Η αδειοδότηση της αντιγραφής διασφαλίζει την ακεραιότητα της γενετικής πληροφορίας κατά τη μεταβίβασή της στα θυγατρικά κύτταρα και εξασφαλίζει ότι το DNA αντιγράφεται μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποτελεί σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης και συσσωρεύεται κατά τη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Φυσικός αναστολέας της Cdt1 είναι η Geminin, που εκφράζεται καθ’όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, εκτός από τη G1. Η διατήρηση της ισορροπίας της έκφρασης των πρωτεϊνών Cdt1 και Geminin είναι σημαντική για τη διασφάλιση της γενετικής ακεραιότητας. Αποσιώπηση της Geminin ή υπερέκφραση της Cdt1 μπορεί να οδηγήσει σε εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής. Σε ποντίκια, η υπερέκφραση της Cdt1 συμβάλλει στην εμφάνιση κακοήθειας, γεγονός που αποδεικνύει το ρόλο της πρωτεΐνης ως ογκογονίδιο. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι μόρια που συμμετέχουν στο μηχανισμό αδειοδότησης της αντιγραφής μπορούν να χρησιμεύσουν ως προγνωστικοί-διαγνωστικοί δείκτες. Υψηλά επίπεδα έκφρασης των MCMs και της Geminin έχουν παρατηρηθεί σε διάφορες κακοήθειες και έχουν συσχετιστεί με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της ασθένειας. Αν και έχει δειχθεί ότι η Cdt1 διαθέτει ογκογόνο δράση, ελάχιστα δεδομένα είναι διαθέσιμα, μέχρι στιγμής, αναφορικά με τα επίπεδα έκφρασής της σε κακοήθεις καταστάσεις και με την πιθανή χρήση της ως βιολογικού δείκτη. Αρχικός στόχος αυτής της εργασίας ήταν η έκφραση ενός τμήματος της Cdt1 πρωτεΐνης για την ανοσοποίηση κουνελιών και την παραγωγή αντισώματος. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε έκφραση της υβριδικής GST-C391 hCdt1 πρωτεΐνης σε ετερόλογο βακτηριακό σύστημα έκφρασης. Παράλληλα πραγματοποιήθκε έκφραση ενός ακόμη τμήματος της hCdt1 που έφερε τον επίτοπο His. Η δεύτερη υβριδική πρωτεΐνη (His-ΔΝ Cdt1) χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό των αντιορρών των ανοσοποιημένων ζώων και την απομόνωση του αντισώματος. Η ειδικότητα του καθαρισμένου αντισώματος πιστοποιήθηκε με ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση western σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, στα HeLa και στα MCF7. Επιπλέον, πειράματα ανοσοϊστοχημειας σε τομές από περιστατικά καρκίνου μαστού επιβεβαίωσαν τη δυνατότητα χρήσης του αντισώματος σε ιστικές τομές παραφίνης. Η εξέταση των πρωτεϊνικών επιπέδων έκφρασης της Cdt1 έδειξε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης στον όγκο σε σχέση με τον παρακείμενο φυσιολογικο ιστό. Επιπλέον, στην παρούσα εργασία προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των Cdt1 και Geminin, με τη μέθοδο της Real-Time PCR, σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa και MCF7) και σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες. Διαπιστώθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA του Cdt1 κατά δύο φορές στις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, σε σχέση με τους ινοβλάστες. Αντίθετα, η Geminin, εκφράζεται περισσότερο κατά δύο φορές στα HeLa σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα, ενώ στα MCF7 τα επίπεδά της είναι υποδιπλάσια σε σχέση με τους ινοβλάστες. Επομένως, ο λόγος των Cdt1/Geminin επηρεάζεται με διαφορετικό τρόπο στις δύο καρκινικές σειρες: στα HeLa φαίνεται ότι διατηρείται σταθερός, σε σχέση με τους ινοβλάστες, ενώ στα MCF7 παρουσιάζεται τετραπλάσιος. / -

Η ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης είναι εξέχουσας σημασίας κατά την ανάπτυξη των πολυκύτταρων οργανισμών. Κεντρικοί ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου έχει δειχθεί να συμμετέχουν και σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης, όπως η οικογένεια των E2F μεταγραφικών παραγόντων, το pRb και οι αναστολείς των κυκλινοεξατώμενων κινασών (CKIs). H Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και στην ανάπτυξη, η οποία έχει προταθεί σαν ένας πιθανός ρυθμιστής αυτών των διαδικασιών. H Geminin εμφανίζει διαφορετικές δράσεις, αλληλεπιδρώντας με ένα σημαντικό αριθμό κυτταρικών παραγόντων. Σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις σημαντικό ρόλο παίζει η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin. Πρόσφατα, μέσω βιοπληροφορικών αναλύσεων βρέθηκε ένας γενετικός τόπος στο ανθρώπινο γονιδίωμα ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεϊνική αλληλουχία με σημαντική ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα της Geminin. H πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε Castor. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν εργαλεία βιοπληροφορικής, για την ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor και τη σύγκριση αυτής με την Geminin. Στη συνέχεια, μελετήθηκε με την μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Castor με τη Geminin και ο ομοδιμερισμός του Castor και χαρτογραφήθηκαν οι περιοχές που ευθύνονται για τις αλληλεπιδράσεις αυτές.. Ο Castor σχηματίζει σύμπλοκο με την Geminin και η αλληλεπίδραση αυτή απαιτεί το σπειροειδές σπείραμα της Geminin και τα 254 καρβοξυτελικά αμινοξέα του Castor, στα οποία περιέχεται το σπειροειδές σπείραμα του. Τα τελευταία 254 αμινοξέα είναι υπεύθυνα και για τον ομοδιμερισμό του μορίου. Σύγκριση της ισχύος αλληλεπιδράσεων έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ Castor και Geminin είναι ισχυρότερη από τον ομοδιμερισμό του Castor, αφού η Geminin δύναται να ανταγωνιστεί την πρόσδεση του Castor στον εαυτό του. Τέλος, αναπτύχθηκαν μοριακά εργαλεία απαραίτητα για τη μελέτη του Castor. To πρώτο αφορά την παραγωγή και καθαρισμό πολυκλωνικού αντισώματος κατά αμινοτελικού τμήματος της Castor πρωτεΐνης. Η ειδικότητα του αντισώματος ελέγχθηκε με ανοσοτύπωση Western. To αντίσωμα είναι λειτουργικό αφού αναγνωρίζει την εξωγενή πρωτεΐνη CastorGFP ενώ δεν μπορούν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για την ενδογενή ανθρώπινη πρωτεΐνη. Το δεύτερο αφορά την 7 ανάπτυξη της μεθοδολογίας RNAi για την αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σε κυτταρικές σειρές. Η λειτουργικότητα του RNAi ελέγχθηκε τόσο σε ανοσοτύπωση Western όσο και σε ανοσοφθορισμό σε σταθερά διαμολυσμένη με CastorGFP κυτταρική σειρά και είναι λειτουργικό. Τα παραπάνω εργαλεία είναι απαραίτητα για μελλοντικές λειτουργικές μελέτες του Castor. / Τhe coordination of cellular proliferation and differentiation is of critical importance for the development of multicellular organisms. Cell cycle regulators have been shown to participate in the regulation of these two processes, such as E2F transcriptional factors family, pRb and Cdk inhibitors (CKIs). Geminin is a bifunctional protein participating in cell cycle regulation and in developmental processes and has been proposed as a candidate for the regulation of these two processes. Geminin balanced interactions with various binding partners are central to its different function. In these interactions the coiled coil of Geminin plays an important role not only as a binding interface but also maintaining the structural integrity of the molecule. Recently in silico analysis has revealed a new genetic locus in the human genome that codes for a protein with significant homology to the Geminin coiled coil region. This protein is named Castor. In this study, in silico analysis was performed to examine the expression of the molecule by analyzing the available ESTs, sequence analysis of Castor protein and comparison to Geminin structural and functional motifs. . We also studied the molecular interaction between Geminin and Castor and Castror homodimerization. We show that Geminin formes a complex with Castor.The coiled coil of Geminin is required for the interaction. Castor interacts with Geminin through its 254 C-terminal amino acids which include its coiled coil. The 254 C-terminal amino acids are also responsible for the self-association of the molecule. We further wanted to established which interaction, the heterodimerazition with Geminin or Castor homodimerazition is stronger. Geminin interacts stronger with Castor, than Castor with itself since overexpressing Geminin and Castor together results in full binding of Castor to Geminin Finally we developed molecular tools required for the functional study of the molecule. Firstly, a specific polyclonal antibody against the N terimus of Castor was 8 produced and then affinity purified. The specificity of the antibody was tested by Western blotting analysis. The antibody recognizes the transfected CastorGFP protein, but no safe conclusion can be drawn for the endogenous protein. Secondly, silencing Castor by RNAi technique for silencing Castor gene in cell lines was set up. The effect of the RNAi was tested by Western blotting and immunofluorescence in CastorGFP stable cell lines. These tools will be required in future studies for investigating the function of Castor.

Η απόπτωση είναι μια βασικής σημασίας βιολογική διαδικασία η οποία απαιτείται για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της ομοιόστασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς. Αντίθετα, δυσλειτουργία της αποπτωτικής διαδικασίας διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια μιας ευρείας κλίμακας ανθρώπινων παθολογικών καταστάσεων συμπεριλαμβανομένων νευροεκφυλιστικών διαταραχών και καρκίνο. Η αποπτωτική διαδικασία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση ενός αρκετά συντηρημένου μεταξύ των οργανισμών βιοχημικού μονοπατιού, στο τελευταίο στάδιο του οποίου βρίσκεται η ενεργοποίηση μιας οικογένειας πρωτεασών που ονομάζονται κασπάσες. Οι πρωτεάσες αυτές κατατμούν μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών – στόχων, η κατάτμηση των οποίων και η αλλαγή των λειτουργικών χαρακτηριστικών τους προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο. Στις πρωτεΐνες-στόχους της αποπτωτικής διαδικασίας περιλαμβάνονται δομικές πρωτεΐνες του πυρήνα και του κυτταροσκελετού, πρωτεΐνες που ενέχονται άμεσα στην αποπτωτική διαδικασία, στην κυτταρική σηματοδότηση, στην αντιγραφή του DNA, την επιδιόρθωση των βλαβών του, αλλά και πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Η αδειοδότηση της αντιγραφής είναι μια διαδικασία η οποία εξασφαλίζει πως μόνο μετά από τη διαμεσολάβηση της φάσης της μίτωσης η χρωματίνη καθίσταται ικανή για έναν νέο κύκλο αντιγραφής του DNA. Ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών ρυθμίζει τη διαδικασία αυτή, μείζον συστατικό του οποίου είναι η πρωτεΐνη Cdt1 η οποία είναι συντηρημένη από τις ζύμες έως τα θηλαστικά. Στα σπονδυλωτά, η πρωτεΐνη Geminin, είναι ο αρνητικός ρυθμιστής του Cdt1 προσφέροντας ένα επιπρόσθετο επίπεδο ρύθμισης του Cdt1. Στις πρωτεΐνες που ενέχονται στην παραπάνω διαδικασία συμπεριλαμβάνονται οι πρωτεΐνες Orc1-6, Cdc6, MCM2-7, από τις οποίες οι πρωτεΐνες Cdc6 και MCM3 έχει δειχθεί ότι αποτελούν στόχους των κασπασών και της αποπτωτικής διαδικασίας. Στόχος της παρούσης εργασίας ήταν ο έλεγχος μιας πιθανής στόχευσης του μέλους του προαντιγραφικού συμπλόκου Cdt1 και του αρνητικού ρυθμιστή του Geminin κατά την απόπτωση. Διαπιστώθηκε πως σε αποπτωτικά κύτταρα η πρωτεΐνη Geminin στοχεύεται και κατατμείται. Η κατάτμηση αυτή προκύπτει μετά από στόχευση της Geminin από την κασπάση-3 και παρατηρήθηκε τόσο σε in vivo συνθήκες όσο και μετά την in vitro επώαση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Geminin με ανασυνδυασμένη κασπάση-3. Η χαρτογράφηση της θέσης της κατάτμησης της Geminin από την κασπάση-3 επέδειξε το καρβοξυτελικό της άκρο της Geminin ως τον πρωτεολυτικό στόχο της κασπάσης-3, προτείνοντας υποθετικές αλλαγές στη φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης. / Apoptosis is an essential biological process required for the maintenance of integrity and homeostasis of multicellular organisms. Deregulation of apoptosis plays an important role in the pathogenesis of a wide range of human diseases including neurodegenerative disorders and cancer. Apoptosis induces the activation of a conserved biochemical pathway of specific proteases called caspases. These proteases cleave a great number of protein-targets, promoting the alteration of their functional characteristics and leading to apoptotic phenotype. Structural cytoskeleton and nucleolar proteins that are involved in apoptotic process, signalling cellular transduction, DNA replication and repair of its damage as well as proteins involved in replication licensing, are among the protein-targets of caspases. Replication licensing is a process which ensures that only after a passage through mitosis chromatin becomes competent for a new round of DNA replication. A protein complex regulates this process and a major component of this complex is Cdt1 protein, which is conserved from yeast to mammals. In vertebrates, another protein, namely Geminin, is the negative regulator of Cdt1 offering an additional regulation level over Cdt1. In the replication licensing process, other proteins such as Orc1-6, Cdc6, MCM2-7 are involved. Cdc6 and MCM3 have been shown to be targets of caspases during apoptosis. The aim of the present study was the investigation of a possible targeting of Cdt1 and Geminin during apoptosis. We showed that in apoptotic cells, Geminin is cleaved producing a lower molecular weight cleavage product. The cleavage of Geminin occurs by caspase-3 in apoptotic cells treated with a variety of apoptotic triggers in vivo, and after the incubation of recombinant Geminin with recombinant caspase-3, in vitro. The cleavage site of Geminin by caspase-3 was mapped in carboxy-terminus of Geminin, suggesting possible alterations in its functions.

Η μεταβίβαση του γενετικού υλικού στα θυγατρικά κύτταρα απαιτεί αξιοπιστία στην αντιγραφή του DNA, ακρίβεια στην κατανομή των χρωμοσωμάτων και αποτελεσματικούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι κληρονομήσιμες μεταλλαγές στο γενετικό υλικό. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα, για να πετύχουν αυτή την πιστότητα έχουν αναπτύξει μηχανισμούς επιτήρησης που “παρατηρούν” τις βλάβες στο DNA, ώστε να τις επιδιορθώνουν και να συνεχίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1 είναι ένα κρίσιμο και εξελικτικά συντηρημένο μόριο-στόχος του DNA damage checkpoint, καθώς έκθεση σε ιονίζουσα ή UV ακτινοβολία στοχεύει το Cdt1 για πρωτεόλυση. Το Cdt1 είναι ένα απαραίτητο στοιχείο της αδειοδότησης του κυτταρικού κύκλου (“cell cycle licencing”), και είναι συντηρημένο από τη ζύμη μέχρι τα θηλαστικά. Σε αυτή τη εργασία, μελετάμε την ικανότητα διαφορετικών αντικαρκινικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων να επάγουν το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι DNA damage που έχει προκληθεί από τα φάρμακα MMS, Cisplatin και Doxorubicin οδηγεί σε άμεση πρωτεολυτική καταστροφή του Cdt1, ενώ χορήγηση Tamoxifen δεν επηρεάζει τα επίπεδα της πρωτεΐνης Cdt1. Βλάβες στο DNA που έχουν προκληθεί από Etoposide έχουν διαφορετική επίδραση στα πρωτεϊνικά επίπεδα του Cdt1, ανάλογα με την κυτταρική σειρά. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης της Geminin, που είναι αναστολέας του Cdt1. Από τα αποτελέσματά μας προκύπτει ότι οι γενοτοξικές θεραπείες που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου διαφέρουν ως προς την ικανότητά τους να ενεργοποιούν το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από το Cdt1. / The faithful transmission of the genetic material to the daughter cells requires extreme accuracy in DNA replication, precision in chromosome distribution and effective repair mechanisms to minimize heritable mutations affecting the genetic material. To achieve this fidelity, cells have evolved surveillance mechanisms that monitor the structure of DNA and coordinate repair and cell cycle progression. Recent studies revealed that Cdt1 is a critical and evolutionarily conserved target of the DNA damage checkpoint, since exposure to ionizing or UV radiation targets Cdt1 for degradation. Cdt1 is an essential component of the cell cycle licensing machinery that is conserved from yeasts to mammals. We have examined the ability of several anticancer drugs to act through the Cdt1 dependent cell cycle checkpoint. Our findings indicate that DNA damage induced by MMS, Cisplatin and Doxorubicin leads to rapid proteolytic destruction of Cdt1, whereas treatment with Tamoxifen does not affect Cdt1 protein levels. DNA damage induced by Etoposide has differential effect on Cdt1 protein levels, depending on the cell line. There is no change on Geminin expression levels, the protein inhibitor of Cdt1. Our results suggest that genotoxic therapies used against cancer differ in respect to Cdt1 dependent checkpoint.

Η δημιουργία του εγκεφαλικού φλοιού στηρίζεται στη διαδοχική εμφάνιση πληθυσμών προγονικών κυττάρων, οι οποίοι δίνουν γένεση σε νευρικά και γλοιακά κύτταρα. Πρόκειται για μία διαδικασία που απαιτεί το συγχρονισμό των διεργασιών αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης των προγονικών νευρικών κυττάρων, και διαμεσολαβείται από τον ταυτόχρονο έλεγχο των διαδικασιών κυτταρικού κύκλου, μεταγραφικής ρύθμισης και αναδιαμόρφωσης της δομής της χρωματίνης. Η πρωτεΐνη Geminin έχει προταθεί ως ένα μόριο που ρυθμίζει τόσο τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό όσο και την κυτταρική διαφοροποίηση. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι η πρωτεΐνη Geminin και ο μοριακός της συνεργάτης Cdt1 εκφράζονται στα προγονικά νευρικά κύτταρα της κοιλιακής και υποκοιλιακής ζώνης του αναπτυσσόμενου φλοιού του μυός. Στα προκαθορισμένα προς νευρωνική διαφοροποίηση πρόδρομα κύτταρα που εκφράζουν τις προνευρικές bHLH πρωτεΐνες Mash1 και Neurogenin2 η έκφρασή τους μειώνεται. Επίσης δείχνουμε ότι οι παράγοντες Geminin και Cdt1 επιδεικνύουν ένα περιοδικό πρότυπο έκφρασης στα προγονικά νευρικά κύτταρα του φλοιού του μυός που εξαρτάται από τη φάση του κυτταρικού κύκλου. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος της πρωτεΐνης Geminin in vivo στις διαδικασίες αυτο-ανανέωσης, διαδοχής και διαφοροποίησης των προγονικών νευρικών κυττάρων του φλοιού, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης και αποσιώπησης του γονιδίου της Geminin στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό του μυός. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η απουσία της Geminin αυξάνει τον αριθμό των προγονικών κυττάρων της κοιλιακής ζώνης του φλοιού, μεταβάλλοντας τον ρυθμό κυτταρικής διαίρεσης που εμφανίζουν τα παραπάνω κύτταρα κατά τα πρώιμα στάδια της φλοιϊκής νευρογένεσης. Η Geminin ρυθμίζει επίσης τον καθορισμό των βασικών πρόδρομων κυττάρων της υποκοιλιακής ζώνης, ενός πληθυσμού προγονικών νευρικών κυττάρων που δίνει κυρίως γένεση σε διαφοροποιημένα νευρικά κύτταρα. Επιπλέον, η υπερέκφραση της Geminin αυξάνει τον πληθυσμό των προκαθορισμένων προς νευρωνική διαφοροποίηση πρόδρομων κυττάρων καθώς και τον αριθμό των φλοιϊκών νευρώνων προάγοντας την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η Geminin συμμετέχει στη ρύθμιση του πληθυσμού των προγονικών κυττάρων του φλοιού και στη μετάβαση μεταξύ των διαδοχικών προγονικών πληθυσμών ρυθμίζοντας τελικά την παραγωγή των φλοιϊκών νευρώνων. Τα αποτελέσματά μας επομένως προσδίδουν στη Geminin ένα φυσιολογικό ρόλο στο σχηματισμό του φλοιού των θηλαστικών. / Cortical development is a highly ordered process, involving the timely orchestration of the appearance of different neural progenitor lineages, which succeed one another in order to generate the neurons and glia comprising the cortex. It is a process requiring coordination of proliferation and differentiation which in turn depends upon the precise control of cell cycle parameters, chromatin remodeling and transcriptional activity. Geminin has been shown to regulate cell proliferation, fate determination and organogenesis, representing a potential link between these processes. We show here that Geminin and its binding partner Cdt1 are expressed by neural progenitor cells of the ventricular and subventricular zone of the developing mouse cortex. However, the majority of the Geminin and Cdt1 expressing cells are distinct from fate-restricted precursor cells expressing the bHLH proneural proteins Mash1 and Neurogenin2. Importantly, BrdU incorporation experiments show a cell cycle specific expression pattern of Geminin and Cdt1 in neural progenitors of the mouse cortex. In order to investigate Geminin in vivo role in the self-renewal, maintenance, lineage commitment and differentiation of cortical neural progenitors, we have specifically over-expressed and deleted Geminin in the developing cortex. Our results showed that Geminin function in the developing mouse cortex regulates the number of the apical progenitors. Interestingly, this impact on progenitor number is the consequence of the accelerated cell cycle that these apical progenitors exhibit during early stages of cortical development. Moreover, Geminin deletion and over-expression in the cortex also regulated the fate specification of the basal cortical progenitors of the subventricular zone. Furthermore, our results demonstrated that Geminin affects the population of the committed neural precursors, the rate of cell cycle exit and, subsequently, the numbers of cortical neurons. Our study assigns Geminin with a role in regulating the progenitor cell number, the timing of lineage transition, the progenitor neuronal commitment and the subsequent neuron generation.

Στην παρούσα εργασία ανιχνεύθηκε και μελετήθηκε υπολογιστικά πρωτεΐνη ομόλογη της ανθρώπινης Geminin, που αποτελεί μία από τις πρωτεΐνες ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη αναφέρεται ως GemininB. Η ανίχνευση της GemininB πραγματοποιήθηκε μέσω της ομολογίας της με την ανθρώπινη Geminin. Εδράζεται στο πέμπτο χρωμόσωμα (5q11.2) και συγκεκριμένα μεταξύ των βάσεων 54559720-54551204, ενώ η Geminin εδράζεται στο έκτο χρωμόσωμα, και έχει μήκος 8517bp. / In the present work it was detected and was studied calculatingly protein counterpart of human Geminin, that constitutes one from the proteins regulators of cellular circle. The particular protein is reported as GemininB. The detection of GemininB was realised via her consent with human Geminin. It abuts in the fifth chromosome (5q11.2) and concretely between bases 54559720-54551204, while Geminin abuts in the sixth chromosome, and has length 8517bp.

Η απορρύθμιση του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής εμπλέκεται στη γονιδιωματική αστάθεια, η οποία αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Η απορρύθμιση των επιπέδων έκφρασης των Cdt1 και Geminin, είτε λόγω υπερέκφρασης του Cdt1, είτε λόγω αποσιώπησης της Geminin, οδηγεί σε εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής και υπερδιπλασιασμό του DNA, θέτοντας έτσι σε κίνδυνο τη γονιδιωματική ακεραιότητα του κυττάρου. Υπερέκφραση των δύο πρωτεϊνών έχει παρατηρηθεί τόσο σε καρκινικές κυτταρικές σειρές όσο και σε περιπτώσεις καρκίνου στον άνθρωπο. Ιδιαίτερη σημασία έχει επίσης το γεγονός ότι η διαταραχή της ισορροπίας των Cdt1 και Geminin, μέσω της απορρύθμισης της έκφρασής τους, μπορεί να προκαλέσει διαφορετική απόκριση στα καρκινικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών. / Misregulation of the replication licensing system is involved in genomic instability, which is a whole-mark of cancer cells. Particularly, Cdt1 overexpression or silencing of Geminin can lead to DNA over-replication and thus jeopardize the genomic integrity of the cell. Both proteins have been found to be over-expressed in cancer-derived cell lines and human tumor specimens. Notably, cancer and normal cells respond differently to the disturbance of Geminin-Cdt1 balance, caused by misregulation of their expression.

Η Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο καθώς συμμετέχει τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και την κυτταρική διαφοροποίηση. Στον κυτταρικό κύκλο αλληλεπιδρά και απενεργοποιεί τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1, εξασφαλίζοντας με αυτόν τον τρόπο ότι το γονιδίωμα θα αντιγραφεί μόνο μια φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Ο ρόλος της Geminin στην κυτταρική διαφοροποίηση εγκαθιδρύεται από πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις με μεταγραφικούς παράγοντες και παράγοντες αναδιάταξης της χρωματίνης. Έχει προταθεί ότι η Geminin, μέσα από ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις, δρα σαν ρυθμιστής της κυτταρικής απόφασης για πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση. Βασικό δομικό χαρακτηριστικό της Geminin αποτελεί ένα κεντρικά τοποθετημένο σπειροειδές σπείραμα το οποίο είναι απαραίτητο για τις περισσότερες αλληλεπιδράσεις της Geminin. Στην παρούσα εργασία περιγράφουμε τη λειτουργία μιας νέας πρωτεΐνης με σημαντική ομολογία για το σπειροειδές σπείραμα της Geminin, την οποία ονομάσαμε Idas (Ξάδελφος των Διόσκουρων (Gemini) στην αρχαία ελληνική μυθολογία). Από προηγούμενες μελέτες μας γνωρίζαμε ότι ο Idas αλληλεπιδρά με τη Geminin και όχι με το Cdt1, σε επίπεδο εξωγενώς εκφραζόμενων πρωτεϊνών. Δείχτηκε ότι η ενδογενής Geminin και ο ενδογενής Idas αλληλεπιδρούν στα κύτταρα και χαρακτηρίστηκε η λειτουργική δράση του συμπλόκου Geminin:Idas κατά την αντιγραφή του DNA. Χρησιμοποιώντας ένα ελεύθερο κυττάρων σύστημα αδειοδότησης στο Xenopus δείχθηκε ότι όταν ο Idas είναι σε σύμπλοκο με τη Geminin, η Geminin χάνει την ανασταλτική της δράση επί της αντιγραφής του γενετικού υλικού. Η ανασταλτική δράση του Idas επί της Geminin φάνηκε και σε πειράματα in vivo σε κυτταρικές σειρές, στα οποία η υπερέκφραση του Idas οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γενετικού υλικού, φαινότυπος ο οποίος διασώζεται από ταυτόχρονη υπερέκφραση της Geminin. Για τον καλύτερο χαρακτηρισμό της δράσης του Idas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, έγινε απoσιώπηση της έκφρασης του σε κύτταρα σε καλλιέργεια. Απουσία έκφρασης του Idas παρεμποδίζεται η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου καθώς αυξάνεται σημαντικά ο πληθυσμός των κυττάρων που βρίσκονται σε φάση S. Τα κύτταρα στα οποία απενεργοποιείται η έκφραση του Idas αδυνατούν να ολοκληρώσουν ορθά τη φάση S και να προχωρήσουν στη μίτωση και τη G1 που ακολουθεί. Επιπλέον, μελετήθηκε η έκφραση του Idas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου με τη χρήση μίας σταθερά διαμολυσμένης κυτταρικής σειράς. Βρέθηκε ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα του Idas μειώνονται κατά την ανάφαση της μίτωσης και επανέρχονται νωρίς με την είσοδο στη G1. H σημασία του Idas για τη σωστή διέλευση από τη μίτωση φαίνεται από πειράματα υπερέκφρασής του στα οποία παρατηρείται αυξημένος αριθμός κυττάρων με ανώμαλου σχήματος πολύ-πολικές μιτωτικές ατράκτους. Στην προσπάθεια για εύρεση και άλλων πρωτεϊνών με ομολογία για τoν Idas και τη Geminin, εντοπίσαμε ένα νέο γενετικό τόπο ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεΐνη που αποτελεί το κοντινότερο παράλογο του Idas στα σπονδυλωτά καθώς μοιράζεται δύο περιοχές ομολογίας με τον Idas, στο σπειροειδές σπείραμα και στο καρβολυτελικό άκρο των πρωτεϊνών. Λόγω αυτής της ομοιότητας ονομάσαμε την πρωτεΐνη Lynkeas (Δίδυμος αδελφός του Idas στην αρχαία ελληνική μυθολογία). Ο Lynkeas αλληλεπιδρά με τον Idas και τη Geminin αλλά όχι με το Cdt1. Τα παραπάνω δεδομένα προτείνουν ότι ισορροπημένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Geminin, Idas και Lynkeas είναι πιθανό να ρυθμίζουν χρονικά την πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής. Παράλληλα με τη μελέτη της δράσης του Idas στον κυτταρικό κύκλο έγινε μελέτη της πιθανής εμπλοκής του στη διαφοροποίηση με τη χρήση οργανισμών μοντέλων. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης του σε τομές εμβρύων μυός και συγκρίθηκε με αυτό του παραλόγου του Lynkeas. Oι Ιdas και Lynkeas εμφανίζουν ένα ειδικό και σημαντικά αλληλεπικαλυπτόμενο πρότυπο έκφρασης σε αναπτυσσόμενα κροσσωτά επιθήλια όπως το αναπνευστικό και του χοριοειδούς πλέγματος, μαρτυρώντας την πιθανή εμπλοκή τους στη διαφοροποίησή τους. Προκαταρκτικές μελέτες του Idas έγιναν και σε άλλα συστήματα και οργανισμούς μοντέλα. Σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από αυγά Xenopus επιβεβαιώθηκε η αλληλεπίδραση του Ιdas με τη Geminin. Επίσης, εντοπίστηκε και μελετήθηκε η έκφραση του ορθολόγου του Idas στον ιχθύ Danio rerio. Τέλος, έμβρυα Danio rerio χρησιμοποιήθηκαν σαν ετερόλογο σύστημα για προκαταρκτική μελέτη in vivo της υπερέκφρασης ανθρώπινης πρωτεΐνης Idas και μεταλλαγμένων μορφών αυτής. Τα παραπάνω αποτελέσματα μαρτυρούν ότι η Geminin, o Idas και o Lynkeas ανήκουν σε μία υπεροικογένεια η οποία αποτελείται από πρωτεΐνες με όμοια σπειροειδή σπειράματα. Τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin, μέσα από ισορροπημένες αλληλεπιδράσεις συμμετέχουν στη ρύθμιση τόσο του κυτταρικού κύκλου όσο και της κυτταρικής διαφοροποίησης και πιθανά στο συντονισμό αυτών των δύο διαδικασιών. / Geminin is a bifunctional protein which participates both in cell cycle and development. Geminin regulates the cell cycle by directly binding and inhibiting the licensing factor Cdt1, thus ensuring once per cell cycle DNA replication. Geminin also interacts with transcriptional regulators of differentiation and chromatin remodelling factors, thus affecting cell cycle decisions. It has been proposed that Geminin’s balanced interactions are implicated in proliferation – differentiation decisions. Geminin possesses s a central coiled coil region which mediates the majority of Geminin’s interactions. Herein, we describe a novel protein named Ιdas which exhibits homology to Geminin’s coiled coil. In previous studies from our lab it was shown that Idas and Geminin interact in cells when ectopically expressed. In this study we generated and used a specific polyclonal antibody against Idas to study endogenous Geminin:Idas interaction. Moreover we functionally characterized the Geminin:Idas complex in DNA replication. Using a Xenopus in vitro licensing system it was shown that Geminin, when in complex with Idas loses it’s inhibitory activity on DNA replication. Idas inhibitory function over Geminin was also revealed by ectopic expression of Idas in cell lines: Idas overexpression causes DNA over-replication a phenotype rescued by Geminin’s concomitant ectopic expression. To better characterize Ιdas’s function, we depleted Idas from cells. Idas ablation affects cell cycle progression and cells accumulate in S phase. Idas depleted cells show a reduced ability to normally proceed through the cell cycle to Mitosis and G1. To study Idas protein levels throughout the cell cycle we generated a cell line stably expressing IdasGFP. In this cell line Idas protein levels were found to be reduced in anaphase of Mitosis and increase again upon entry to G1. The importance of Idas for normal passage through Mitosis was revealed by ectopic expression experiments: An increased number of cells with abnormal multipollar spindle formation was evident when Idas was ectopically expressed. By searching for other proteins with homology to Idas and Geminin, we found another genomic locus that encodes for a protein that shares two homology regions with Idas: the coiled coil region and the C-terminal region. This protein is the closest prologue of Idas in vertebrates and we named it Lynkeas (Lynkeas being the twin brother of Idas in ancient Greek mythology). Lynkeas interacts with Geminin and Idas but not Cdt1. The above suggest that competing interactions between Idas, Lynkeas Geminin and Cdt1 may provide a switch regulating the timing of DNA replication. Moreover, we studied Idas during differentiation and development. Idas expression pattern was assessed during mouse embryonic development and compared to the expression pattern of Idas prologue, Lynkeas. Idas and Lynkeas exhibit a specific and overlapping expression pattern in the developing ciliated epithelia and specifically in the choroid plexus and respiratory epithelium, indicating their possible implication in the differentiation of motile cilia. The function of Idas was also determined in other systems and model organism. Endogenous Idas was studied in total extracts from Xenopus eggs where it was shown to interact with Geminin. Danio rerio was used as a model organism to study Idas’s function during development. We identified the orthologue of Idas in Danio rerio and examined it’s expression pattern during embryogenesis of Danio rerio. Danio rerio was also used as a heterologous system in preliminary studies for the ectopic expression of human Idas and it’s mutanst during zebrafish development. The above results indicate that Geminin, Idas and Lynkeas consistute a superfamily of proteins with similar coiled coils. Through balanced interactions Geminin, Idas and Lynkeas participate in cell cycle and cell differentiation and could balance these two processes.

Για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας, είναι θεμελιώδους σημασίας η πραγματοποίηση της αντιγραφής του DNA με ακρίβεια και πιστότητα. Στη σωστή χρονικά έναρξη της αντιγραφής σημαντικό ρόλο κατέχει η «αδειοδότηση» της αντιγραφής, η οποία διασφαλίζει ότι η χρωματίνη είναι ικανή για τον επόμενο κύκλο αντιγραφής μόνο αφότου το κύτταρο έχει διέλθει από τη μίτωση. Η αδειοδότηση λαμβάνει χώρα μέσω της διαδοχικής συγκρότησης στις αφετηρίες της αντιγραφής, ενός πολύ-πρωτεϊνικού συμπλόκου, του καλούμενου προ-αντιγραφικού συμπλόκου. Απαραίτητος για τη συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου είναι ο παράγοντας Cdt1. Στα μετάζωα, ένα μικρό μόριο, η Geminin, αναστέλλει τη δράση του Cdt1 κατά τις φάσεις S, G2 και Μ. Η Geminin είναι ένα μόριο με δομή σπειροειδούς σπειράματος, το οποίο συμμετέχει σε ευρύ φάσμα μοριακών αλληλεπιδράσεων και ελέγχει διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Η ρύθμιση της Geminin επιτυγχάνεται κύρια σε μεταγραφικό επίπεδο και μέσω πρωτεόλυσης, ενώ πρόσφατα δείχθηκε ότι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του μορίου διασφαλίζουν την απενεργοποίησή του κατά την G1. Για την εκδήλωση της δράσης της Geminin απαιτείται η παρουσία της πρωτεΐνης στον πυρήνα. Για την ενδοκυτταρική μελέτη της συμπεριφοράς της Geminin, δημιουργήσαμε υβριδικές μορφές του μορίου με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και κατόπιν παροδικής διαμόλυνσης μελετήσαμε τον ενδοκυτταρικό του εντοπισμό. Η εξωγενής Geminin εντοπίζεται στον πυρήνα (όπως και το ενδογενές μόριο) σε έναν υποπληθυσμό ασύγχρονων κυττάρων αλλά επιπλέον, στα μισά κύτταρα του πληθυσμού, αποκλείεται από τον πυρήνα και συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. Η εμφάνιση της Geminin αποκλειστικά εκτός πυρήνα πραγματοποιείται σε κύτταρα που βρίσκονται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και συγκεκριμένα φαίνεται να λαμβάνει χώρα στο τέλος της G1 φάσης, πλησίον της μετάβασης από την G1 στην S. Κατά την είσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση ηρεμίας G0, το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν την Geminin στο κυτταρόπλασμα αυξάνεται σημαντικά. Το γεγονός αυτό προσδίδει φυσιολογικό ρόλο στο φαινόμενο του αποκλεισμού της Geminin από τον πυρήνα και το συνδέει με την προαγωγή της αδειοδότησης της αντιγραφής πριν την είσοδο του κυττάρου στην S. Ανάλυση των επιμέρους περιοχών του μορίου με δημιουργία προοδευτικών απαλοιφών περιοχών της Geminin ανέδειξε το ρόλο της αμινοτελικής περιοχής του μορίου (aa 1-30) στον κυτταροπλασματικό εντοπισμό του. Ο πυρηνικός εντοπισμός της Geminin επάγεται από την κεντρική περιοχή του μορίου ενώ ένα αμινοτελικό πιθανολογούμενο NLS δε φαίνεται από μόνο του –τουλάχιστον- στην ανθρώπινη Geminin να αρκεί για τον πυρηνικό εντοπισμό της. Από τους παράγοντες που μελετήθηκαν, οι οποίοι θα μπορούσαν να επηρεάζουν in trans τον εντοπισμό της Geminin, το Cdt1, ο μοριακός συνοδός της Geminin, είναι ικανός να κατευθύνει τον αναστολέα του στον πυρήνα μετά από συνδιαμόλυνση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Συνδιαμόλυνση με μορφές των δύο μορίων που δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν δεν οδηγεί σε πυρηνικό εντοπισμό της Geminin. Συμπεραίνουμε ότι το Cdt1 προκαλεί διαμετατόπιση της Geminin στον πυρήνα μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με αυτήν. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν έναν νέο τρόπο ρύθμισης της Geminin μέσω πυρηνικού αποκλεισμού και παρέχουν πληροφορίες για το πότε και πώς λαμβάνει χώρα αυτή η ρύθμιση. Πρόσφατα, στις ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων εντοπίσαμε έναν γονιδιακό τόπο που κωδικοποιεί για πρωτεϊνικό μόριο με μεγάλη ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα (coiled-coil) της Geminin (Geminin cc-like ή Castor). Στην παρούσα μελέτη εξετάζεται η χωρο-χρονική έκφραση της Geminin cc-like (Castor), οι αλληλεπιδράσεις με υποψήφια μόρια και η συμπεριφορά του μορίου σε συνθήκες υπερέκφρασης και αποσιώπησης σε ανθρώπινα κύτταρα. Για τη μελέτη αυτή δημιουργήθηκε υβριδική μορφή της πρωτεΐνης με την GFP. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Geminin cc-like (Castor) είναι πυρηνική πρωτεΐνη, όπως και η ενδογενής Geminin και η ενεργότητα σήματος πυρηνικού εντοπισμού φαίνεται να εδράζεται στην καρβοξυτελική περιοχή του μορίου. Η Geminin cc-like (Castor) αλληλεπιδρά με την Geminin και μάλιστα αποτελεί έναν ακόμη παράγοντα, μαζί με το Cdt1, που μπορεί να κατευθύνει in trans την Geminin στον πυρήνα. Πειράματα υπερέκφρασης παρέχουν ενδείξεις για παρεμπόδιση της εισόδου των κυττάρων στη φάση S, ενώ αποσιώπηση της Geminin cc-like (Castor) με τη χρήση RNAi φαίνεται να αυξάνει το ποσό της φωσφορυλιωμένης μορφής της ιστόνης H2Ax, δείκτη διπλών κατατμήσεων στο DNA. Από εξέταση για την ύπαρξη ορθολόγων σε άλλους οργανισμούς, βρέθηκε ορθόλογη πρωτεΐνη στον ιχθύ Oryzias latipes (medaka). Κλωνοποιήθηκε τμήμα του mRNA της O.l Castor πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης της Geminin cc-like (Castor) σε έμβρυα medaka καθώς και πειράματα υπερέκφρασης μετά από ένεση τμήματος του mRNA, τα οποία παρέχουν προκαταρκτικές ενδείξεις για ελαττωματικό σχηματισμό της κεφαλής και των οφθαλμών. Συμπερασματικά, μελετήσαμε μία νέα πρωτεϊνη στον άνθρωπο η οποία εμφανίζει μερική ομολογία προς την Geminin (Geminin cc-like ή Castor), και δείξαμε ότι αποτελεί ένα νέο μοριακό συνοδό της Geminin, με πιθανή συμμετοχή σε κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση. / For genomic stability to be maintained, accurate regulation of replication has to be achieved. Replication licensing takes places during G1 and involves the stepwise formation of a multimeric complex, the pre-replicative complex (pre-RC), onto origins of replication, ensuring that chromatin will be competent for replication only once per cell cycle. Cdt1, a key component of this complex, is accurately regulated throughout cell cycle, through multiple mechanisms. Geminin, a metazoan-specific inhibitor of licensing, binds and inhibits Cdt1, thus preventing ectopic pre-RC formation during S, G2 and M. Geminin is regulated both at the level of transcription and proteolysis. Recently, it was also demonstrated that inactivation of non-proteolysed Geminin during G1 ensures timely formation of the pre-RC. Through its coiled-coil region, many interactions with binding partners are achieved, thus enabling participation in a variety of cellular processes during the cell cycle and differentiation. In order to study the intracellular behaviour of Geminin, fused forms of the molecule with the fluorescent protein GFP were constructed and transfected in MCF7 cells. Exogenous Geminin is located in the nucleus, similar to the endogenous molecule, in a subpopulation of asynchronously growing cells, but in approximately 50% of cells, Geminin is specifically excluded from the nucleus. Cytoplasmic localization of Geminin takes place during G1 and specifically during late G1, close to the G1 to S transition. In addition, upon exit from quiescence and cell cycle re-entry, cytoplasmic localization of Geminin increases notably. This may reflect a physiological role of Geminin exclusion to the cytoplasm upon cell cycle re-entry, in order to permit a ‘window of opportunity’ for licensing to take place prior to S phase onset. Progressive deletions of the Geminin molecule resulted in a variety of mutated forms which were then analysed for their ability to be localized to the nucleus or the cytoplasm. This analysis showed the importance of the aminoteminal region of Geminin (aa 1-30) in the cytoplasmic localization of the molecule. A putative nuclear localization activity was mapped to the central part of the molecule, while a proposed NLS at the aminoterminal part was shown to be neither sufficient nor required for nuclear localization. Amongst the factors tested, which could affect intracellular localization of Geminin, we show that Cdt1 possesses the ability to direct Geminin to the nucleus. Our data provide evidence for a novel means of regulation of Geminin by cell cycle dependant subcellular localization and offer insight on when and how this regulation takes place. Recently, in silico analysis revealed a gene locus in the human genome, coding for a predicted coiled coil protein with homology to Geminin. The gene product was initially named after this similarity as Geminin coiled coil-like (Geminin cc-like) and then renamed ‘Castor’. Present work examines the spatio-temporal expression of a hybrid Castor-GFP molecule, interactions with candidate molecular partners and the consequences for the cell of Castor overexpression or silencing. Our results show that exogenous Castor-GFP is localized in the nucleus and excluded from the nucleoli, similar to endogenous Geminin, whereas evidence for a putative NLS activity at the carboxy-terminus of the molecule is provided. Castor interacts with Geminin in cellular extracts and is sufficient to translocate Geminin-GFP to the nucleus, similar to Cdt1. Overexpression experiments provided evidence for a delayed G1 to S transition. Silensing Castor by siRNA led to an increase in γ-H2Ax staining, a marker of double strand breaks. Further in silico analysis revealed orthologues of Castor in other organisms, from mammals to fish. Part of the putative Castor mRNA in the fish Oryzias latipes (Medaka) was cloned. In vivo analysis of Castor in medaka involved expression pattern analysis by whole mount in situ hybridization and overexpression amalysis by mRNA injections, providing preliminary evidence for impaired forehead and eye formation. In conclusion, we have studied a novel protein with similarity to the coiled-coil region of Geminin (Geminin cc-like/ Castor) and showed that it constitutes a novel molecular partner of Geminin with possible roles during the cell cycle and in development.

Η ορθή και απρόσκοπτη διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου εξασφαλίζει την πιστότητα στην αντιγραφή του γενετικού υλικού και τη μεταφορά αμιγώς της γενετικής πληροφορίας στα θυγατρικά κύτταρα. Το κύτταρο διαθέτει μια σειρά από μηχανισμούς ελέγχου που διασφαλίζουν ότι η αντιγραφή του γενετικού υλικού πραγματοποιείται μόνο μια φορά κατά τη διάρκεια της φάσης S και μόνο εφόσον το κύτταρο εξέλθει από τη φάση της μίτωσης. Οποιαδήποτε απορύθμιση στους μηχανισμούς ελέγχου του κυττάρου, μπορεί να οδηγήσει σε γενετική αστάθεια, βασικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Ένα σημαντικό σημείο ελέγχου στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς αποτελεί η μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S. Η μετάβαση αυτή ελέγχεται από το σχηματισμό του προ-αντιγραφικό σύμπλοκο στις αφετηρίες έναρξης της αντιγραφής με σκοπό την ορθή τοπικά και χρονικά έναρξη της αντιγραφής, μέσα από μια διαδικασία που ονομάζεται ‘αδειοδότηση της αντιγραφής’. Ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες του προ-αντιγραφικού συμπλόκου είναι ο Cdt1, που εμφανίζεται εξελικτικά συντηρημένος από το ζυμομύκητα μέχρι τον άνθρωπο. Στους ανώτερους οργανισμούς, ο παράγοντας Cdt1 υφίσταται αυστηρή ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ενώ η υπερέκφρασή του δύναται να οδηγήσει σε καρκινική εξαλλαγή, γεγονός που υποδηλώνει τον κεντρικό ρόλο που κατέχει στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Πρόσφατα βρέθηκε ο μοριακός αναστολέας του Cdt1, Geminin, ο οποίος πιστεύεται ότι παρέχει ένα επιπρόσθετο επίπεδο ρύθμισης του Cdt1 στους ανώτερους εξελικτικά οργανισμούς. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, το ενδιαφέρον μας εστιάστηκε στη μελέτη του παράγοντα Cdt1, καθώς και του αναστολέα αυτού, Geminin, σε ανθρώπινα κύτταρα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ρύθμιση που υφίστανται οι ενδογενείς παράγοντες Cdt1 και Geminin κατά την μετάβαση στη φάση ηρεμίας, καθώς και τα επίπεδα έκφρασης τους σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς. Τα πειράματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες Cdt1 και Geminin ελέγχονται σε μεταγραφικό επίπεδο κατά τη μετάβαση από και προς τη φάση ηρεμίας G0, αφού τα επίπεδα της πρωτεΐνης και του mRNA τους μειώνονται αισθητά κατά τη μετάβαση στη φάση ηρεμίας και συσσωρεύονται σταδιακά κατά την επαναφορά στον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον, οι παράγοντες Cdt1 και Geminin βρέθηκαν να υπερεκφράζονται σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς που εξετάστηκαν σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικά δείγματα. Εν συνεχεία η μελέτη προσανατολίστηκε στη διερεύνηση του τρόπου δράσης του παράγοντα Cdt1 στη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής in vivo, με χρήση σύγχρονων τεχνικών μικροσκοπίας σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια. Για τις μελέτες αυτές δημιουργήθηκε σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά που εκφράζει την πρωτεΐνη Cdt1 σε σύντηξη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεϊνη GFP (Cdt1GFP)σε φυσιολογικά επίπεδα. Πειράματα ανοσοφθορισμού και πειράματα μικροσκοπίας time-lapse έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1GFP συμπεριφέρεται όπως η ενδογενής τόσο ως προς τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της, όσο και ως προς τη ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η κύρια μορφή ρύθμισης του παράγοντα Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου λαμβάνει χώρα σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο και ότι η σύντηξη με την GFP δε φαίνεται να επηρεάζει τη ρύθμιση αυτή. Πειράματα Επαναφοράς Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (FRAP) σε ζωντανά κύτταρα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1GFP διαχέεται ελεύθερα κατά το μεγαλύτερο μέρος της μίτωσης, ενώ η αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη αρχίζει στη φάση της τελόφασης και συνεχίζεται μέχρι και το τέλος της φάσης G1. Η πρόσδεση του παράγοντα Cdt1 στη χρωματίνη έχει ιδιαίτερα δυναμικό χαρακτήρα, υποδηλώνοντας ότι η δημιουργία του προ-αντιγραφικού συμπλόκου δεν είναι στατική, αλλά επαναπροσδιορίζεται καθ’ όλη τη διάρκεια της φάσης G1. Πειράματα FRAP σε ζωντανά κύτταρα που εξέφραζαν μεταλλαγμένες μορφές του παράγοντα Cdt1 επιπλέον επέτρεψαν την in vivo χαρτογράφηση των περιοχών που χρειάζονται για τη δέσμευση του παράγοντα στη χρωματίνη και κατέδειξαν το αμινοτελικό άκρο και τη θηλιά 2 ως περιοχές απαραίτητες για τη δέσμευση του παράγοντα στη χρωματίνη. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι περιοχές που συμβάλλουν στην κύρια αλληλεπίδραση με τη Geminin, δεν συμβάλλουν στη δέσμευση του παράγοντα Cdt1 με τη χρωματίνη, σε αντίθεση με ότι είχε προταθεί από in vitro πειράματα. Με σκοπό να ανιχνεύσουμε αλληλεπίδραση του παράγοντα Cdt1 με τον αναστολέα αυτού Geminin σε συγκεκριμένο χώρο και χρόνο σε ζωντανά κύτταρα εφαρμόσαμε μικροσκοπία FLIM. Ειδική αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε σε όλο τον πυρήνα. Αντίθετα, μια μορφή της Geminin μεταλλαγμένη στην περιοχή επαφής με το Cdt1 εμφάνισε σαφώς μειωμένη ικανότητα αλληλεπίδρασης. Ποσοτικοποίηση της αλληλεπίδρασης με μικροσκοπία FLIM επέτρεψε την εκτίμηση της σχετικής συνάφειας (affinity) των δύο βιομορίων στο ζωντανό κύτταρο Πειράματα FRAP υποδηλώνουν ότι η παρουσία της Geminin δεν επηρεάζει τη δέσμευση του Cdt1 στη χρωματίνη. Αντίθετα, ο Cdt1 προσελκύει τη Geminin στη χρωματίνη και επομένως η αναστολή της αδειοδότησης της αντιγραφής πραγματοποιείται στη χρωματίνη. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας παρέχουν μια νέα εικόνα του τρόπου με τον οποίο πραγματοποιείται η διαδικασία της αδειοδότηση της αντιγραφής φυσιολογικά καθώς και πώς θα μπορούσε να ανασταλεί η διαδικασία αυτή in vivo. / The correct order of cell cycle phases ensures precise duplication of the genome and division of the genetic material to the two daughter cells. The cell has developed several control mechanisms which ensure once per cell cycle DNA replication. Any defects in the regulation of the cell cycle could lead either to genetic aberrations or to the continuous cell division that characterizes cancer cells. In higher eukaryotes, a major control concerns the transition from G1 to S phase. This transition is regulated through the formation of the pre-replicative complex onto the origins of replications and ensures the timely initiation of replication, through a process called Licensing. A crucial component of this complex is Cdt1, which is conserved from yeasts to mammals. In higher eukaryotes, Cdt1 is strictly regulated during the cell cycle as to be present only in G1 phase, while its ectopic expression potentiates over-replication, indicating that plays a key role in S-phase onset. Recently, a molecular inhibitor of Cdt1, called Geminin, has been identified in higher eukaryotes, which is believed to provide an additional level of control over Cdt1. During this research, we focused our interest in the study of Cdt1 and Geminin in human cells. Our first aim was to study the regulation of the endogenous proteins as cells enter quiescence (G0 phase), as well their expression levels in cancer cell lines and cancer tissues. Cdt1 and Geminin appeared to be controlled at the transcription level, as in this transition protein and mRNAs levels for both factors are decreased when cells enter quiescence and gradually re-accumulate as cells re-enter the cell cycle. In addition, Cdt1 and Geminin mRNA and protein accumulate to much higher levels in cancer cells versus normal diploid cells. In the second part of this work we employed advanced microscopy techniques which permit imaging of molecular processes in live cells, in order to study the role of Cdt1 in the process of licensing in vivo. To this end, a human cell line stably expressing physiologically relevant levels of the fusion protein Cdt1GFP was generated. Immunofluorescence and time-lapse experiments revealed that Cdt1GFP recapitulates the behaviour of the endogenous protein in respect to subcellular localization and regulation through the cell cycle. Our data show that post-transcriptional regulation is sufficient to ensure correct cell cycle behaviour of Cdt1 and that GFP does not interfere with function. FRAP experiments showed that Cdt1GFP though most of mitosis is able to diffuse freely, while is transiently bound onto chromatin during telophase and up to the end of G1 phase. The Cdt1-DNA interaction is highly dynamic, indicating that the pre-replicative complex is not stably bound onto chromatin but re-establishes itself throughout the G1 phase. These experiments also allowed in vivo mapping of the Cdt1 domains necessary for DNA binding. Both the amino-terminus and loop 2 domains are necessary for the binding of Cdt1 to chromatin. In contrary to suggestion based on in vitro experiments, domains that contribute to the main interaction with Geminin do not affect the binding of Cdt1 to chromatin. By using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), interactions between Cdt1 and its inhibitor, Geminin, were detected in living cells. This interaction was abolished when a form of Geminin mutated in the Cdt1 binding domain was used. Quantitation of FLIM experiments allowed an assessment of the relative binding affinity of Cdt1 to Geminin within the living cell. FRAP experiments in cells co-expressing Cdt1 and Geminin indicate that Geminin does not affect Cdt1’s binding to chromatin; on the contrary, Cdt1 recruits Geminin onto chromatin and therefore the inhibition of Licensing by Geminin is likely to take place on chromatin. Taken together, our data allow an insight into how Licensing normally takes place and how it can be inhibited in the living cell.