χρησιμοποιώντας την τεχνική της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Ακολούθησε μορφολογική εκτίμηση των νανοκαψακίων με τη βοήθεια ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διάδοσης (ΤΕΜ) και δομικός χαρακτηρισμός τους μέσω φασματοσκοπίας FTIR. Σε επόμενο στάδιο, μετρήθηκε το ποσοστό φόρτωσης της ΡΤΧ με χρήση υγρής χρωματογραφίας (HPLC) και πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης, παρουσία και μη εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου, σε διάλυμα φωσφορικών (pH =7.4) στους 37 oC για 24 h. Τέλος, εξετάστηκε η κυτταροτοξικότητα των «φορτωμένων» (με ΡΤΧ) μαγνητικών νανοκαψακίων και συγκρίθηκε με εκείνη των «κενών» νανοφορέων, αλλά και του φαρμάκου. Ο έλεγχος αυτός πραγματοποιήθηκε με χρώση καρκινικών κυττάρων (σειρά Α549) από ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και μέτρηση του φθορισμού των νεκρών κυττάρων από κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα ήταν ιδιαιτέρως ικανοποιητικά, καθώς οι νανοφορείς παρουσιάζουν σταθερότητα στο χρόνο (έλεγχος περιόδου ενός μηνός), αλλά και παρουσία ηλεκτρολυτών. Το ποσοστό φόρτωσης της ΡΤΧ υπολογίστηκε ~1.2 %, ενώ η απόδοση εγκαψακίωσης κυμαινόταν από 15 - 25 %. Επίσης, παρουσίασαν υψηλή απόδοση εγκαψακίωσης SPIONs (~65 %), εξαρτώμενη από την πολυμερική σύνθεση των νανοφορέων. Οι μελέτες απελευθέρωσης παρουσίασαν παρατεταμένη αποδέσμευση της πακλιταξέλης, η οποία αποκρίνεται σε παρουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Τέλος, τα «κενά» (χωρίς φάρμακο) μαγνητικά νανοκαψάκια δεν παρουσίασαν κυτταροτοξικότητα, σε αντίθεση με τα «φορτωμένα» με φάρμακο, τα οποία προκάλεσαν μεγαλύτερη τοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα και από το ελεύθερο φάρμακο. Τα παραπάνω αποτελέσματα δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής χρησιμοποίησης των PLA-PEG μαγνητικών νανοκαψακίων ως φορείς στοχευμένης χορήγησης της Πακλιταξέλης. / Paclitaxel is one of the most widely used chemotherapeutic drugs and is particularly suitable to lung, breast, ovarian cancer and AIDS - related Kaposi sarcoma. However, its use is associated with several side effects, certain of them attributable to the formulation used clinically today, which imposed its formulation in Targetable Drug Delivery Systems (TDDS). These systems allow selective delivery of drug in the tumor tissue by passive or active targeting mechanisms and control of the pharmacokinetic profile. Particularly promising appears to be the encapsulation of PTX in polymeric nanocapsules. The core - shell structure of the nanocapsules covers the delivery of a wide variety of active ingredients, with interest focused on anti-neoplastic, anti-inflammatory, antiviral and immunosuppressive. The nanoencapsulation of drugs can increase the efficiency and the stability of active substances, while allowing better in vivo behavior and higher intracellular uptake. Some studies suggest the encapsulation of iron oxide nanoparticles (SPIONs) in such systems, which have been proven valuable tools in both diagnosis (through nuclear magnetic resonance imaging) and therapy. The application of an external alternating magnetic field permits the accumulation of magnetic nanocarrier in target-tissue (magnetic targeting), while the treatment occurs by inducing magnetic hyperthermia. This thesis discusses the encapsulation of PTX and SPIONs in polymeric nanocapsules, prepared from biocompatible poly (lactic acid) - poly (ethylene glycol) (PLA-PEG) copolymers. The PLA is a biodegradable polymer, which generates a core capable to encapsulate and protect hydrophobic substances. On the other hand, the PEG is a hydrophilic, biocompatible polymer, which gives steric stabilization systems and prolong their circulation time after intravenous administration. Specifically, magnetic nanocapsules were synthesized with varying molecular weight of copolymers PLA-PEG through the nanoprecipitation method, while the magnetic nanoparticles were composed through thermal decomposition and oleate iron [Fe (Olate) 3] was used as a precursor. The optimum parameters were determined, conferring to the nanocapsules high stability. In addition, they were characterized with regard to their size and zeta potential at different salt concentrations (up to 2M NaCl) using dynamic light scattering (DLS). Then, the morphological characteristics of nanocapsules were evaluated by transmission electron microscopy (TEM) and their structural characterization by spectroscopy FTIR. In the next step, the Paclitaxel loading was determined with liquid chromatography (HPLC) and release studies were conducted in phosphate buffer (pH = 7.4) at 37 oC for 24 h, including triggered drug-release by application of AC magnetic field. Finally, the cytotoxicity of drug-loaded (with PTX) magnetic nanocapsules was tested and compared to that of blank (without drug) nanocarriers and free drug. For these studies the cancer cell line A549 was used and after their incubation with the nanocapsules or the free drug, the dead cells were stained by propidium iodide (PI) and measured by flow cytometry. The obtained results were particularly satisfactory, as nanocarriers show stability over time (up to one month) and at high salt concentrations, much higher than the physiologic one. The loading of PTX was measured to be 1.2%, for a theoretical loading of 1.9 %, and the yield of encapsulation ranged from 15-25%. The nanocapsules also showed high encapsulation efficiency for SPIONs (~ 65%), depending on the polymeric composition of nanocarriers. Drug release studies showed that the nanocapsules exhibited controlled release properties. Furthermore, the release appeared to respond to the presence of external magnetic field. Finally, the «blank» magnetic nanocapsules did not exhibit cytotoxicity, whereas the «loaded» nanocarriers caused higher toxicity than the free drug. These results justify further investigation of the PLA-PEG magnetic nanocapsules as drug delivery systems of Paclitaxel.

Η σισπλατίνη αποτελεί ένας ευρέως διαδεδομένο αντικαρκινικό φάρμακο. Ωστόσο προκαλεί σοβαρές παρενέργειες εξαιτίας της έλλειψης εκλεκτικότητας που παρουσιάζει. Για αυτόν το λόγο, γίνεται προσπάθεια ενκαψακίωσης της σισπλατίνης σε νανοφορείς ώστε να επιτευχθεί η εκλεκτική μεταφορά της στον καρκινικό ιστό με μηχανισμούς παθητικής ή ενεργητικής στόχευσης. Στην παρούσα εργασία, παρασκευάστηκαν μαγνητικοί νανοφορείς σισπλατίνας και ελέγχθησαν οι ιδιότητες φόρτωσης με σισπλατίνη και αποδέσμευσης, η κολλοειδής σταθερότητα και η in vitro αντικαρκινική δραστικότητα. Τα νανοσωματίδια (οι μαγνητικοί νανοφορείς) συντέθηκαν με τη σύνδεση του συμπολυμερούς πολυμεθακρυλικό οξύ – πολυαιθυλενογλυκόλη (poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate)) σε μαγνητικούς νανοκρυσταλλίτες. Ενώ το πολυμεθακρυλικό οξύ παρέχει τις απαραίτητες καρβοξυλομάδες στο σύστημα για τη σύνδεση της σισπλατίνης, οι αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης προσφέρουν στερεοχημική σταθεροποίηση στα νανοσωματίδια. Αρχικά παρασκευάστηκαν μαγνητικοί νανοφορείς με διαφορετικούς τύπους p(MAA-g-EGMA) συμπολυμερών τα οποία διέφεραν ως προς το μήκος και την πυκνότητα των αλυσίδων PEG. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της υδρολυτικής, αλκαλικής καταβύθισης από μία πρόδρομη ένωση δισθενούς σιδήρου παρουσία των παραπάνω συμπολυμερών. Οι νανοφορείς σε επόμενο στάδιο φορτώθηκαν με τη σισπλατίνη μετά από επώαση τους με το φάρμακο. Επιπλέον διερευνήθηκε η επίδραση του pH στην φόρτωση της σισπλατίνης. Οι νανοφορείς χαρακτηρίστηκαν ως προς την υδροδυναμική τους διάμετρο και το επιφανειακό τους φορτίο μέσω της τεχνικής της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) και μικροηλεκτροφόρησης αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης του φαρμάκου από τους νανοφορείς σε διάλυμα φωσφορικών (pH=7.4) στους 37°C. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η επίδραση της εφαρμογής εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου (400 kHz) στην αποδέσμευση της σισπλατίνης από τους νανοφορείς μέσω της πρόκλησης υπερθερμίας. Τέλος, εκτιμήθηκε η κυτταροτοξικότητα των φορτωμένων με σισπλατίνη νανοφορέων και συγκρίθηκε με την κυτταροτοξικότητα των κενών νανοσωματίδιων και του φαρμάκου. Ο έλεγχος κυτταροτοξικότητας πραγματοποιήθηκε μέσω της τεχνικής της κυτταρομετρίας ροής, μετά από χρώση των κυττάρων (Α549, καρκινικά κύτταρα πνεύμονα) με τη χρωστική του ιωδιούχου προπιδίου (PI). Οι p(MAA-g-EGMA) μαγνητικοί φορείς σισπλατίνης που παρασκευάστηκαν στην παρούσα εργασία παρουσίασαν μεγάλη σταθερότητα στο χρόνο ως προς την υδροδυναμική τους διάμετρο και το επιφανειακό τους φορτίο. Επιπλέον παρουσίασαν ικανοποιητική φόρτωση φαρμάκου (6-8%). Η αύξηση του pH (μέχρι 10), η αύξηση των ανιονικών θέσεων (καρβοξυλομάδες) και η μείωση του PEG βρέθηκε να οδηγούν σε αύξηση της φόρτωσης της σισπλατίνης στους νανοφορείς. Παρατηρήθηκε παρατεταμένη αποδέσμευση του φαρμάκου (σισπλατίνης) από τους νανοφορείς, με τον ρυθμό αποδέσμευσης να επηρεάζεται από την πολυμερική σύνθεση των νανοφορέων. Τέλος, οι νανοφορείς παρουσίασαν χαμηλή κυτταροτοξικότητα ενώ οι νανοφορείς φορτωμένοι με σισπλατίνη παρουσίασαν τοξικότητα συγκρίσιμη με αυτήν του φαρμάκου. Με βάση τα ληφθέντα αποτελέσματα, οι p(MAA-g-EGMA) μαγνητικοί νανοφορείς σισπλατίνης έχουν ικανοποιητικές ιδιότητες κολλοειδούς σταθερότητας, φόρτωσης σε φάρμακο και αποδέσμευσης, γεγονός που δικαιολογεί την περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής χρησιμοποίησης τους ως φορείς στοχευμένης χορήγησης σισπλατίνας. / Cisplatin is a potent anticacer agent. However, it exhibits serious side effects due to lack of selectivity. Therefore, a more selective cisplatin delivery to tumors is pursued by incorporating cisplatin in targetable nanocarriers. In this work, hybrid magnetic nano-asssemblies loaded with ciplatin were prepared and evaluated in vitro. The nano-assemblies were synthesized through grafting of poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA-g-EGMA) on magnetite nanocrystallites. Poly(ethylene glycol) chains confer to the nanocarriers bio-repellent properties. The formation of a distinct second inner polymeric corona with an abundance of carboxylate groups provides the binding sites for cisplatin molecules. Different types of p(MAA-g-EGMA) copolymers with varying length and density of PEG chains were synthesized. Core-shell magnetic nano-assemblies were prepared by hydrolytic alkaline precipitation from a single ferrous molecular precursor in the presence of the above p(MAA-g-EGMA) copolymers . The nano-assemblies were loaded with cisplatin by incubating them with cisplatin solutions of different cisplatin concentration. The nano-assemblies were characterized with regard to their size and zeta potential at different salt concentrations using dynamic light scattering (DLS). The effect of pH on cisplatin loading was investigated. Drug release studies were performed spectrophotometrically in phosphate buffered saline (pH 7.4) at 37°C. The influence of applying an AC magnetic field on the release profile of cisplatin was also investigated using a home-made AC (400 kHz) magnetic field generator 5 mT. The cytotoxicity of blank and cisplatin-loaded nano-assemblies against A549 human lung cancer cell line was assessed by flow cytometric measurement of cellular fluorescence after staining with propidium iodide (PI). The nanocarriers had suitable size properties for intravenous administration and accumulation to tumors based on the enhanced permeability and retention phenomenon (EPR effect). They also were found to exhibit very good colloidal stability, satisfactory cisplatin loading efficiency (around 6% w/w at optimum experimental conditions) and sustained drug release properties, with the rate of release to be significantly increased in response to external AC magnetic fields. Furthermore, the blank nanocarriers did not exhibit cytotoxicity whereas the cisplatin-loaded nanocarriers exhibited comparable to the free ciplatin cytotoxicity against A549 cancer cells. The obtained results justify further evaluation of p(MAA-g-EGMA) nanocarriers as targeted drug delivery system of cisplatin.