Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε περαιτέρω η δυνατότητα ανάπτυξης νανοσωματιδίων ελεγχόμενης χορήγησης και (παθητικής) στόχευσης σισπλατίνας με βάση τα PLGAmPEG συμπολυμερή. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών παρασκευής στο μέγεθος των λαμβανομένων νανοσωματιδίων και στην φόρτωση και την ενκαψακίωση της σισπλατίνας σε PLGA(40)mPEG(5) νανοσωματίδια. Στη συνέχεια έγινε μελέτη της αντικαρκινικής δραστικότητας νανοσωματιδίων φορτωμένων με σισπλατίνη, τριών διαφορετικών πολυμερικών συστάσεων PLGA(7)mPEG(5) PLGA(31)mPEG(5) και PLGA(57)mPEG(5), έναντι LNCaP καρκινικών κυττάρων προστάτη και σύγκριση αυτής με την δραστικότητα του ελεύθερου φαρμάκου απέναντι στην ίδια καρκινική σειρά. / In the present work was investigated further the possibility of growth of nanoparticles with PLGAmPEG copolymers. Initially it was studied the effect of preparation conditions in the size of the nanoparticles and in the loading and the encapsulation of cisplatin in PLGA(40)mPEG(5) nanoparticles. Afterwards we studied the anticancer efficacy of cisplatin loaded nanoparticles , of three different polymeric constitution PLGA(7)mPEG (5), PLGA(31)mPEG(5) and PLGA(57)mPEG(5), opposite of LNCaP cancer cells and comparison of this with the efficacy of the free medicine towards the same cancer cells.

Ανάμεσα στα διάφορα είδη του γένους Crocus, ο C. sativus έχει μελετηθεί εκτενώς ως προς τη σύσταση και τις βιολογικές ιδιότητες των στύλων του, οι οποίοι αποτελούν το γνωστό άρτυμα (κρόκος ή ζαφορά) το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως στη Μεσογειακή, την Ινδική και την Κινέζικη μαγειρική. Ανά τους αιώνες, στον κρόκο έχουν αποδοθεί πολλές θεραπευτικές ιδιότητες. Παρά την ύπαρξη πολλών μελετών, οι οποίες αναφέρουν ότι η κροκετίνη και οι κροκίνες από τον κρόκο έχουν ποικίλες βιολογικές δράσεις, θέματα που αφορούν στον τρόπο χορήγησης του κρόκου καθώς και στην απορρόφηση και στο μεταβολισμό των καροτενοειδών του σε ανθρώπους δεν έχουν ακόμα απαντηθεί. Στην παρούσα μελέτη, ισοκρατική μέθοδος υγρής χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε για την ανίχνευση κροκετίνης σε πλάσμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλή συγκέντρωση της κροκετίνης μετά από 2 ώρες (1.24 -3.67 μΜ) και παρουσία της ακόμα και στις 24 ώρες (0.10-0.24). Ενδιαφέρον προκαλεί η παρουσία του cis-ισομερούς σε ποσοστά 25 με 50%, προτείνοντας in vivo ισομερείωση. Με χρήση υγρής χρωματογραφίας (HPLC) και UV/vis φασματοσκοπίας δείχνουμε για πρώτη φορά την παρουσία υδρόφιλων καροτενοειδών στους στύλους τριών ενδημικών ειδών Crocus: C. boryi ssp. tournefortii, C. boryi ssp. boryi και C. niveus και ότι στα ενδημικά είδη η αλκαλική υδρόλυση οδηγεί σε ένα άγλυκο trans-καροτενοειδές. Με σκοπό την περαιτέρω έρευνα ως προς την επίδραση των μεθανολικών εκχυλισμάτων αλλά και συστατικών του saffron στον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων του μαστού, εφόσον ο καρκίνος του μαστού αποτελεί κύρια αιτία θανάτου σε γυναίκες, χρησιμοποιήσαμε τις κυτταρικές σειρές MCF-7 και MDA-MB-231 ενώ μετρήθηκε και η επίδραση στην διηθητικότητα της κυτταρικής σειράς MDA-MB-231. Μετά από επώαση 24 ωρών, η κροκετίνη ανέστειλε σημαντικά όχι μόνο τον πολλαπλασιασμό αλλά επίσης την διήθηση, στις συγκεντρώσεις 1 και 10 μM. Μελέτες όσον αφορά στις μοριακές αλλαγές στην έκφραση των MMPs και των TIMPs, έδειξαν σημαντική μείωση στη γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση των MT1-MMP και MT2-MMP και των ζελατινασών. / Among the different species of Crocus, only C. sativus has been extensively studied for the composition and the biological properties of its styles, since these constitute the well-known spice saffron, which is widely used in the Mediterranean, Indian and Chinese diet. Throughout centuries, saffron is attributed with many therapeutic uses. Crocetin is a carotenoid dicarboxylic acid, which in nature is esterified with glucose or gentiobiose units forming the crocins, abundant components of saffron (a spice with many reputed medicinal uses). Although studies have demonstrated that crocetin and crocins from saffron have various biological functions, issues concerning the route and way of saffron administration, the absorption and metabolism of saffron carotenoids in humans have not been answered yet. In the present study, an isocratic reversed-phase liquid chromatographic method was developed and validated for the determination of crocetin in plasma. Samples were pre-treated by solid phase extraction (recoveries >72%) and were chromatographed on a Luna C-18 column (4.6 mm x 250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of methanol/water/trifluoroacetic acid (75.0/24.5/0.5, % v/v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1. The HPLC method developed resulted in sharp peaks at 10.7 (trans-crocetin) and 18.6 min (cis-crocetin), whereas the calibration curve of total crocetin in plasma displayed a good linearity for concentrations of 0.020 to 20 μΜ (R2=0.999). Specificity, precision, accuracy and stability were also studied with spiked plasma samples and were acceptable. The developed method was applied to the determination of crocetin levels in plasma of four healthy human volunteers before and after consumption of one cup of saffron infusion (200 mg of saffron in water 80°C for 5 min). Results showed that the concentration of crocetin was high after 2h (1.24 -3.67 μΜ) and still determined after 24 h (0.10-0.24). Interestingly, the percentage of the cis-isomer ranges from 25 to 50%, suggesting in vivo isomerization. With high performance liquid chromatography (HPLC) and UV/vis spectroscopy we show for the first time, the presence of hydrophilic carotenoids in the styles of three other Crocus taxa, endemic in Greece: C. boryi ssp. tournefortii, C. boryi ssp. boryi and C. niveus. In order to investigate the effect of the methanolic extracts and the constituents of saffron on breast cancer cell proliferation, since breast cancer is a major cause of death among women, we used the cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Incubation for 24 and 48 h showed an inhibitory effect on cell proliferation. Studies on the effect of constituents of C. sativus styles showed that the antiproliferative effect is mainly attributed to crocetin. In order to further study the effect of crocetin, the active metabolite of crocins, on breast cancer cells, we used the highly invasive MDA-MB-231 cells and measured the viability with the WST-1 assay and the invasiveness through a reconstituted basement membrane. After 24 h incubation, crocetin inhibited not only proliferation but also invasion significantly at the physiological relevant concentrations of 1 and 10 μM. Studies in the molecular changes of expression of MMPs and their endogenous inhibitors (TIMPs), were performed following reversed transcription and polymerase chain reaction, whereas protein expression and gelatinolytic activity were determined with Western blotting and zymography. The gene and protein expression of MT1-MMP and MT2-MMP were greatly attenuated by both crocetin and all-trans-retinoic acid (ATRA, used as control). Incubation with 10 μM crocetin for 24 h in serum free conditions reduced pro-MMP-9 levels, whereas when cultured in media with sera 2 and 5%, it also reduced gelatinase protein expression. Crocetin and ATRA also upregulate TIMP-1 and TIMP-3 mRNA expression and downregulate TIMP-2 expression.

Η αλματώδης πρόοδος που έχει γινει τα τελευταία χρόνια στην αποκωδικοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών και η σημαντική αποσαφήνιση των κυτταρικών στοιχείων που εμπλέκονται στην γένεση, την ανάπτυξη, την εξάπλωση του καρκίνου, έχει στρέψει ένα σημαντικό κομμάτι της επιστημονικής κοινότητας προς την κατεύθυνση ανακάλυψης χημικών αναστολέων του κυτταρικού κύκλου. Εξέχοντα ρόλο σε αυτή τη διαδικασία παίζουν οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (cyclin dependent kinases, CDKs). Οι CDKs είναι μια οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/θρεονίνης, οι οποίες ενεργοποιούνται σε συγκεκριμένα σημεία του κυτταρικού κύκλου. Η απορρύθμισή τους συμβάλλει στην εκδήλωση παθολογικών καταστάσεων όπως νεοπλασιών και νευροεκφυλιστικών παθήσεων. Η παρούσα εργασία είχε σαν στόχο τη δημιουργία μικρών μορίων που θα αποτελέσουν πρόδρομα σταδια για την σύνθεση ενώσεων οι οποίες θα μελετηθούν ως προς την ικανότητα τους να αναστείλουν την δράση διαφόρων πρωτεϊνικών κινασών, μεταξύ άλλων και των κυκλινο-εξαρτώμενων κινάσων (CDKs). Κατέστη δυνατόν να συντεθεί η ένωση 11 η οποία έχει λειτουργικές ομάδες οι οποίες, αν τροποποιηθούν κατάλληλα, μπορούν να μας δώσουν πρόδρομα μόρια για την σύνθεση τελικών ενώσεων. / The rapid progress made in recent years to decode the signaling pathways and important clarification cellular components involved in the genesis, development, spread of cancer, has turned an important part of scientific community towards the discovery of chemical inhibitors of cell cycle. Prominent role in this process played by cyclin-dependent kinases (cyclin dependent kinases, CDKs). The CDKs are a family of protein serine / threonine kinases that are activated in specific parts of the cell cycle. Deregulation contributes to the onset illnesses such as cancer and neurodegenerative diseases This work was aimed at the creation of small molecules that will be precursor stages to synthesize compounds which will be studied in their ability to inhibit the action of various protein kinases including the cyclin-dependent kinases (CDKs). It was possible to synthesize the compound 11 which has functional groups which, if modified properly, can give us precursor molecules for the synthesis of final compounds.

Le cancer est un problème majeur de santé public avec une estimation de plus de 1,3 millions de décès en Europe pour l'année 2013. La recrudescence de résistances vis-à-vis des traitements chimio-thérapeutiques conduit à la recherche de nouvelles substances actives, notamment au sein d'organismes naturels, qui représentent une source infinie de molécules de structure très hétéroclite pouvant avoir des applications thérapeutiques très variées. Dans la première partie de ce projet, nous avons étudié l'effet de la curcumine, molécule extraite à partir du rhizome du Curcuma longa, sur la voie de signalisation Wingless (Wnt) dans le cas du cancer de la prostate. Nos résultats ont démontré que cette molécule naturelle peut être considérée comme une alternative non-toxique pour prévenir la progression du cancer de la prostate et en éradiquer le stade précoce androgéno-dépendant. La seconde partie de notre projet a consisté en l'isolement de molécules anti-cancéreuses à partir de la plante carnivore Dionaea muscipula. Après avoir sélectionné et identifié une substance qui s'est révélé être de la plumbagine, nous avons étudié les raisons pouvant expliquer la différence de cytotoxicité de cette dernière sur des lignées hématopoïétiques. Nos résultats laissent penser que cette molécule affecte les groupements thiols de certaines protéines. En conclusion, ces études du potentiel chimiopréventif de la curcumine dans le cancer de la prostate et celui de la plumbagine dans les leucémies présentent ces molécules d'origine naturelle comme de bons candidats pouvant servir de base au développement des futurs médicaments anti-cancéreux / Today, cancer has become a major public health problem and we estimate more than 1.3 million cancer-related deaths in Europe in 2013. The emergence of cancer resistances towards chemotherapeutic treatments forces to the discovery of new drugs. Natural organisms are a virtually inexhaustible source of molecules structurally very heterogeneous and having varied therapeutic applications. In the first part of this project, we studied the effect of curcumin, a molecule isolated from the roots of Curcuma longa, on the Wingless (Wnt) signalling pathway in the case of prostate cancer. Our results emphasize the chemopreventive potential of curcumin in prostate cancer. This natural molecule can be considered as an alternative modality, non-toxic to prevent the progression of prostate cancer and to eradicate the androgen-dependent early stage. The second part of the project involved the isolation of anti-cancer molecules from the carnivorous plant Dionaea muscipula. After selection and identification of a substance which turned out to be plumbagin, we investigated the possible reasons for the differential plumbagin sensitivity of hematopoietic cell lines. Our results suggest that this molecule affects the thiol groups of some proteins. In conclusion, the example of curcumin as chemopreventive agent in the development of prostate cancer and plumbagin in the treatment of leukemia have shown that naturally occurring substances are excellent candidates for the development of future anti-cancer drugs

Ο καρκίνος, αποτελεί στις μέρες μας μία από τις πιο συνήθεις ασθένειες καθότι προσβάλει ένα μεγάλο μέρος του παγκόσμιου πληθυσμού, ανεξαρτήτου ηλικίας και γι αυτό το λόγο, η θεραπεία του αποτελεί μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της επιστημονικής κοινότητας. Η χορήγηση διαφόρων φαρμάκων έως τώρα, για την αντιμετώπισή του, έχει σαν αποτέλεσμα την προσβολή τόσο των καρκινικών, όσο και των υγειών κυττάρων. Κατά συνέπεια, προκαλούνται ποικίλες παρενέργειες στον ανθρώπινο οργανισμό, ορισμένες πολύ σοβαρές που δεν επιτρέπουν την χορήγηση θεραπευτικών δόσεων. Η νανοτεχνολογία μπαίνει δυναμικά στη μάχη κατά του καρκίνου. Ο σχεδιασμός και η χρήση συστημάτων με μέγεθος στην νανοκλίμακα, προσφέρει νέους τρόπους για τον εντοπισμό, τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου από τα πρώτα κιόλας στάδια και με ελάχιστες παρενέργειες. Τα νανοσωματίδια μακράς κυκλοφορίας (stealth nanoparticles) παρέχουν ένα νέο τρόπο χορήγησης των αντικαρκινικών φαρμάκων, λειτουργώντας ως φορείς που εξαγγειώνονται στην περιοχή του όγκου, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο την εκλεκτική διάθεση του φαρμάκου που περιέχουν στα καρκινικά κύτταρα. Τα σωματίδια αυτά, έχουν την ικανότητα να τροποποιούνται κατάλληλα, ώστε να είναι βιοσυμβατά και να μπορούν να προσκολλούνται στα καρκινικά κύτταρα ή στο μικροπεριβάλλον τους, λειτουργώντας έτσι σαν φορείς στη στοχευμένη χορήγηση αντικαρκινικών φαρμάκων, μειώνοντας την τοξικότητα στους φυσιολογικούς ιστούς. Οι νανοφορείς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, εμφανίζουν σημαντικά προβλήματα, όπως δομική αστάθεια, δομική ετερογένεια και ελλειπή έλεγχο μεγέθους και σχήματος. Κατά συνέπεια, υπάρχει μία συνεχής ανάγκη ανάπτυξης νέων νανοφορέων ή βελτιστοποίηση των ήδη μελετημένων, προκειμένου να μπορούν να αξιοποιηθούν στην κλινική πράξη. Τα φουλλερένια (C60), έχουν κινήσει το ενδιαφέρον των επιστημόνων σε πολλούς τομείς της έρευνας, συμπεριλαμβανομένου της θεραπείας κατά του καρκίνου. Η βιολογική τους σταθερότητα, το μικρό μέγεθος και η ικανότητα πρόσδεσης σε αυτά διαφόρων παραγόντων, όπως πολυμερή, βιοδραστικές ουσίες και μονάδες στόχευσης τα κατέστησε ικανά να λειτουργούν σαν νανοφορείς στη στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων. Το μόνο τους μειονέκτημα είναι η μειωμένη διαλυτότητά τους στο νερό, το οποίο μπορεί να αντιμετωπιστεί με την πρόσδεση σε αυτά υδρόφιλων πολυμερών, όπως είναι η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG). Στην παρούσα εργασία, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της σύνθεσης ενός συζεύγματος πεγκυλιωμένου μορίου φουλλερενίου (C60) με το αντικαρκινικό φάρμακο δοξορουμπικίνη, καθώς και η in vitro αξιολόγηση του τελικού προϊόντος. Στόχος είναι η αύξηση της αποτελεσματικότητας και η μείωση της τοξικότητας του φαρμάκου, μέσω στοχευμένης μεταφοράς στον καρκινικό όγκο. Ένα πεγκυλιωμένο σύζευγμα φουλλερενίου (C60) με δύο μόρια δοξορουμπικίνης (DOX2-C60-PEG, ένωση 4), συντέθηκε επιτυχώς και χαρακτηρίστηκε πλήρως μέσω 1H-NMR, 13C-NMR, IR, UV και TGA. Η δραστικότητα του τελικού προϊόντος, καθώς και ενός ήδη συντεθέντος συζεύγματος με ένα μόριο φαρμάκου DOX-C60-PEG (ένωση 2b), αλλά και του ενδιαμέσου συζεύγματος C60-PEG (ένωση 7) και της υδροχλωρικής δοξορουμπικίνης (DOX•HCl), ενάντια στον καρκίνο ελέγχθηκε in vitro σε καρκινικές σειρές κυττάρων μαστού MCF-7. Τα συζεύγματα DOX2-C60-PEG (4) και DOX-C60-PEG (2b) εμφάνισαν ικανοποιητική δράση αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, συγκρίσιμη με αυτήν του ελεύθερου φαρμάκου, ύστερα από σχετικά μακρό χρόνο επώασης. Μελέτη εντοπισμού της DOX χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι το φάρμακο στην περίπτωση των συζευγμάτων εντοπίζεται πολύ πιο αργά στο πυρήνα του κυττάρου, όπου και μπορεί να εξασκήσει φαρμακολογική του δράση, σε σύγκριση με την ελεύθερη DΟΧ. Αυτό σε συνδυασμό με την αργή απελευθέρωση του φαρμάκου από τα συζεύγματα, όπως έδειξαν πειράματα αποδέσμευσης σε προϊόν λύσης των MCF-7 καρκινικών κυττάρων, ερμηνεύει την συγκριτικά αργή εμφάνιση δράσης στην περίπτωση των συζευγμάτων. Συμπερασματικά στην εργασία συντέθηκαν επιτυχώς φουλλερενικά συζεύγματα δοξορουμπικίνης τα οποία είχαν ικανοποιητική αντικαρκινική δραστικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων ανθρώπινης καρκινικής σειράς. τα αποτελέσματα δικαιολογούν περαιτέρω μελέτες εφαρμογής του φουλλερενίου ως νανοφορέα για την χορήγηση τόσο δοξορουμπικίνης, όσο και άλλων φαρμάκων κατά του καρκίνου. / Until now, the administration of various drugs for its cure, affect both cancer and normal cells. Thus, many serious side effects are caused on the human body, which do not permit the administration of therapeutic doses of potent anticancer drugs. Nanotechnology has entered dynamically”in the battle” against cancer. The design and the use of multifunctional nanoparticulte systems, provides new ways to detect, diagnose and treat cancer in the earliest stages and with minimal side effects. They can extravagate at tumor site, allowing direct drug access selectively to cancer cells. These particles have the capacity to be suitably modified in order to be biocompatible and can be attached to tumor cells or their microenvironment, acting as carriers in targeted delivery of anticancer drugs, reducing toxicity to normal tissues. Drug nanocarriers explored to date, suffer from inherent limitations, including instability, structural heterogeneity and poor control over size and shape. Therefore, there is a continuing need to produce new or optimized, already studied nanocarriers, in order to render possible the use of such advanced nanomedicines in the clinic. Fullerenes (C60), have attracted considerable interest in many fields of research, including the treatment of cancer. Because of their biological stability, their small size, and their ability to be suitably modified, attaching on them biological modifiers and drugs, they can be used as nanocarriers in targeted drug delivery. The main drawback of these carbon particles with regard to their biomedical applications, is their poor solubility to water. We can overcome this problem by attaching on fullerene particles hydrophilic polymers, such as polyethylene glycol (PEG). In the present work, the results of the synthesis and the in vitro biological evaluation of a pegylated fullerene conjugate with the potent anticancer drug Doxorubicin are represented. The main goal is to increase efficacy and reduce toxicity of doxorubicin, through targeted delivery to tumors, by conjugating the drug to pegylated fullerenes. A pegylated fullerene-doxorubicin conjugate with two molecules of drug per fullerene particle (DOX2-C60-PEG, compound 4) has successfully been synthesized and was fully characterized by 1H-NMR, 13C-NMR, IR, UV and TGA. The anticancer activity of conjugates DOX2-C60-PEG (4), DOX-C60-PEG (compound 2b, with one DOX molecule per fullerene particle), and conjugate C60-PEG (control compound 7) and doxorubicin hydrochloride ((DOX•HCl), was evaluated in MCF-7 cancer cells lines. The fullerene-doxorubicin conjugates (2b, 4) exhibited satisfactory anticancer activity (inhibiting cancer cells proliferation), which became comparable to the activity of free drug at relatively long incubation times. In accordance with the relatively slow effect of DOX-C60-PEG conjugates on cells viability, DOX localization studies using fluorescence microscopy indicated that the drug is much more slowly localized in cell nucleus, where the drug can exert its pharmacological action, in the case of conjugates compared to free DOX. In conclusion pegylated fullerene-doxorubicin conjugates were successfully synthesized. These DOX-C60-PEG conjugates exhibited comparable, but with a delayed onset, to free DOX anticancer activity against human cancer cell lines. The results obtained justify further investigation of the potential of these conjugates as anticancer nanomedicines.

Το παρόν πόνημα αναπτύχθηκε προκειμένου να υποδειχθεί η σύνθεση και η μελέτη πολυλειτουργικών μαγνητικών νανοσωματιδίων τα οποία φέρουν μόρια της δραστικής φαρμακευτικής ουσίας Πακλιταξέλη (Ταξόλη - ΤΑXOLTM), ως εναλλακτικός τρόπος χορήγησης με υψηλή ακρίβεια στο στόχο, στο χρόνο και στην ποσότητα που απαιτείται για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαζικού αδένα, εκμεταλλευόμενοι τις ιδιότητες που περιλαμβάνουν το μικρό τους μέγεθος, στην κλίμακα του νανομέτρου,το μεγάλο εμβαδόν της επιφανείας τους, η δυνατότητα διαχείρισής τους από απόσταση και οι σχεδόν μηδενικές παρενέργειες.Τα σωματίδια ενίονται στον οργανισμό και μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας κατευθύνονται με την βοήθεια ενός εξωτερικού μαγνητικού πεδίου στο όργανο-στόχο (στοχευμένη θεραπεία). Η Πακλιταξέλη αποτελεί ευρέως διαδεδομένο αντικαρκινικό παράγοντα, με σημαντικές ωστόσο παρενέργειες λόγω χαμηλής εκλεκτικότητας. Στην παρούσα μελέτη παρασκευάστηκαν μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου βασισμένα σε πολυμερικά μικύλλια PLA-PEG, τα οποία ενθυλάκωσαν την δραστική ουσία, προκειμένου να επιτευχθεί ο σκοπός παρατεταμένης παραμονής και στοχευμένης χορήγησης. Η διαδικασία του πειράματος περιλαμβάνει την σύνθεση παραμαγνητικών αλλά και μη μαγνητικών νανοφορέων, την ανάλυση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων τους με τεχνικές σκέδασης του φωτός και ηλεκτροφόρησης και τον έλεγχο της σταθερότητάς τους σε διαφορετικές συνθήκες. Επιπροσθέτως, εξετάστηκε η δομή τους με ηλεκτρονική μικροσκοπία διαπερατότητας (TEM). Η μελέτη περιλαμβάνει επίσης μελέτες αποδέσμευσης της δραστικής ουσίας από τα νανοσωμάτια, αποβλέποντας στην απόδειξη της παρατεταμένης απελευθέρωσης, ενώ εν συνεχεία εξετάστηκε και η επίδραση εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου στο ρυθμό αποδέσμευσης της πακλιταξέλης. Παράλληλα, μελετήθηκε η τοξικότητα όλων των μαγνητικών νανοσωματιδίων που έφεραν πακλιταξέλη, με στόχο τον προσδιορισμό της επίδρασης στα επιθηλιακά νεοπλασματικά κύτταρα του μαστού. Τα αποτελέσματα της μελέτης οδήγησαν στην εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων για τα μαγνητικά νανοσυστήματα πακλιταξέλης όσον αφορά τις ικανοποιητικές ιδιότητες κολλοειδούς σταθερότητας, ενθυλάκωσης και αποδέσμευσης της δραστικής ουσίας, επιτρέποντας τον σχεδιασμό και την πραγματοποίηση διερευνητικών ενεργειών για την πιθανή χρήση αυτών σε περαιτέρω κλινικές περιπτώσεις. / The aim of the current study is the synthesis and characterisation of multifunctional magnetic nanoparticles of the drug agent Paclitaxel (Taxol)in order to determine their use for the targeted treatment of cancer.This will be an alternative method of administration, which results in high accuracy on the target, boh in time and in the amount of drug required for the treatment of mammary cancer. We exploit tsome of the interesting properties of the nanoparticles for this purpose, such as their small size on the nanometer scale, the large area of their surface, their management ability to remotely and their virtually zero side effects. The particles are injected in the body via the systemic circulation driven by means of an external magnetic field to the target organ (targeted therapy). Paclitaxel is a widely used anticancer agent, with significant side effects, however, due to low selectivity. In the present study were prepared magnetic iron oxide nanoparticles based on polymeric micelles of PLA-mPEG, which encapsulate the active substance, in order to achieve the purpose of sustained residence and targeted delivery. The procedure of the experiment includes the synthesis of paramagnetic and non-magnetic nanoparticles, analysis of their physicochemical properties by techniques of light scattering and electrophoresis and examination of their stability in different conditions. Furthermore, their structure was examined by transmission electron microscopy. The study also includes release studies of the active substance of the nanoparticles, aiming to demonstrate the sustained release, and subsequently theexaminationof the effect of an external alternating magnetic field in the release rate of paclitaxel. We also studied the toxicity of all magnetic nanoparticles carrying paclitaxel to identify the effect on epithelial neoplastic breast cells. The results of the study led to reliable conclusions about magnetic nanosystems of Paclitaxel regarding satisfactory colloidal stability properties, encapsulation and release of the active substance, allowing the design and implementation of further exploratory actions for possible use in further clinical cases.

Η μεταβίβαση του γενετικού υλικού στα θυγατρικά κύτταρα απαιτεί αξιοπιστία στην αντιγραφή του DNA, ακρίβεια στην κατανομή των χρωμοσωμάτων και αποτελεσματικούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι κληρονομήσιμες μεταλλαγές στο γενετικό υλικό. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα, για να πετύχουν αυτή την πιστότητα έχουν αναπτύξει μηχανισμούς επιτήρησης που “παρατηρούν” τις βλάβες στο DNA, ώστε να τις επιδιορθώνουν και να συνεχίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1 είναι ένα κρίσιμο και εξελικτικά συντηρημένο μόριο-στόχος του DNA damage checkpoint, καθώς έκθεση σε ιονίζουσα ή UV ακτινοβολία στοχεύει το Cdt1 για πρωτεόλυση. Το Cdt1 είναι ένα απαραίτητο στοιχείο της αδειοδότησης του κυτταρικού κύκλου (“cell cycle licencing”), και είναι συντηρημένο από τη ζύμη μέχρι τα θηλαστικά. Σε αυτή τη εργασία, μελετάμε την ικανότητα διαφορετικών αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων να επάγουν το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι DNA damage που έχει προκληθεί από τα φάρμακα MMS, Cisplatin και Doxorubicin οδηγεί σε άμεση πρωτεολυτική καταστροφή του Cdt1, ενώ χορήγηση Tamoxifen δεν επηρεάζει τα επίπεδα της πρωτεΐνης Cdt1. Βλάβες στο DNA που έχουν προκληθεί από Etoposide έχουν διαφορετική επίδραση στα πρωτεϊνικά επίπεδα του Cdt1, ανάλογα με την κυτταρική σειρά. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης της Geminin, που είναι αναστολέας του Cdt1. Από τα αποτελέσματά μας προκύπτει ότι οι γενοτοξικές θεραπείες που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου διαφέρουν ως προς την ικανότητά τους να ενεργοποιούν το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1. / The faithful transmission of the genetic material to the daughter cells requires extreme accuracy in DNA replication, precision in chromosome distribution and effective repair mechanisms to minimize heritable mutations affecting the genetic material. To achieve this fidelity, cells have evolved surveillance mechanisms that monitor the structure of DNA and coordinate repair and cell cycle progression. Recent studies revealed that Cdt1 is a critical and evolutionarily conserved target of the DNA damage checkpoint, since exposure to ionizing or UV radiation targets Cdt1 for degradation. Cdt1 is an essential component of the cell cycle licensing machinery that is conserved from yeasts to mammals. We have examined the ability of several anticancer drugs to act through the Cdt1 dependent cell cycle checkpoint. Our findings indicate that DNA damage induced by MMS, Cisplatin and Doxorubicin leads to rapid proteolytic destruction of Cdt1, whereas treatment with Tamoxifen does not affect Cdt1 protein levels. DNA damage induced by Etoposide has differential effect on Cdt1 protein levels, depending on the cell line. There is no change on Geminin expression levels, the protein inhibitor of Cdt1. Our results suggest that genotoxic therapies used against cancer differ in respect to Cdt1 dependent checkpoint.

Η αντικαρκινική ένωση δοξορουβικίνη χρησιμοποιείται ευρέως είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα, στην αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού, των ωοθηκών, του πνεύμονα αλλά και σε περιπτώσεις οξείας λευχαιμίας και σαρκωμάτων. Σε προηγούμενη έρευνα που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο μας, σε λεμφοκύτταρα ανθρώπου αλλά και στην κυτταρική σειρά ποντικού C2C12, βρέθηκε ότι επάγει το σχηματισμό μικροπυρήνων ως αποτέλεσμα κυρίως χρωμοσωματικής θραύσης. Στην παρούσα εργασία, διερευνήθηκε περαιτέρω η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού καθώς και η ικανότητά της να επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης σε λευχαιμικά κύτταρα ανθρώπου HL-60. Η μελέτη του κερματισμού του DNA λόγω της δράσης της δοξορουβικίνης πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης (SCGE) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Εκτιμήθηκαν οι παράμετροι tail length, % DNA in tail, tail moment, και olive tail moment που αποκαλύπτουν θραύση του DNA. Επιπρόσθετα, η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού αναλύθηκε μέσω δημιουργίας κλάσεων με ελάχιστη έως μέγιστη βλάβη. O μηχανισμός με τον οποίο προκαλεί θραύση του DNA διερευνήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης κάτω από αλκαλικές συνθήκες σε συνδυασμό με τη χρήση των επιδιορθωτικών ενζύμων Fpg και hOOG1. Μετέπειτα, εξετάστηκε η ικανότητα της δοξορουβικίνης να επάγει την απόπτωση. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN). Επίσης, με τη μέθοδο CBMN πραγματοποιήθηκε μελέτη του φαινομένου της χρωμοσωματικής θραύσης. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίον η υπό εξέταση χημική ένωση επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης, αναλύθηκε η ικανότητά της να τροποποιεί την έκφραση της κασπάσης-3, μιας πρωτεΐνης που παίζει σημαντικό ρόλο στον καταρράκτη των μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος ανοσοαποτύπωσης της παραπάνω πρωτεΐνης (Western blot). Με βάση τα ευρήματά μας, η δοξορουβικίνη παρουσιάζει θραυσματογόνο δράση, όπως φάνηκε από την αύξηση της εξόδου του DNA από τους πυρήνες των κυττάρων μετά από ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες. Η δημιουργία των ρηγμάτων είναι ισχυρότερη σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού σχετίζεται με την οξείδωση των βάσεων του DNA, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ασταθών σε αλκαλικές συνθήκες θέσεων (alkali labile sites). Επίσης, προκαλεί οριακή αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν, ενώ δε φαίνεται να επάγει τη δημιουργία των μικροπυρήνων στις υψηλότερες συγκεντρώσεις. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με την ιδιότητά της να προκαλεί μεγαλύτερη συχνότητα ρηγμάτων του DNA στις μικρές συγκεντρώσεις. Επιπρόσθετα, επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης. Η επαγωγή αυτή είναι ισχυρότερη σε υψηλές συγκεντρώσεις και δικαιολογεί τις μειωμένες συχνότητες ρηγμάτων και μικροπυρήνων στις συγκεντρώσεις αυτές. Η κασπάση 3 συμμετέχει στην επαγόμενη από τη δοξορουβικίνη απόπτωση όπως φάνηκε από την αύξηση της έκφρασης της κασπάσης 3, μετά από ανάλυση κατά western, σε κυτταρικές καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία δοξορουβικίνης. / The anticancer drug doxorubicin is widely used, either alone or in combination with other anticancer drugs, in the treatment of solid tumours of the breast, lung, ovary, as well as in acute leukemia and sarcomas. Previous research in our laboratory showed that doxorubicin is able to induce micronucleus generation, in human lymphocytes and mouse cell line C2C12, mainly due to chromosome breakage. In the present study we investigated the clastogenic activity of doxorubicin as well as its ability to induce apoptosis. Ηuman leukemic cells HL-60 were chosen as the cell system to proceed our research. The clastogenic activity of doxorubicin was investigated by alkaline Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE assay-Comet assay). Four parameters were analyzed, tail length, % DNA in tail, tail moment, and olive tail moment, which reveal DNA breakage. Additionally the capacity of doxorubicin to induce DNA fragmentation was analyzed by stratifying the cells into five classes with various degrees of DNA damage, from undamaged DNA to severely damaged DNA. The mechanism by which doxorubicin exerts its clastogenic activity was studied by enzyme linked comet assay. We used Fpg and hOOG1 DNA glycosylases. The ability of doxorubicin to induce apoptosis was studied by Cytokinesis-block Micronucleus assay. Also, the CBMN assay was used to assess the micronucleation on HL-60 due to the action of doxorubicin. To further elucidate the mechanism by which doxorubicin induce apoptosis we examined the ability of this compound to alter the expression of caspase 3, that plays a key role in the cascade of molecular events of programmed cell death. This analysis was performed by Western blot. Our findings indicate that doxorubicin exerts clastogenic activity as it provokes DNA migration from the nucleus after SCG electrophoresis in alkaline conditions. The generation of breaks on DNA strands seems to be more potent at low concentrations. The ability of doxorubicin to induce fragmentation of genetic material is correlated with the oxidation of DNA bases resulting in the formation of alkali labile sites. Furthermore, it induces marginal increase in the frequency of micronuclei at lower concentrations, while it doesn’t seem to induce micronucleation at higher concentrations. This finding is in accordance with the ability of doxorubicin to generate higher frequency of DNA breaks at low concentrations. Additionally, doxorubicin induces apoptosis. This induction is more potent at higher concentrations and is consistent with the reduced frequency of breaks and micronucleus generation at these concentrations. Activation of apoptosis due to doxorubicin treatment seems to be mediated by caspase 3.

Στόχος της διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη ενός τετραδιάστατου προσομοιωτικού μοντέλου της ελεύθερης ανάπτυξης και απόκρισης όγκων νεφροβλαστώματος σε σχήματα χημειοθεραπείας. Το μοντέλο αναπτύχθηκε στα πλαίσια των εξής ευρωπαϊκών προγραμμάτων: ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), p-Medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) και TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009.5.4). Το μοντέλο είναι κατά βάση διακριτό και κλινικά προσανατολισμένο . Κάνει σε μεγάλη έκταση, χρήση διακριτών οντοτήτων και διακριτών γεγονότων ενώ αναφέρεται σε πολλές χωροχρονικές κλίμακες της βιολογίας του καρκίνου. . Αποτελεί μια «από επάνω προς τα κάτω» (top-down) προσομοιωτική προσέγγιση. Ξεκινώντας από τα μακροσκοπικά απεικονιστικά δεδομένα ασθενών (υψηλό επίπεδο βιοπλοκότητας) και συνεχίζοντας προς τα επίπεδα χαμηλότερης πολυπλοκότητας. Ο κλινικός προσανατολισμός του μοντέλου αποτέλεσε τη βασική αρχή κατά την ανάπτυξή του. Τα διαθέσιμα ιατρικά δεδομένα αποσκοπούν στην εξατομίκευση της προσομοίωσης της συμπεριφοράς του όγκου για κάθε ασθενή. Το μοντέλο που αναπτύχθηκε στα πλαίσια του διδακτορικού, αποτελεί μέρος μιας σύνθετης αλγοριθμικής κατασκευής και ενός συστήματος βιοϊατρικής τεχνολογίας, του “Ογκοπροσομοιωτή”. Έχουν πραγματοποιηθεί εκτεταμένοι έλεγχοι αξιοπιστίας του μοντέλου και παραμετρικές μελέτες. Η ανάλυση ευαισθησίας του μοντέλου αποκάλυψε ποιοί βιολογικοί μηχανισμοί παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του όγκου. Αυτά τα συμπεράσματα μπορούν να παρέχουν περαιτέρω κατανόηση στη δυναμική της βιολογίας του καρκίνου. Τα αρχικά αποτελέσματα των προσομοιώσεων της ελεύθερης ανάπτυξης και απόκρισης σε χημειοθεραπεία τυχαίου όγκου (ελλειψοειδούς) ενισχύουν σημαντικά την αξιοπιστία του μοντέλου. H ήδη δημοσιευμένη προσαρμογή του μοντέλου σε πραγματικά περιστατικά κλινικών δοκιμών (SIOP 2001/GPOH) αποτελεί μια βάση δημιουργίας εμπιστοσύνης της επιστημονικής κοινότητας στο προσομοιωτικό δυναμικό της προσέγγισης. Για την κλινική προσαρμογή του συγκεκριμένου Ογκοπροσομοιωτή χρησιμοποιούνται τα διαθέσιμα κλινικά δεδομένα (απεικονιστικά, ιστοπαθολογικά), προ- και μετα-εγχειρητικά, σε συνδυασμό με τη διαθέσιμη πληροφορία από τη βιβλιογραφία. Η δυνατότητα να αξιοποιούνται άμεσα πρόσθετα δεδομένα στα πλαίσια κλινικών δοκιμών, περιορίζοντας έτσι το “παράθυρο” των πιθανών λύσεων αποτελεί ένα ιδιαίτερα ξεχωριστό χαρακτηριστικό του παρουσιαζόμενου μοντέλου. Σημειώνεται ότι το μοντέλο βρίσκεται κάτω υπό συνεχή βελτιστοποίηση και επέκταση στα πλαίσια ευρωπαϊκών προγραμμάτων υπό υλοποίηση και κλινικών δοκιμών. / The aim of this thesis is to develop a 4D spatiotemporal simulation model of the free growth of Wilms’ tumours and its response to chemotherapeutic regimens. The model has been developed within the framework of three EC-funded projects: ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), p-Medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) and TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009.5.4). It is is a predominantly discrete entity -discrete event, clinically-oriented multiscale cancer model. A ‘‘top-down’’ simulation approach has been formulated. The approach method starts from the macroscopic imaging data representing a high scale/level of tumour biology and proceeds towards lower scales/levels. The clinical orientation of the model has been a fundamental guiding principle throughout its development. Available medical data is exploited, in order to support patient-individualized modelling. The model developed has been embedded in a complex algorithmic system and a bioengineering tool denoted by the term “Oncosimulator”. A thorough cross-method sensitivity analysis of the model has been performed, revealing the most determinant biological mechanisms in terms of tumour aggressiveness and therapy outcome. The outcome of this work has provided important insight into the biology of cancer dynamics. Initial results of free growth and response to chemotherapy have been produced and judged as reasonable, thus supporting the validity of the model Successful model adaptation to real clinical cases in the context of the SIOP/GPOH clinical trial guided by a sensitivity analysis has been achieved and published. In order to validate the model, the available pre- and post-surgery clinical data (imaging and histopathological) are used in combination with available literature data. The potential to readily exploit additional data available in the context of clinical trials, thereby narrowing the window of possible solutions, is a particularly distinctive feature of the model. The model is under continuous refinement, optimization and extension in the framework of pertinent clinical trials.

Aujourd'hui, le cancer est devenu un problème majeur de santé publique avec 12,7 millions de nouveaux cas de cancer et 7,6 millions de décès enregistrés en 2008. Même si le nombre des personnes qui guérissent augmente, les décès sont toujours importants. Les raisons, malgré un diagnostic précoce et correct, sont l'absence de traitements efficaces et l'émergence des résistances à la thérapie anticancéreuse. C'est pourquoi les chercheurs s'intéressent aux nouvelles approches pour développer des traitements puissants et sélectifs pour vaincre le cancer. Dans notre première approche, nous avons développé une série de dérivés de composés naturels appelés aurones. Les aurones jouent un rôle important dans la pigmentation jaune lumineuse de certaines fleurs et certains fruits et montrent des nombreuses activités biologiques. Nous avons combiné le motif benzofuranone des aurones avec d'autres motifs de la coumarine et chromone inspirées par la nature. Ces nouveaux composés montrent une activité anticancéreuse prometteuse, car ils sont capables de bloquer le cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses K562 et peuvent y induire l'apoptose. Ils sont donc un motif intéressant pour un développement ultérieur de recherches. Ensuite nous avons concentré notre attention sur un objectif épigénétique. Les méthyltransférases d'ADN sont considérées comme une cible intéressante en oncologie. L'usage d'inhibiteurs spécifiques de la méthyltransferase d'ADN (DNMTi) pourrait réactiver les gènes suppresseurs de tumeurs et induire la reprogrammation des cellules cancéreuses, conduisant à l'arrêt de leur prolifération et finalement à leur mort. Nous avons amélioré le composé connu SGI1027 par modification de la structure. Nous avons obtenu des nouveaux inhibiteurs de la méthyltransferase d'ADN non- nucléosidiques, plus puissants et plus sélectifs que le composé principal. L'activité anti-cancéreuse de nos composés quinoléiniques et pyrimidiniques est testée sur différentes lignées cellulaires de cancer indiquant leur future utilisation possible dans un traitement anti-cancéreux puissant et sélectif. Une troisième série d'analogues de curcuminoïdes à base de coumarine a été préparée et testée pour sa capacité potentielle à moduler la voie TNF-alpha induit par NF-kB dans les cellules cancéreuses K562. Cependant, nous n'avons pas été capable de montrer l'implication de la voie ciblée jusqu'à maintenant. Des études complémentaires et plus approfondies doivent être menées afin d'estimer les propriétés biologiques de ces composés dans la participation éventuelle à différentes voies / Today, cancer is becoming a major public health problem with 12.7 million new cancer cases and 7.6 million cancer deaths registered in 2008. Although the number of people cured of cancer is increasing, people still die because of cancer. The reasons, besides an early and correct diagnosis, are the lack of effective treatments and the emergence of drug-resistant cancers. Therefore, researchers are interested in new approaches to develop potent and selective therapies to fight cancer. To start with, we developed a series of natural compound derivatives related to aurones. Aurones play an important role in the bright yellow pigmentation of some flowers and fruits exhibiting a strong and broad variety of biological activities. We combined the benzofuranone motif of the aurone with other coumarin and chromone motifs inspired by nature. These new compounds displayed spromising anticancer activity because they are able to block the cell cycle in K562 cancer cells and are able to induce apoptosis being an interesting scaffold for further development. Secondly, we focused on an epigenetic target. DNA methyltransferases are considered as an interesting target in Oncology. The use of specific inhibitors of DNMT (DNMTi) might reactivate tumor suppressor genes and induce the reprogramming of cancer cells, leading to their proliferation arrest and ultimately to their death. We improved the known compound SGI1027 through structure modification leading to novel non-nucleoside DNMT inhibitors, more potent and more selective than the lead compound. The anticancer activity of our quinoline and pyrimidine based compounds - tested in different cancer cell lines - suggests their use as possible potent and selective future cancer therapy. A third series of coumarin-based curcuminoid analogues were prepared and tested for their potential ability to modulate the TNF-alpha induced NF-kB pathway in K562 cancer cells. However we were not able to demonstrate the involvement of the targeted pathway so far. Complementary and deeper investigations need to be conducted in order to elicit deeper biological properties of these compounds with the possible involvement of different pathways