Το περιβάλλον διαθέτει πλούτο παραγόντων, οι οποίοι επηρεάζουν με θετικό ή αρνητικό τρόπο την ανάπτυξη και τη λειτουργία των οργανισμών. Μεταξύ των μετάλλων, ο μόλυβδος (Pb) θεωρείται ο σημαντικότερος νευροτοξικός περιβαλλοντικός παράγοντας, με τις κυριότερες αρνητικές επιδράσεις του να αφορούν νεαρούς οργανισμούς ή οργανισμούς που βρίσκονται στα πρώτα στάδια ανάπτυξης. Το περιβάλλον, ωστόσο, διαθέτει και πολλούς παράγοντες οι οποίοι δύνανται να χρησιμοποιηθούν για τις ευεργετικές τους ιδιότητες. Τα τελευταία χρόνια το επιστημονικό ενδιαφέρον έχει στραφεί στην εξεύρεση φυτών και φυτικών συστατικών που θα μπορούσαν να δρουν ενάντια της νευροτοξικής δράσης των μετάλλων. Η ελληνική χλωρίδα είναι πλούσια σε κοινά και ενδημικά φυτά που διαθέτουν νευροπροστατευτικές ιδιότητες. Ο σκοπός της εργασίας ήταν η διερεύνηση της πιθανής συσσώρευσης του μολύβδου στον ολικό εγκέφαλο (-παρεγκεφαλίδα) ενήλικων μυών και της πιθανής επαγωγής νευροτοξικών δράσεων, εστιάζοντας στη διεργασία μνήμη/μάθηση και την ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση, ύστερα από χορήγηση διαλύματος μολύβδου (500 ppm) για διάστημα 4 εβδομάδων. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πολυφαινολική σύσταση και η πιθανή προστατευτική δράση ενάντια στο μέταλλο των αφεψημάτων δυο φυτών της ελληνικής χλωρίδας, του κοινού Rosmarinus officinalis (δενδρολίβανο) και του υπενδημικού Hypericum vesiculosum, ύστερα από χορήγηση των αφεψημάτων σε ενήλικους μύες, καθώς και μετά από συγχορήγησή τους με το μόλυβδο για χρονικό διάστημα 4 εβδομάδων. To Η. vesiculosum δεν έχει μελετηθεί ποτέ ξανά ως προς τη σύσταση και τις ιδιότητές του. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι και τα δυο αφεψήματα έχουν πλούσιο πολυφαινολικό περιεχόμενο, και ιδιαιτέρως το H. vesiculosum που υπερισχύει του δενδρολίβανου. Επιπλέον, με τη χρήση δυο φασματομετρικών μεθόδων (Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης/AAS, Φασματομετρία Μάζας με Πηγή Επαγωγικά Συζευγμένου Πλάσματος/ICP-MS) αποδείχτηκε ότι ο Pb συσσωρεύεται στον εγκέφαλο ενήλικων μυών και αυτή η συσσώρευση δεν επηρεάζεται σε σημαντικό βαθμό από την συγχορήγηση των δυο αφεψημάτων με το μέταλλο. Ακόμα, η μελέτη της μνήμης και της μάθησης με τη χρήση της δοκιμασίας της Παθητικής Αποφυγής και η μελέτη της ενεργότητας της AChE στον ολικό εγκέφαλο (-παρεγκεφαλίδα) και στην παρεγκεφαλίδα [SS (διαλυτό σε άλας) κλάσμα που περιέχει κυρίως την G1 ισομορφή της AChE και DS (διαλυτό σε απορρυπαντικό κλάσμα) που περιέχει κυρίως την G4 ισομορφή της AChE, η οποία είναι πολύ σημαντική για το νευρικό σύστημα] απέδειξε ότι (α) ο μόλυβδος ασκεί τις νευροτοξικές του επιδράσεις προκαλώντας γνωστικές βλάβες και δυσλειτουργία του χολινεργικού συστήματος. Η ελάττωση της ενεργότητας της AChE μπορεί να οφείλεται στην αποικοδόμηση των χολινεργικών νευρώνων του ιππόκαμπου και της παρεγκεφαλίδας. (β) Τα δυο αφεψήματα αναστέλλουν την AChE με το δενδρολίβανο να είναι πιο αποδοτικό ακολουθώντας ιστοειδική δράση. Η διαδικασία της μνήμης/μάθησης δε φάνηκε να επηρεάζεται από τα δυο αφεψήματα αν και το δενδρολίβανο έδειξε ένα θετικό αποτέλεσμα που δεν ήταν στατιστικά σημαντικό. (γ) Η συγχορήγηση καθενός από τα αφεψήματα με το διάλυμα του Pb προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στην ενεργότητα της AChE (ειδικά στο DS κλάσμα) και το R. officinalis ήταν περισσότερο αποτελεσματικό από το H. vesiculosum. Ολοκληρώνοντας, η συγχορήγηση υποδεικνύει ότι και τα δυο αφεψήματα επηρέασαν με παρόμοιο θετικό τρόπο τη γνωστική λειτουργία σε σχέση με τη δυσλειτουργία που είχε προκαλέσει ο Pb. / There are many environmental factors that can affect positively or negatively both the development and the functions of organisms. Among heavy metals, lead (Pb) is considered to be the most neurotoxic environmental factor, which exerts its negative effects especially in young or developmental organisms. However, there are many environmentally-based factors that could be used for their beneficial properties. In recent years, scientists have turned their interest to the discovery of plants and phenols that could protect the neural system against the neurotoxic effects of heavy metals. Hellenic flora is very rich in common and endemic plants with possible neuroprotective properties. The aim of the present study was to investigate the possible accumulation of lead in adult mice brain and the induction of neurotoxic effects, with emphasis on learning/memory process and acetylcholinesterase (AChE) activity, after the consumption of a lead solution (500 ppm), for 4 weeks. Furthermore, we investigated the polyphenolic content and the possible neuroprotective effects of two beverages (2%w/v), one of the common Rosmarinus officinalis (rosemary) and one of the endemic Hypericum vesiculosum, against metal’s toxicity after consumption/coadministration of each beverage with the lead solution, for 4 weeks. H. vesiculosum has never been studied before for its phenolic content, nor for its biological actions. Our results showed that the two beverages are rich in polyphenols, with H. vesiculosum been richer than R. officinalis. Moreover, the use of two spectrometric methods (Atomic Absorption Spectrometry/AAS, Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry/ICP-MS) indicated that lead accumulates in adult mice brain, which was not affected after its co-administration with each beverage. Furthermore, the study of cognitive function, as assessed by Passive Avoidance test and determination of AChE activity in whole mice brain and cerebellum, [SS (salt soluble) fraction which contains the G1 isoform of AChE; and DS (detergent soluble) fraction which contains the G4 isoform of AChE that is very important for the neural system], demonstrated that: (a) lead exerts its neurotoxic effects by causing learning and memory deficits and dysfunction of the cholinergic system. The decrease of AChE activity may be due to the degeneration of the cholinergic neurons in the hippocampus and cerebellum; (b) Both beverages inhibit AChE activity, with rosemary being more effective and tissue-specific, while no effect was observed on learning/memory, after consumption of the two beverages. Only rosemary showed a positive effect that wasn’t, however, statically important; (c) The co-administration of each beverage with the lead solution caused important changes in AChE activity (especially in the G4 isoform), and R. officinalis was more effective than H. vesiculosum. Both beverages showed similar protective effects against Pb-induced cognitive dysfunctions in mice.

Ο εγκέφαλος των θηλαστικών είναι αρκετά ευάλωτος στις επιδράσεις περιβαλλοντικών τοξινών, λόγω των ιδιαίτερων δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών του. Η έκθεση σε μια νευροτοξίνη εκδηλώνεται συνήθως μέσω γνωστικών και συμπεριφορικών διαταραχών, που συνοδεύουν δυσμενείς νευροχημικές αλλαγές και καθορίζονται από το είδος, την ηλικία, το φύλο, το γενετικό προφίλ, τη δόση, την οδό και τη χρονική περίοδο έκθεσης. Ωστόσο, η χρόνια έκθεση σε ένα νευροτοξικό παράγοντα είναι δυνατόν να επάγει μη αναστρέψιμη νευρωνική βλάβη και εκφύλιση. Το αργίλιο (Al), που συνιστά το τρίτο σε αφθονία στοιχείο στη φύση, ασκεί ποικίλες νευροτοξικές επιδράσεις, ανάλογα με τη χημική μορφή του μετάλλου, τη δόση, την οδό και την περίοδο έκθεσης, ενώ αμφιλεγόμενη παραμένει η εμπλοκή του στην παθογένεια της νόσου του Alzheimer. Η αφλατοξίνη Β1 (AFB1) ανήκει στην ομάδα των μυκοτοξινών (δευτερογενής μεταβολίτης των μυκήτων του γένους Aspergillus), μολύνει καλλιέργειες και ζωοτροφές και αποτελεί ισχυρή ηπατοτοξίνη και ηπατοκαρκινογόνο. Εντούτοις, η νευροτοξικότητα της AFB1 είναι ελάχιστα μελετημένη και οι λίγες αναφορές που παρουσιάζουν την εκδήλωση συμπεριφορικών διαταραχών, αφορούν την έκθεση σε αναπτυξιακό στάδιο. Εκτενής και εντατική είναι τις τελευταίες δεκαετίες η έρευνα της νευροπροστατευτικής δράσης φαρμακευτικών φυτών και των βιοδραστικών συστατικών τους, με απώτερο στόχο την πρόληψη ή αντιμετώπιση της εγκεφαλικής δυσλειτουργίας που επάγεται από γενετικούς ή/και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ενδιαφέρον για τον ελλαδικό χώρο, λόγω της υψηλής εμπορικής του αξίας, έχει το καλλιεργούμενο φυτικό είδος Crocus sativus L., του οποίου οι στύλοι (κρόκος ή σαφράν) χρησιμοποιούνται στη διατροφή ως άρτυμα και η φαρμακευτική τους αξία έχει αναγνωριστεί εδώ και χιλιετίες. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να συμβάλλει στην έρευνα της νευροτοξικής δράσης του Al και της AFB1 και του νευροπροστατευτικού ρόλου των στύλων του C. sativus, εστιάζοντας σε παραμέτρους της μνημονικής λειτουργίας ενηλίκων μυών, της χολινεργικής/μονοαμινεργικής διαβίβασης και της οξειδωτικής/αντιοξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου τους. ΜΕΘΟΔΟΙ: Σε αρσενικούς ενήλικες Balb-c μύες (n=7-10/ομάδα) χορηγήθηκε δια στόματος AlCl3 (50 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) διαλυμένο στο κανονικό πόσιμο νερό για 5 εβδομάδες ή ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) AFB1 (0.3 και 0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) για 4 ημέρες. Η ικανότητα εκχυλισμάτων των στύλων του C. sativus και της κροκετίνης, του κύριου βιοδραστικού μεταβολίτη των καροτενοειδών συστατικών (κροκίνες) του κρόκου, να προλαμβάνουν ή να ανατρέπουν τις βλαπτικές επιδράσεις του Al και της AFB1 στον εγκέφαλο των μυών, διερευνήθηκε ακολουθώντας τα εξής σχήματα χορήγησης: α) υδατικό/μεθανολικό εκχύλισμα κρόκου (60 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χορηγήθηκε i.p. τις τελευταίες 6 ημέρες της περιόδου χορήγησης του AlCl3 (50 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα στο πόσιμο νερό για 5 εβδομάδες), β) αφέψημα κρόκου (0.45 mg/mL) καταναλώθηκε για 2 εβδομάδες πριν τη χορήγηση AFB1 (0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα i.p. τις τελευταίες 4 ημέρες της περιόδου χορήγησης του αφεψήματος), και γ) καθαρή κροκετίνη (4 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χορηγήθηκε i.p. για 3 ημέρες πριν ή μετά τη χορήγηση AFB1 (0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα i.p. για 4 ημέρες). Μελετήθηκαν επίσης, οι επιδράσεις των προηγούμενων σχημάτων χορήγησης του αφεψήματος κρόκου και της κροκετίνης στον εγκέφαλο υγιών ενηλίκων μυών. Η ικανότητα μάθησης/μνήμης των μυών αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία παθητικής αποφυγής. Η ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης [AChE, διαλυτές σε άλας (SS)/απορρυπαντικό (DS) ισομορφές], της βουτυρυλοχολινεστεράσης (BuChE, SS/DS ισομορφές) και της μονοαμινοξειδάσης (ΜΑΟ, -Α και -Β ισομορφές) προσδιορίστηκαν στον ολικό εγκέφαλο (-ce, πλην παρεγκεφαλίδας) και την παρεγκεφαλίδα, ως δείκτες της χολινεργικής και μονοαμινεργικής διαβίβασης, αντιστοίχως. Επίσης, μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) και της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH), ως δείκτες της λιπιδικής υπεροξείδωσης και της αντιοξειδωτικής άμυνας, αντιστοίχως, των εγκεφαλικών ιστών. Με τη χρήση φασματομετρίας ατομικής απορρόφησης μετρήθηκαν τα επίπεδα Al στους εγκεφαλικούς ιστούς, ενώ, για πρώτη φορά, η κροκετίνη προσδιορίστηκε στον ολικό εγκέφαλο (-ce) των μυών μετά την i.p. χορήγηση εκχυλίσματος κρόκου, με HPLC ανάλυση. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η μακρόχρονη πρόσληψη υψηλής δόσης AlCl3 μέσω του πόσιμου νερού οδήγησε σε εξασθένηση της μάθησης/μνήμης των μυών, σημαντική μείωση της ενεργότητας της AChE και BuChE, αύξηση της ενεργότητας των ισομορφών της ΜΑΟ του ολικού εγκεφάλου (-ce), αλλά αναστολή της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας, σημαντική αύξηση των επιπέδων MDA στον εγκέφαλο και μείωση της συγκέντρωσης GSH στους εγκεφαλικούς ιστούς. Συσσώρευση του μετάλλου καταγράφηκε στους εγκεφαλικούς ιστούς των μυών που λάμβαναν AlCl3. Μνημονικό έλλειμμα εμφάνισαν οι μύες που έλαβαν την υψηλή (0.6 mg/kg) αλλά όχι χαμηλή δόση (0.3 mg/kg) AFB1. Επίσης, η βραχύχρονη i.p. χορήγηση της μυκοτοξίνης ανέστειλε τις χολινεστεράσες (ChEs), ενεργοποίησε τη ΜΑΟ, αύξησε σημαντικά τη λιπιδική υπεροξείδωση και μείωσε τα επίπεδα GSH στους εγκεφαλικούς ιστούς. Ωστόσο, διαφορική απόκριση στην έκθεση στην AFB1 παρουσίασαν οι ισομορφές της BuChE και ΜΑΟ των εγκεφαλικών ιστών, ανάλογα με τη χορηγούμενη δόση. Αντιχολινεστερασική και αντιοξειδωτική δράση επέδειξαν τόσο η μακρόχρονη πρόσληψη αφεψήματος κρόκου όσο και η βραχύχρονη i.p. χορήγηση κροκετίνης στους εγκεφαλικούς ιστούς των υγιών μυών, ενώ δεν μετέβαλλαν τη μνημονική τους ικανότητα. Η βραχύχρονη συγχορήγηση εκχυλίσματος κρόκου στο τέλος της περιόδου πρόσληψης AlCl3, αν και δεν είχε καμία επίδραση στη γνωστική ικανότητα των μυών, αντέστρεψε σημαντικά τις επαγόμενες από το Al αλλαγές της ενεργότητας της ΜΑΟ και των επιπέδων MDA και GSH των εγκεφαλικών ιστών. Επιπλέον, η ενεργότητα των ισομορφών της AChE των εγκεφαλικών ιστών μειώθηκε περαιτέρω σημαντικά μετά τη χορήγηση του εκχυλίσματος. HPLC ανάλυση του ολικού εγκεφάλου (-ce) των μυών αποκάλυψε, για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη, την παρουσία κροκετίνης μετά τη βραχύχρονη συγχορήγηση εκχυλίσματος κρόκου, η οποία δεν ανιχνεύτηκε στους μύες μάρτυρες. Η μακρόχρονη καθημερινή κατανάλωση αφεψήματος κρόκου πριν την έκθεση σε υψηλή δόση AFB1 απέτρεψε την επαγόμενη από τη μυκοτοξίνη μνημονική εξασθένηση, αναστολή της DS-BuChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), αύξηση της ενεργότητας της ΜΑΟ-Α του εγκεφάλου και της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας και οξειδωτική βλάβη των λιπιδίων στους εγκεφαλικούς ιστούς. Επίσης, οι μύες που κατανάλωναν το αφέψημα εμφάνισαν περαιτέρω σημαντική μείωση της ενεργότητας των ισομορφών της AChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), της DS-AChE της παρεγκεφαλίδας και των επιπέδων GSH των εγκεφαλικών ιστών. Αν και η βραχύχρονη i.p. χορήγηση καθαρής κροκετίνης πριν ή μετά την έκθεση σε υψηλή δόση AFB1 δεν επηρέασε την ικανότητα μάθησης/μνήμης των μυών, έδρασε αποτελεσματικά στην πρόληψη ή αντιστροφή της επαγόμενης από τη μυκοτοξίνη αναστολής της BuChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), ενεργοποίησης των ισομορφών της ΜΑΟ του εγκεφάλου και αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης των εγκεφαλικών ιστών. Ωστόσο, μόνο η προηγηθείσα χορήγηση κροκετίνης απέτρεψε την αύξηση της ενεργότητας της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας και τη μείωση των επιπέδων GSH των εγκεφαλικών ιστών, που προκάλεσε η χορήγηση της AFB1. Διαφορική απόκριση (περαιτέρω αναστολή ή αύξηση) στη χορήγηση κροκετίνης εμφάνισαν οι ισομορφές της AChE των εγκεφαλικών ιστών, ανάλογα με τη χρονική ακολουθία της χορήγησης. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η μακρόχρονη πρόσληψη AlCl3 μέσω του πόσιμου νερού και η βραχύχρονη συστημική έκθεση στην AFB1 ασκούν ισχυρές νευροτοξικές επιδράσεις στους ενήλικες μύες, όπως απέδειξαν η επαγωγή μνημονικής εξασθένησης και οι νευροχημικές διαταραχές. Η αναστολή του γνωστικού ελλείμματος από τη μακρόχρονη κατανάλωση αφεψήματος κρόκου, υποστηρίζει τη νευροπροστατευτική δράση του κρόκου έναντι της νευροτοξικότητας της AFB1 και τον αναδεικνύει ως ελπιδοφόρο διατροφικό παράγοντα στην πρόληψη της εγκεφαλικής δυσλειτουργίας. Ωστόσο, οι ευεργετικές επιδράσεις της κροκετίνης στους νευροχημικούς δείκτες της εγκεφαλικής λειτουργίας υπό συνθήκες τοξικότητας και η απόδειξη της βιοδιαθεσιμότητάς της στον εγκέφαλο, προτείνουν τη συμβολή των καροτενοειδών συστατικών του κρόκου στις νευροπροστατευτικές του ιδιότητες και ενθαρρύνουν την περαιτέρω διερεύνησή τους ως νευροπροστατευτικών παραγόντων. / Mammalian brain is quite susceptible to environmental toxins, due to its special structural and functional features. Exposure to a neurotoxin is commonly manifested through cognitive and behavioral disturbances that follow adverse neurochemical changes and are defined by the animal species in question, the age, the gender, the genetic profile, the dose, the route and the period of exposure. However, chronic exposure to a neurotoxic agent may induce irreversible neuronal damage and degeneration. Aluminum (Al), which is the third most abundant element in nature, exerts diverse neurotoxic effects, depending on the metal’s chemical form, the dose, the route and the period of exposure, while its implication in the pathogenesis of Alzheimer’s disease remains controversial. Aflatoxin B1 (AFB1) is classified to the group of mycotoxins (secondary metabolite of the fungi of Aspergillus sp.), contaminates crops and feeds and constitutes potent hepatotoxin and hepatocarcinogen. Nevertheless, AFB1 neurotoxicity is poorly studied and the few reports focus on the manifestation of behavioral disorders after exposure at developmental stage. During the last decades, extensive research on the neuroprotective action of medicinal plants and their bioactive components is carried out, with the aim of prevention or treatment of brain dysfunction that is provoked by genetic and/or environmental agents. The plant Crocus sativus L. is of particular interest in Greece ,due to its large-scale cultivation and the high commercial value of its styles (saffron); saffron is used as a spice in diet and its medicinal properties have been recognized for millenia. The aim of the present study was to contribute to the investigation of the neurotoxic activity of Al and AFB1 and the neuroprotective role of saffron, focusing on aspects of memory function, brain cholinergic/monoaminergic transmission and oxidant/antioxidant state in adult mice. METHODS: Male adult Balb-c mice (n=7-10/group) received either AlCl3 orally (50 mg/kg body weight/day) dissolved in normal drinking water for 5 weeks or AFB1 intraperitoneally (i.p.) (0.3 and 0.6 mg/kg body weight/day) for 4 days. The potential of saffron extracts and crocetin, the main bioactive metabolite of saffron carotenoid constituents (crocins), in prevention or reversal of the detrimental effects of Al and AFB1 on mouse brain, was investigated by adopting the following administration schemes: a) aqueous methanolic extract of saffron (60 mg/kg body weight/day) was administered i.p. for the last 6 days of AlCl3 treatment period (50 mg/kg body weight/day in drinking water for 5 weeks), b) saffron infusion (0.45 mg/mL) was consumed for 2 weeks prior to AFB1 administration (0.6 mg/kg body weight/day i.p. for the last 4 days of saffron infusion treatment period), and c) pure crocetin (4 mg/kg body weight/day) was administered i.p. for 3 days before or after AFB1 administration (0.6 mg/kg body weight/day i.p. for 4 days). The effects of the previous administration schemes of saffron infusion and crocetin on brain of healthy adult mice, were also studied. The learning/memory ability of mice was evaluated by step-through passive avoidance task. The activity of acetylcholinesterase [AChE, salt-(SS)/detergent-soluble (DS) isoforms], butyrylcholinesterase (BuChE, SS/DS isoforms) and monoamine oxidase (MAO, -A and -B isoforms) was assessed in whole brain (-ce, minus cerebellum) and cerebellum, as indices of cholinergic and monoaminergic transmission, respectively. Moreover, malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) concentrations were determined as indices of lipid peroxidation and antioxidant defence, respectively, in cerebral tissues. Cerebral tissues’ Al levels were measured by atomic absorption spectrometry, while, for the first time, crocetin was determined in mouse whole brain (-ce) after i.p. administration of saffron extract by HPLC analysis. RESULTS: Long-term intake of high dose of AlCl3 through drinking water resulted in learning/memory impairment of mice, significant reduction of AChE and BuChE activity, increase of MAO isoforms’ activity in whole brain (-ce), but inhibition of cerebellar MAO-B, significant elevation of brain MDA levels and decrease of GSH content in cerebral tissues. Metal accumulation was recorded in brain tissues of AlCl3 treated mice. Mice receiving high (0.6 mg/kg) but not low dose (0.3 mg/kg) of AFB1 displayed memory deficit. Furthermore, short-term i.p. administration of mycotoxin inhibited cholinesterases (ChEs), activated MAO, increased significantly lipid peroxidation and reduced GSH levels in cerebral tissues. However, brain tissues’ BuChE and MAO isoforms presented differential response to AFB1 exposure, depending on the administered dosage. Both long-term saffron infusion intake and short-term i.p. administration of crocetin exerted anti-cholinesterase and antioxidant action in healthy mice’ cerebral tissues, while their memory performance remained unchanged. Although short-term co-administration of saffron extract at the end of AlCl3 treatment period had no effect on cognitive capacity of mice, it reversed significantly the Al-induced changes in MAO activity and the levels of MDA and GSH of cerebral tissues. Moreover, cerebral AChE isoforms’ activity was further significantly decreased following saffron extract co-administration. HPLC analysis of mouse whole brain (-ce) revealed, for the first time, the presence of crocetin after short-term saffron extract co-administration, which was not detected in control mice. Long-term daily consumption of saffron infusion prior to AFB1 (high dose) exposure prevented the mycotoxin-induced memory impairment, inhibition of whole brain (-ce) DS-BuChE, increase of brain MAO-A and cerebellar MAO-B activity, and oxidative damage of lipids in brain tissues. Also, saffron infusion pre-treated mice displayed further significant decrease of the activity of AChE isoforms in whole brain (-ce), DS-AChE in cerebellum and the levels of GSH in cerebral tissues. Although, short-term i.p. administration of pure crocetin before or after AFB1 (high dose) exposure had no effect on learning/memory ability of mice, it effectively prevented or reversed the mycotoxin-induced inhibition of whole brain (-ce) BuChE, activation of brain MAO isoforms and elevation of cerebral tissues’ lipid peroxidation. However, only crocetin pre-treatment inhibited the increase of cerebellar MAO-B activity and reduction of brain tissues’ GSH content which were provoked by AFB1 administration. Cerebral tissues’ AChE isoforms presented differential response (further decrease or increase) to crocetin treatment, depending on time course of administration. CONCLUSION: The findings of the present study show that long-term intake of AlCl3 through drinking water and short-term systemic exposure to AFB1, exert strong neurotoxic effects on adult mice, as evidenced by the induction of memory impairment and the neurochemical disturbances. The inhibition of cognitive deficit by long-term saffron infusion consumption supports its neuroprotective action against AFB1 neurotoxicity and highlights saffron as a promising dietary agent in prevention of brain dysfunction. However, the beneficial effects of crocetin on neurochemical indices of brain function under toxicity and the demonstration of its bioavailability in brain, suggest the contribution of saffron carotenoids in saffron’s neuroprotective properties and encourage their further investigation as neuroprotective agents.

Στόχος: Η νόσος του Alzheimer (ΝΑ) είναι η πιο κοινή μορφή άνοιας, η παθολογία της οποίας χαρακτηρίζεται εν μέρει από την εναπόθεση ινιδίων που σχηματίζονται από την αμυλοειδική πρωτεΐνη β (Αβ), τα οποία οδηγούν στην καταστροφή των χολινεργικών νευρώνων, πρωτίστως στον εγκεφαλικό φλοιό και τον ιππόκαμπο. Η εκτεταμένη αυτή απώλεια των νευρώνων είναι προοδευτική και έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή γνωστικών εγκεφαλικών λειτουργιών και τη δημιουργία σοβαρότατης, μη αναστρέψιμης άνοιας. Η Αβ-επαγόμενη τοξικότητα συνοδεύεται από ποικίλα γεγονότα, συμπεριλαμβανομένου του οξειδωτικού στρες (O.S) το οποίο χαρακτηρίζεται από αύξηση των επιπέδων των ενεργά αντιδρώντων ειδών οξυγόνου (ROS) όπως το Η2Ο2. Έρευνες αναφέρουν ότι οι τοξικοεπαγόμενες κυτταρικές βλάβες, συνεισφέρουν σημαντικά στην νευροτοξικότητα και την παθολογία της ΝΑ. Με τα πρόσφατα δεδομένα να υποδηλώνουν άμεση συσχέτιση της ΝΑ με την εναπόθεση της Αβ, το οξειδωτικό στρες και την απώλεια της χολινεργικής διαβίβασης, το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας έχει στραφεί, είτε στην ενίσχυση της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού, είτε στη ρύθμιση του μεταβολισμού της αμυλοειδικής προ-πρωτεΐνης ΑΡΡ προς το μη-αμυλοειδογενές μονοπάτι καθώς επίσης και προς την ενίσχυση των μνημονικών διεργασιών. Τα φυσικά προϊόντα αποτελούν πηγή χρήσιμων φαρμακευτικών σκευασμάτων (π.χ. η γαλανταμίνη είναι ένα από τα εγκεκριμένα φαρμακευτικά σκευάσματα για τη ΝΑ) τα συστατικά των οποίων αποτελούν έναυσμα για το σχεδιασμό αποτελεσματικότερων φαρμάκων, σε σχέση κυρίως με τις ανεπιθύμητες δράσεις. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον μεταξύ των φυτών για τον ελλαδικό χώρο έχει το φυτό Crocus sativus L., το οποίο καλλιεργείται στο χωριό Κρόκος της Κοζάνης για τους κόκκινους στύλους του, οι οποίοι χρησιμοποιούνται ευρύτατα στη διατροφή ως άρτυμα (κρόκος ή σαφρόν). Ο κρόκος, πέραν των ιδιοτήτων του ως καρύκευμα, αποτελεί ένα φυτικό σκεύασμα με σημαντικές ιατρικές ιδιότητες, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί κατά κόρον στην παραδοσιακή ιατρική. Οι στύλοι του κρόκου περιέχουν ασυνήθιστα υδρόφιλα καροτενοειδή, τις κροκίνες, οι οποίες είναι γλυκοζίτες της κροκετίνης. Σκοπός της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η μελέτη των νευροπροστατευτικών μηχανισμών των συστατικών των στύλων του φυτού Crocus sativus και άλλων ενδημικών ειδών Crocus με έμφαση στη νόσο του Alzheimer. To εκχύλισμα των στύλων του C. sativus (CSE) και τα συστατικά του, καθώς και άλλα ενδημικά είδη Crocus χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση: (α) των αντιοξειδωτικών τους ιδιοτήτων και της επίδρασης τους στη συσσωμάτωσης της Αβ, τόσο in vitro, όσο και σε κυτταρικές καλλιέργειες (SH-SY5Y, HEK293, CHOAPP770) και (β) των μνημονικών διεργασιών, της οξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου και της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) ενήλικων και γηραιών αρσενικών Balb-c μυών μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση CSE (7-ημερών) (30 & 60 mg/Kg βάρος σώματος) (n = 9/ομάδα). Μεθοδολογία: Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των στύλων προσδιορίστηκαν με εκτίμηση της ισοδύναμης με το Trolox ικανότητας να δεσμεύει ελεύθερες ρίζες (TEAC) και της ικανότητας αναγωγής του σιδήρου (FRAP), ενώ η επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων στη συσσωμάτωση ινιδίων της Αβ μελετήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-PAGE), τη μέθοδο της θειοφλαβίνης Τ και της δέσμευσης σε DNA. Η επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων στο μεταβολισμό της ΑΡΡ πραγματοποιήθηκε τόσο στα κυτταρικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα, όσο και στο θρεπτικό μέσο μετασχηματισμένων CHO κυττάρων (CHOAPP770), με ανάλυση κατά Western και με ανοσοκατακρήμνιση, ενώ οι επιπτώσεις του H2O2-επαγόμενου οξειδωτικού στρες, προσδιορίστηκαν με μέτρηση της κυτταρικής ζωτικότητας (ΜΤΤ assay), των επιπέδων ελευθέρων ριζών (DCF-DH2 assay) και της ενεργότητας της κασπάσης-3. Η αξιολόγηση της συμπεριφοράς των πειραματοζώων, πραγματοποιήθηκε με το τεστ παθητικής αποφυγής. Η μελέτη της αντιοξειδωτικής/αντι-αποπτωτικής δράσης των φυτικών εκχυλισμάτων σε ενήλικες και γηραιούς μύες πραγματοποιήθηκε σε ολικό εγκεφαλικό ομογενοποίημα και εκτιμήθηκε υπολογίζοντας την ικανότητα αναγωγής του σιδήρου (FRAP), των συγκεντρώσεων του ασκορβικού οξέος, της γλουταθειόνης, της μηλονικής διαλδεϋδης και της κασπάσης-3. Η μελέτη της πιθανής ανασταλτικής δράσης των εκχυλισμάτων στην ενεργότητα της AChE μελετήθηκε με τη μέθοδο του Ellman, ενώ ο τύπος αναστολής, προσδιορίστηκε με κινητικές μελέτες. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι, in vitro, τα εκχυλίσματα των στύλων των ειδών Crocus παρουσίασαν υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα από αυτή της τομάτας και του καρότου, καθώς και σημαντική δοσο- και χρονο-εξαρτώμενη ανασταλτική επίδραση στη δημιουργία ινιδίων της Αβ. Η trans-κροκίνη-4, ο διγεντιοβιοζυλ-εστέρας της κροκετίνης, το κύριο καροτενοειδές συστατικό του εκχυλίσματος των στύλων, προκάλεσε αναστολή της συσσωμάτωσης της Αβ ακόμη και σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις από αυτή της διμεθυλοκροκετίνης (ένα συνθετικό ανάλογο της κροκετίνης το οποίο δεν φέρει σάκχαρα στα άκρα του), υποδηλώνοντας έτσι ότι η δράση των καροτενοειδών ενισχύεται από την παρουσία των σακχάρων. Εν συγκρίσει με τον C. sativus, ο C. boryi και ο C. niveus παρουσίασαν πολύ πιο ισχυρή αντιαμυλοειδική δράση, γεγονός που πιθανότατα να οφείλεται στη διαφορετική σύσταση τους. Στις κυτταρικές καλλιέργειες, τα αποτελέσματα ελέγχου του μεταβολισμού της ΑΡΡ με ανοσοαποτύπωση κατά Western, έδειξαν ότι μόνον το ολικό εκχύλισμα των στύλων του C. sativus, καθώς και η σαφρανάλη, μια εκ των επιμέρους συστατικών του, αύξησε τα επίπεδα έκκρισης των αμυλοειδικών (sAPPβ) και μη-αμυλοειδικών (sAPPα) μορφών της ΑΡΡ, στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των CHOAPP770 κυττάρων. Η trans-κροκίνη-4 αύξησε τα επίπεδα έκκρισης των sAPPβ, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή των μονάδων σακχάρων στη διαδικασία της αμυλοειδογένεσης. Δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης της ολικής πρωτεΐνης (holoAPP), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση των sAPPα/β στο θρεπτικό μέσο μπορεί να οφείλεται στη μετατόπιση της ισορροπίας του μεταβολισμού της ΑΡΡ προς το μονοπάτι της α- ή της β-εκκριτάσης. Επιπροσθέτως, ανοσοκατακρήμνιση της Αβ έδειξε ότι παρουσία των φυτικών εκχυλισμάτων, καμία μεταβολή δεν παρατηρήθηκε ούτε και στην αμυλοειδογένεση, στο σχηματισμό δηλαδή συσσωμάτων της Αβ, μεγάλου μοριακού βάρους, παρά την τάση προς αύξηση του p3 υπολείμματος. Η αύξηση που παρατηρήθηκε στην παραγωγή των διμερών δομών της Αβ παρουσία των συστατικών του C. sativus, εν συγκρίσει με τα ολικά εκχυλίσματα των στύλων των ειδών Crocus, υποδηλώνει ότι τα καροτενοειδή εμπλέκονται κατά κάποιον τρόπο στην διαδικασία της αμυλοειδογένεσης, ενισχύοντας τη δημιουργία και σταθερότητα των διμερών. Επώαση των κυττάρων με H2O2 οδήγησε σε μείωση της κυτταρικής ζωτικότητας, η οποία συνοδεύτηκε και από αύξηση των επιπέδων των ROS και ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Τα ανωτέρω, αντιστράφηκαν πλήρως, ύστερα από επώαση των SH-SY5Y κυττάρων με εκχυλίσματα από τα τρία είδη Crocus, με τον C. sativus να είναι αποτελεσματικότερος όλων, ενώ εξίσου αποτελεσματικά ήταν και τα επιμέρους συστατικά του C. sativus, με το βαθμό αποτελεσματικότητας να διαμορφώνεται ως εξής: CRT≥Σαφρανάλης ακόμη και στις υψηλές συγκεντρώσεις Η2Ο2. Στην HEK293 κυτταρική σειρά, η συγχορήγηση της CRT και της σαφρανάλης με διαβαθμιζόμενες συγκεντρώσεις Η2Ο2, οδήγησε σε προστασία έναντι του Η2Ο2-επαγόμενου οξειδωτικού στρες και της παραγωγής ROS, εν αντιθέσει με το ολικό εκχύλισμα κρόκου, το οποίο δεν επέδειξε προστατευτική δράση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα επιμέρους συστατικά του C. sativus προστάτευσαν έναντι της κυτταροτοξικότητας του H2O2 σε όλα τα κυτταρικά συστήματα, μέσω μείωσης του οξειδωτικού φορτίου και της παραγωγής ROS. Αντιθέτως, επώαση των υπό μελέτη φυτοχημικών σε κυτταρικό σύστημα επιβαρυμένο με Αβ (μετασχηματισμένη CHO κυτταρική σειρά) προκάλεσε επιμέρους επιδείνωση της Η2Ο2-επαγόμενης τοξικότητας. Παρόλα αυτά, η χορήγηση κρόκου οδήγησε σε αύξηση των κυτταρικών επιπέδων της GSH, ενώ εξίσου σημαντική ήταν και η μείωση που παρατηρήθηκε στα επίπεδα της MDA, με το βαθμό αποτελεσματικότητας να διαμορφώνεται ως εξής: C. boryi=C. niveus=CRT≥Σαφρανάλης. Τα αποτελέσματα της χορήγησης CSE σε μύες έδειξαν στατιστικώς σημαντική βελτίωση στη μνήμη/μάθηση των ενηλίκων και γηραιών μυών. Παρατηρήθηκαν επίσης μειωμένα επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων και κασπάσης-3, αύξηση της συγκέντρωσης της ανηγμένης γλουταθειόνης και του ασκορβικού οξέος στον εγκέφαλο των μυών που τους χορηγήθηκε CSE. Επιπλέον, η δραστικότητα της διαλυτής σε άλας και σε απορρυπαντικό μορφής της AChE μειώθηκε στατιστικώς σημαντικά στους ενήλικες μύες μετά από χορήγηση CSE, σε αντίθεση με τους αντίστοιχους γηραιούς, όπου δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή. Επιπροσθέτως, in vitro ανάλυση της ενεργότητας της AChE, έδειξε ότι παρουσία των απομονωθέντων κροκινών και της σαφρανάλης, παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ενεργότητας του εν λόγω ενζύμου (μη-συναγωνιστική αναστολή) –όμοια με αυτή της γαλανταμίνης- εν αντιθέσει με το ολικό εκχύλισμα των στύλων των ειδών Crocus το οποίο δεν ήταν και τόσο δραστικό. Αυτός ο τύπος αναστολής υποδηλώνει ότι το σημείο πρόσδεσης τους βρίσκεται στο αλλοστερικό τμήμα του ενζύμου της AChE, το οποίο κατέχει, πιθανότατα, κύριο ρόλο και στη διέγερση της εναπόθεσης ινιδίων της Αβ. Συμπεράσματα: Η έλλειψη αποτελεσματικής θεραπείας έναντι της ΝΑ, κάνει τη χρήση φυτικών σκευασμάτων, πολλαπλών στόχων και με ισχυρές νευροπροστατευτικές ιδιότητες, να θεωρείται ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία, η οποία θα είναι αποτελεσματική έναντι των μηχανισμών που υπόκεινται των νευροεκφυλιστικών ασθενειών, π.χ. του οξειδωτικού στρες, της συσσωμάτωσης των πρωτεϊνών, των συμπεριφορικών και μνημονικών αλλαγών κ.ά. Τα αποτελέσματα μας συγκλίνουν προς αυτή την κατεύθυνση, καθότι υποδηλώνουν την πιθανή χρήση των συστατικών των στύλων του C. sativus στην αναστολή της αμυλοειδογένεσης και της εναπόθεσης της Αβ στον ανθρώπινο εγκέφαλο, ενώ καταδεικνύουν, για πρώτη φορά, ότι η ευεργετική για τη μνήμη δράση που παρατηρήθηκε ύστερα από χορήγηση κρόκου στους ενήλικους και γηραιούς μύες, συσχετίζεται πιθανότατα με την υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα του εγκεφάλου και εν μέρει, την αναστολή της ενεργότητας της AChE (για την περίπτωση των ενηλίκων μυών). Παρόλα αυτά όμως, καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα της AChE των γηραιών μυών, που είχαν λάβει εκχύλισμα κρόκου, παρά την ενίσχυση των αντιοξειδωτικών συστημάτων του οργανισμού, γεγονός που ενισχύει τη σπουδαιότητα της ενσωμάτωσης μιας υγιεινούς διατροφής για τη λειτουργία του εγκεφάλου, από την πρώιμη ενηλικίωση. Το γεγονός, όμως, ότι οι στύλοι του C. sativus αποτελούν μέρος της διατροφής μας ως άρτυμα (κρόκος, σαφράνι ή ζαφορά) μεγεθύνει την αξία αυτών των πειραματικών ευρημάτων αφού θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν άμεσα. Η ταυτοποίηση των κροκινών ως ένα από τα κύρια δραστικά φυτοχημικά θα μπορούσε να αξιοποιηθεί στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μέσων για τη νόσο του Alzheimer. Όμως, επιπρόσθετες μελέτες απαιτούνται προκειμένου να διερευνήσουμε την αποτελεσματικότητα αυτού του φυτικού εκχυλίσματος και των συστατικών του ως αντιαμυλοειδικά σκευάσματα. / Objective: Alzheimer’s disease (AD) is characterized pathologically by the deposition of amyloid-β (Aβ) peptide aggregates and neurofibrillary tangles, which lead to destruction of cholinergic neurons in the cerebral cortex and the hippocampus. That loss is progressive and results in profound memory disturbances and irreversible impairment of cognitive function. Aβ-induced toxicity is accompanied by a variegated combination of events, including oxidative stress (O.S) which is characterized by an increase in the levels of reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Research indicates that cellular insults resulting from free radicals may be a major contributor to the neurotoxicity and pathology of AD. With recent findings suggesting links between AD, deposition of Aβ, O.S. and loss of cholinergic transmission, much attention has been devoted currently, either to antioxidant research or regulation of the amyloid precursor protein (APP) metabolism towards the non-amyloidogenic pathway, as well as to memory enhancing agents. Natural products are still a source of useful drugs (i.e. galanthamine, one of the approved therapies of AD) and of lead compounds for the design of more effective compounds with less side-effects. Of particular interest among the plants that grow in Greece, acquires the plant Crocus sativus, which is cultivated in Kozani, Greece, for its red-coloured styles, which are used as a spice (saffron). Saffron has been used for medicinal purposes for millennia. Its styles are a source of unusual polar carotenoids (crocins), i.e. mono- and di-glycosides of crocetin. The aim of the present study was to examine the possible neuroprotective mechnisms of Crocus sativus’ and other endemic Crocus species’ styles constituents, in relation to AD. In the present study, the Crocus sativus styles extract (CSE) and its constituents and other endemic Crocus species have been used to evaluate: (a) the antioxidant properties and effect on Aβ-aggregation both in vitro and in various cell culture systems (SHSY5Y, HEK293, CHOAPP770) and (b) learning and memory, brain oxidative status and acetylcholinesterase activity (AChE) of adult and aged, male Balb-c mice, after CSE intraperitoneal (7-days) administration (30 & 60 mg/kg body weight) (n= 9/group). Methodology: The in vitro antioxidant properties of the tested phytochemicals were determined by measuring the ferric-reducing antioxidant power (FRAP) and Trolox-equivalent antioxidant capacity (TEAC), while its effects on Aß-aggregation and fibrillogenesis were studied by SDS-PAGE, thioflavine T (ThT)-based fluorescence assay and DNA-shift binding assay. The effects of plant extracts on the regulation of APP processing in stably transfected CHO cells (CHOAPP770) was examined by Immunoprecipitation (IP)/Western blot. Measurements of cell viability and scavenging of ROS production after co-treatment with Η2Ο2 and various concentrations of plant extracts were performed by 3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), 2',7'-dichlorofluorescein (DCF) assays and determination of caspase-3 activity. Evaluation of rodent learning and memory was done by a double trial, step-through test. Mice were sacrificed on day 7 and the effects on the oxidant status and AChE of whole brain homogenates was studied by determination of FRAP, ascorbic acid concentration (colorimetric), malondialdehyde and glutathione levels (fluorometric) and by the Ellman’s reagent. Caspase-3 activity (colorimetric) was also determined. Results: In our in vitro study, the water:methanol (50:50, v/v) extracts of Crocus species were shown to possess good antioxidant properties, higher than those of tomatoes and carrots and inhibit Aß fibrillogenesis in a concentration and time-dependent manner. The main carotenoid constituent, transcrocin- 4 (TC4), the di-gentibiosyl ester of crocetin, inhibited Aß fibrillogenesis at lower concentrations than dimethylcrocetin (DMCRT, a synthetic analogue of crocetin, lacking its sugar components), revealing that the action of the carotenoid is enhanced by the presence of the sugars. In the cell culture system, results showed that CSE and safranal treatment significantly enhanced both the release of amyloidogenic/and non-amyloidogenic soluble forms of sAPPα and sAPPβ into the conditioned media of CHOAPP770 cells. Τrans-crocin-4 resulted in an increase in sAPPβ, indicating the possible implication of sugan units in the process of amyloidogenesis. No difference was observed in full-length APP indicating that the increase of sAPPα/β in the media may be related to a shift in the balance of APP metabolism towards the α- or β-secretase pathway, rather than due to an increase in the expression levels of cellular APP. In addition, immunochemical labelling of Aβ revealed a trend towards p3 production in the cell culture media treated with the tested compounds. Plant extracts had no effect on production of higher molecular mass Aβ species. The increase in Aβ dimmers observed in the presence of C. sativus constituents, in contrast to the crude Crocus styles extracts, was ascribed to the implication of carotenoids in the amyloidogenic process, resulting in the formation and stability of dimmers. Hence, any attenuation of Aβ fibrillogenesis that may have been observed was not because of an overall inhibition of Aβ production. Treatment of cells with H2O2 caused the loss of cell viability, which was associated with the elevation of ROS level and the activation of caspase-3. These phenotypes induced by H2O2, were totally reversed by the tested phytochemicals in the SH-SY5Y cell line, with C. sativus being the most effective. Its carotenoid constituents were equally effective, with CRT≥safranal, even at higher H2O2 concentrations. In HEK293 cell line, co-treatment of the cells with varying concentrations of H2O2, along with CRT and safranal, resulted in reduced H2O2–induced cytotoxicity and ROS production, in contrast to the crude extract of C. sativus, which was less effective. Based on these observations, it seems that in both cell lines tested, the carotenoid constituents of C. sativus reduced the H2O2-induced oxidative damage, probably by reducing oxidative stress and ROS production. In contrast, only moderate effects were observed in stably transfected CHO cells, where co-treatment of the cells with H2O2 and the tested phytochemicals resulted in additional cytotoxicity. However, incubation of this cell line with C. sativus resulted in an increase in GSH levels, followed by a decrease in the MDA values, with C. boryi & C. niveus being equally effective and more effective than CRT and safranal. Results in mice, showed that only the CSE (60 mg/kg)-treated adult and aged mice exhibited a significant improvement in learning and memory. CSE administration resulted also in reduced lipid peroxidation products, in higher total brain antioxidant activity and reduced caspase-3 activity of both adult and aged mice. Furthermore, AChE activity was significantly decreased in CSE-treated adult mice; while no alterations were observed in CSE-treated aged mice. Interestingly, analysis of the in vitro potency of pure crocin constituents for AChE inhibition revealed a dose-dependent inhibitory profile, in the order of CRT≥Safranal>DMCRT, which mimicked that of galanthamine. This suggests that these compounds bind to different loci of the aromatic gorge of AChE, which might be at (or satisfactory close to) the subsites of the aromatic gorge, which seems to play an important role in accelerating Aβ plaque deposition. Conclusions: The lack of an effective treatment against AD, along with our inability to alter the genetic pool, makes the use of plant extracts with potent multi-targets and neuroprotective actions, as ideal candidates against the underlying mechanisms that characterize neurodegenerative diseases, like oxidative stress, protein misfolding, behavioral/cognitive alterations etc. Our finding also point towards such direction by indicating the possible use of C. sativus styles constituents for inhibition of aggregation and deposition of Aβ in the human brain. They also showed, for the first time, that the significant cognitive enhancement observed after CSE administration in adult & aged mice is closely related to higher brain antioxidant properties and inhibition of AChE (in the case of adult mice). However, no alterations were observed in the brain AChE levels of aged mice stressing the importance of healthy diet and early nutritional intervention on brain function from adulthood to senescence, as it may prove to be a valuable asset in “quenching the fires” of oxidative stress in aging and perhaps in neurodegenerative diseases. The fact though that saffron, as a spice, is part of our nutrition provides additional value to our experimental results, which could be of immediate use. The identification of crocins as one of the most effective contained phytochemicals could, in the long term, be used as new therapeutic means against AD. However, additional studies are required in order to dealinate further the effectiveness of the current plant extract as a potent “anti-amyloidogenic drug.

"Το τσάι του βουνού" (στο οποίο ανήκουν πολλά είδη του γένους Sideritis) καταναλώνεται παραδοσιακά στην Ελλάδα ως ηρεμιστικό αλλά και ενάντια του κρυολογήματος και αλλεργιών. Η παρούσα μελέτη διερευνά την πιθανή νευροπροστατευτική δράση του ανωτέρω φυτού και εστιάζεται: α) στην επίδραση του αφεψήματος του φυτού Sideritis clandestina subsp. clandestina σε συμπεριφερικές παραμέτρους ενηλίκων μυών (άγχος/φόβος, μνήμη/μάθηση), β) στην επίδραση του αφεψήματος του ανωτέρω φυτού σε βιοχημικές παραμέτρους και πιο συγκεκριμένα στη συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης, στην υπεροξείδωση λιπιδίων και στην ενεργότητα δυο ισομορφών του ενζύμου της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) και γ) στην in vitro πιθανή αντιχολινεστερασική και αντιαμυλοειδική δράση του υδατικού εκχυλίσματος του φυτού. Το φυτικό αφέψημα σε συγκέντρωση 4% w/v χορηγoόταν καθημερινά σε αρσενικούς Balb-c μύες για περίοδο 40 ημερών. Για την εκτίμηση του άγχους/φόβου χρησιμοποιήθηκε α) η δοκιμασία του Υπερυψωμένου Λαβυρίνθου (χρόνος παραμονής των μυών στους ανοιχτούς βραχίονες ως προς το συνολικό χρόνο παραμονής στους ανοιχτούς και κλειστούς βραχίονες της συσκευής) και β) η δοκιμασία του Θιγμοτακτισμού (τάση παραμονής των μυών πλησίον των τοιχωμάτων του ειδικού κλωβού). Η μνήμη-μάθηση μελετήθηκε με τη δοκιμασία της Παθητικής Αποφυγής η οποία βασίζεται στην παρατήρηση ότι τα πειραματόζωα θα θυμούνται ότι μια συγκεκριμένη αντίδρασή τους θα έχει αρνητικές συνέπειες (εφαρμογή επώδυνου ηλεκτρικού ερεθίσματος στα άκρα). Οι οξειδωτικές/αντιοξειδωτικές ιδιότητες του φυτικού αφεψήματος προσδιορίστηκαν με εκτίμηση α) της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού δείκτη της ανηγμένης γλουταθειόνης, η οποία στηρίζεται στο σχηματισμό ενός φθορίζοντος συμπλόκου μετά την αντίδραση της ο-φθαλαλδεϋδης με τη γλουταθειόνη και υστιδύλ-ενώσεις και β) τα επίπεδα λιπιδικής υπεροξείδωσης μέσω προσδιορισμού των επιπέδων του οξειδωτικού δείκτη της μηλονικής διαλδεΰδης που στηρίζεται στο σχηματισμό του φθορίζοντος συμπλόκου που δημιουργείται όταν η μηλονική αλδεΰδη αντιδρά με το θειοβαρβιτουρικό οξύ. Η ενεργότητα του ενζύμου της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) τόσο ex vivo όσο και in vitro προσδιορίστηκε με τη χρήση της χρωματομετρικής μεθόδου του Ellman, όπου ως υπόστρωμα του ενζύμου χρησιμοποιήθηκε η ιωδιούχος ακετυλοθειοχολίνη. Κατά τον προσδιορισμό της ενεργότητας του ενζύμου in vitro ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η γαλανταμίνη, ένας ισχυρός αναστολέας του ενζύμου. Η πιθανή αντιαμυλοειδκή δράση του φυτικού εκχυλίσματος μελετήθηκε με τη μέθοδο της θειοφλαβίνης-Τ. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας του Υπερυψωμένου Λαβύρινθου έδειξαν ότι ο χρόνος παραμονής στους ανοιχτούς βραχίονες ως προς το συνολικό χρόνο παραμονής στους ανοιχτούς και κλειστούς βραχίονες της συσκευής είναι στατιστικώς σημαντικά αυξημένος για την ομάδα των ζώων που κατανάλωσαν το φυτικό αφέψημα σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Από τη δοκιμασία του Θιγμοτακτισμού για την πειραματική ομάδα φάνηκε ότι ο χρόνος θιγμοτακτισμού μειώνεται και ο αριθμός των εισόδων στην κεντρική περιοχή του ανοιχτού πεδίου αυξάνεται για κάθε 5 λεπτά παραμονής (εκ του συνολικού διαστήματος των 30 λεπτών) στη συσκευή εν συγκρίσει με την ομάδα των μαρτύρων. Τέλος, κατά τη δοκιμασία της Παθητικής Αποφυγής ο αρχικός και τελικός λανθάνων χρόνος (IL, STL αντίστοιχα) φάνηκε να μη διαφέρουν μεταξύ των δυο ομάδων πειραματοζώων. Η πόση του φυτικού αφεψήματος επηρέασε με ιστοειδικό τρόπο τις υπό μελέτη βιοχημικές παραμέτρους, καθώς παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων της ανηγμένης γλουταθειόνης και μείωση της υπεροξείδωσης λιπιδίων στον ολικό εγκέφαλο (-παρ/δας) των ενηλίκων μυών, η οποία συνοδευόταν από αλλαγές στις επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές της παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκεφάλου ενώ ο εγκεφαλικός φλοιός ακολούθησε το πρότυπο του ήπατος και έδειξε να μην επηρεάζεται. Σε σχέση με την ενεργότητα των δυο ισομορφών του ενζύμου της AChE παρατηρήθηκε αναστολή στον ολικό εγκέφαλο (-παρ/δας) της πειραματικής ομάδας συγκρινόμενη με τους μάρτυρες, η οποία συνοδεύτηκε από μείωση στις επιμέρους περιοχές του εγκεφαλικού φλοιού, του ραβδωτού και του ιπποκάμπου. Το υδατικό εκχύλισμα του Sideritis clandestina subsp. clandestina παρουσίασε: 10% αντιχολινεστερασική δράση in vitro σε αντίθεση με τον αναστολέα της γαλανταμίνης ο οποίος ανέστειλλε το ένζυμο σε ποσοστό 85%. Τέλος, το φυτικό εκχυλίσματος σε συγκέντρωση 0,3mg/mL ανέστειλε τη συσσωμάτωση του Αβ πεπτιδίου σε ποσοστό περίπου 85%. Με βάση τα ανωτέρω το «τσάι του βουνού» επιδεικνύει τάση για αγχόλυση, ενισχύει την αντιοξειδωτική άμυνα, έχει αντιχολινεστερασικές ιδιότητες και επιφέρει ανασταλτικό αποτέλεσμα στη συσσωμάτωση του Αβ αμυλοειδούς. Οι δράσεις του αυτές οφείλονται πιθανόν στην πολυφαινολική του σύσταση και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης. / “Mountain tea” (various species of Sideritis) has been traditionally consumed in Greece as a calmative and against common cold and allergies. The aim of the present study was to examine the neuroprotective role of the above plant and focus on: a) the effect of tea drinking in behavioral parameters of adult mice (fear/anxiety, learning and memory), b) the effect of tea drinking in antioxidative biochemical parameters of adult mice brain and liver, i.e. the concentration of reduced glutathione (GSH), the levels of lipid peroxidation and the activity of the two acetylcholinesterase (AChE) isoforms, and c) in vitro putative anticholinesterase and antiamyloid actions of Sideritis clandestina subsp. clandestina infusion. The beverage was provided (4g/100 mL, daily) for 40 days to adult male Balb-c/jice. Fear/anxiety was assessed by the measurement of i) the percentage of time spent in the open arms of the elevated plus maze apparatus and ii) the thigmotactic response (the tendency to remain close to vertical surfaces) of adult mice in an open-field. Learning and memory was assessed using the step-through passive avoidance task which is based on the obseravation that the experimental mice remember that a specific reaction has negative effects (electric foot shock). The oxidant/antioxidant properties of tea drinking was determined via measurement of a) the concentration of GSH (antioxidant marker), which is based on the formation of a fluorescent complex after the reaction of o-pthalaldehyde with glutathione and hystidyl compounds and b) the levels of malondialdehyde (MDA) (oxidant marker) by monitoring thiobarbituric acid reactive substance formation. The ex vivo and in vitro AChE activity was measured using the colorimetric method of Ellman where acetylthiocholine iodide was used as a substrate. Galantamine, a strong inhibitor of AChE, was used as a standard during in vitro determination of the enzyme activity. The effect of the infusion on amyloid-beta aggregation was studied in vitro with a thioflavine T - based fluorescence assay. Tea drinking caused statistically significant a) increase of the time percentage that animals spent into the open arms of the elevated plus maze apparatus and b) decrease of thigmotaxis time and increase of the time that animals entered to the central area of open field. Initial and Step-Through Latency showed no significant difference between two animal groups. The beverage also affected the biochemical parameters examined in the present study, in a tissue specific manner. More specifically, adult mice whole brain (-Ce) displayed increased reduced glutathione content and decreased lipid peroxidation levels compared to the controls. Similar changes were also observed in cerebellum and midbrain while cerebral cortex and liver were not affected. Regarding the activity of the two AChE isoforms, tea intake caused significant inhibition of these enzymes’ activity in whole brain (-Ce), compared with the control group. In agreement, cerebral cortex, striatum and hippocampus dispayed similar inhibition in both AChE isoforms activity after tea consuming. Sideritis clandestina subsp. clandestina infusion exhibited 10% in vitro anticholinesterase activity while galantamine inhibited the enzyme in a percentage of 85%. Moreover, tea infusion in a concentration of 0,3 mg/mL exhibited 85% inhibition of Ab1-40 fibrillogenesis in vitro, indicating, thus, strongly a putative antiamyloid action of Sideritis clandestina subsp. clandestinα. Conclusively, our results suggest that mountain tea infusion exhibits anxiolytic-like action, antioxidant and anticholintesterase properties and a strong, in vitro, inhibitory effect on amyloid-beta’s aggregation. These activities are most probably due to the polyphenols contained in Sideritis clandestina subsp. clandestina infusion; the underlying mechanisms need, though, further, in deep investigation.

Πολλοί περιβαλλοντικοί παράγοντες μελετώνται εδώ και δεκαετίες για τις επιπτώσεις τους στο νευρικό σύστημα. Περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως ο μόλυβδος (Pb) έχει δειχθεί ότι εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία ασθενειών όπως η νόσος Alzheimer προκαλώντας νευροεκφύλιση σε ενήλικους αλλά και αναπτυσσόμενους οργανισμούς. Το περιβάλλον όμως είναι επιπλέον πλούσιο σε προστατευτικούς παράγοντες όπως τα εκχυλίσματα διαφόρων φυτών της ελληνικής επικράτειας τα οποία μάλιστα αποτελούν και σημαντική πηγή εσόδων σε περιπτώσεις όπως του κρόκου της Κοζάνης. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της πόσης μολύβδου (500ppm) για 14 και 28 ημέρες, η πόση αφεψήματος του φυτού Crocus sativous για 28 ημέρες και η χορήγησή τους σε σειρά για 14 και 14 μέρες αντίστοιχα, από ενήλικους αρσενικούς μύες. Συγκεκριμένα διερευνήθηκαν οι συμπεριφορικές καταστάσεις άγχος/φόβος και τάση για κατάθλιψη καθώς και οι βιοχημικοί δείκτες ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράση (AChE), συγκέντρωση της γλουταθειόνης (GSH) και υπεροξείδοση των λιπιδίων μέσω της συγκέντρωσης της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA). Αναλυτικά, οι συμπεριφορικές καταστάσεις άγχος φόβος μελετήθηκαν με τη χρήση των δοκιμασιών του υπερυψωμένου λαβυρίνθου και του θιγμοτακτισμού και η επαγωγή καταθλιπτικής τάσης με τη χρήση της δοκιμασίας της εξαναγκασμένης κολύμβησης. Η ενεργότητα του ενζύμου AChE μετρήθηκε με τη χρήση της χρωματομετρικής μεθόδου του Ellman σε διαλυτό σε άλας κλάσμα (SS) [περιέχει κυρίως την G1 ισομορφή του ενζύμου] και διαλυτό σε απορρυπαντικό κλάσμα (DS) [περιέχει κυρίως την G4 ισομορφή του ενζύμου] του ιστού. Η συγκέντρωση της γλουταθειόνης προσδιορίστικέ με τη φθορισμομετρική μέθοδο των Mokrasch LC. & Teschke EJ. (1984), η οποία βασίζεται στο σχηματισμό φθορίζοντος συμπλόκου μετά την αντίδραση της ο- φθαλαλδεΰδης με την γλουταθειόνη και ιστιδυλ- ενώσεις. Τέλος η υπεροξείδωση των λιπιδίων μελετήθηκε μέσω της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA), η οποία αποτελεί το κύριο προϊόν της υπεροξείδωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Ο προσδιορισμός της έγινε φθορισμομετρικά λόγω του συμπλόκου που δημιουργείται όταν η ίδια αντιδρά με το θειοβαρβιτουρικό οξύ. Οι παραπάνω μελέτες έγιναν στους ιστούς φλοιός, παρεγκεφαλίδα, μεσεγκέφαλος, ιππόκαμπος, ραβδωτό και ήπαρ ενήλικων αρσενικών μυών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το βάρος των πειραματοζώων δεν επηρεάζεται κατά τη διάρκεια του χειρισμού, η πόση του Pb για 28 και 14 ημέρες προκάλεσε αγχογενή συμπεριφορά και επαγωγή του φόβου στα πειραματόζωα καθώς και επαγωγή καταθλιπτικής τάσης. Η χορήγηση του κρόκου στους μύες μάρτυρες σχετίζεται με αγχολυτική δράση αλλά όχι με αντικαταθλιπτική δράση. Αντικαταθλιπτική του δράση παρατηρείται μόνο στην περίπτωση που ακολούθησε τη χορήγηση του μολύβδου για 14 ημέρες. Επίσης η χορήγηση Pb προκάλεσε αναστολή της ενερότητας και των δύο ισομορφών του ενζύμου με ιστοειδικό τρόπο, η πόση του αφεψήματος του φυτού οδήγησε σε θετική δράση σε σχέση με την ενεργότητά του τόσο όταν χορηγήθηκε μόνο του όσο και κατά τη χορήγηση του μετά από το Pb (με ιστοειδικό τρόπο δράσης). Αξίζει να σημειωθεί ότι η δράση του μολύβδου μπορεί να είναι άμεση προκαλώντας νευροεκφύλιση είτε έμμεση επεμβαίνοντας σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια που επειρεάζουν την ενεργότητα του ενζύμου. Αναφορικά με τη συγκέντρωση της γλουταθειόνης ο μόλυβδος όταν χορηγήθηκε έδρασε ιστοειδικά, προκαλώντας μείωση της ενεργότητας του ενζύμου ενώ δεν παρατηρήθηκε δράση του φυτικού αφεψήματος επι του ενζύμου. Τέλος η υπεροξείδωση των λιπιδίων αυξήθηκε ιστοειδικά από την χορήγηση του Pb ενώ αντίθετα περιορίστηκε από την πόση του αφεψήματος με επίσης ιστοειδικό τρόπο. Συνοψίζοντας, στην παρούσα εργασία παρατηρήθηκε αρνητική δράση του μολύβδου σε συμπεριφορικό και βιοχημικό επίπεδο, θετική δράση του κρόκου στις παραπάνω διεργασίες καθώς επίσης θετική δράση κατά περίπτωση και της σε σειρά χορήγησης του αφεψήματος κρόκου μετά από χορήγηση μολύβδου. / Various environmental factors have been studied decades ago due to their effects on nervous system. It has been shown that lead (Pb) is implicated in the pathophysiology of diseases such as Alzheimer’s disease, resulting in neurodegeneration in adult and developing organisms. Also, the environment is rich in protective agents, such as various plant extracts of the Greek flora (e.g. Greek saffron which is cultivated at Kozani region in northern Greece) that present simultaneous financial interest. Aim of the present study was to investigate the effects of oral administration of lead (500ppm) for 14 and 28 days, Crocus sativous infusion for 28 days and lead (for 14 days) plus Crocus sativous infusion (for 14 days), in adult male mice. Briefly, behavioral parameters of anxiety/fear and depression-like and acetylcholinesterase (AChE) activity, glutathione (GSH) and lipid peroxidation (malondialdehyde, MDA) levels, were evaluated. In detail, anxiety/fear and depression-like behavior were assessed by using the elevated plus maze and thigmotaxis tests and forced swimming test, respectively. AChE activity was determined in salt soluble (SS) [contains mainly G1 isoform of the enzyme] and detergent soluble (DS) [contains mainly the G4 isoform of the enzyme] fractions of tissue homogenates, by Ellman’s colorimetric method. Glutathione content was measured fluorometrically according to the procedure of Mokrasch LC. & Teschke EJ. (1984), which is based on the formation of a fluorescent complex after reaction with o-phthalaldehyde and histidyl compounds. Also, lipid peroxidation levels were determined fluorometrically by measuring malondialdehyde (MDA) concentration after its reaction with thiobarbituric acid, as MDA is the main product of polyunsaturated fatty acid peroxidation. The biochemical assessments were performed in cortex, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum and liver of adult male mice. Our results showed that there were no effects on mouse body weight during the experimental period and Pb intake for 28 and 14 days induced anxiety/fear and depression-like behavior. Saffron administration to control mice is associated with anxiolytic but not antidepressant efficacy. Antidepressant effects of saffron were observed only in mice pre-treated with lead for 14 days. Also, Pb intake caused inhibition of both AChE isoforms’ activity and saffron infusion that was administered either alone or under Pb toxicity, beneficially affected enzyme activity, in a tissue-specific way. It should be noticed that lead may act directly, inducing neurodegeneration or indirectly, interfering with various metabolic pathways that influences AChE activity. Moreover, Pb intake reduced glutathione content in a tissue-specific way, while no effect was observed after saffron administration. Finally, lipid peroxidation levels were increased and decreased tissue specifically, after Pb and saffron administration, respectively. Conclusively, the current study presents adverse effects of lead on behavioral and biochemical parameters and beneficial effects of saffron infusion when it was administered either alone or under Pb toxicity.