In vitro embryo production (IVP) has been successfully used for infertility treatment, farm animal breeding and preservation of endangered species. Embryo culture media and its composition play an important role in the developmental competency of in vitro produced embryos. To optimize IVP it is important to understand the physiology of the in vivo embryo medium. Previously, we confirmed the presence of thyroid hormones (THs) in the bovine reproductive tract and their beneficial effect on embryo quality in vitro. The aim of this study was to further investigate the developmental effect and mechanisms behind THs function in bovine early embryos by supplementing IVP media with 50ng/ml T3 and T4. In vitro embryo culture (IVC) media fortification with THs significantly improved blastocyst and hatching rates, which was observed in both fast and slow cleaving embryos. THs treatment significantly skewed male/female ratio toward femaleness (43% vs. 57%). Only %60 of supplemented THs was bioavailable in the IVC media. Gene microarray and blastocyst genes expression profile analysis showed that THs supplementation altered mRNA expression profile in blastocysts. 1,234 genes were expressed differentially in the treated embryos and these differences were statistically significant (>1.5 fold at p < 0.05); these findings were confirmed by qPCR. TH-related genes, including THs receptor (TRs) mRNA and deiodinases (DIOs), were expressed in the gene array data of both treated and control groups. TR mRNA was expressed in all stages of early embryo development (EED) and the expression was not inducible by THs. This finding was consistent in both gene array and qPCR. Suppression of embryo gene transcription by α-amanitin resulted in a significantly higher level of TR mRNA from 2-cell to 16-cell treated and control embryos. TR protein was expressed in both treated and control blastocysts but, differentially located and distributed in response to THs in the blastocysts. This study highlights the importance of THs in EED and therefore the need to include these factors in culture media. Furthermore, this study has better characterized THs effects and identified possible regulatory roles of these hormones in EED. Further investigation into embryo competency and pregnancy outcome can provide more details. / Canada Research Chair(CRC), EmbryoGene, Ontario Graduate Scholarship(OGS) and Agriculture and Agrifood Canada.

Des signes d'apoptose, une forme de suicide cellulaire programmé, ont été décrits dans les gamètes et l'embryon préimplantatoire de nombreuses espèces de mammifères y compris l'homme, à la fois in vitro et in vivo. Parce que le développement embryonnaire serait lié à un équilibre entre prolifération et mort cellulaire, l'étude du contrôle génétique de l'apoptose dans les embryons préimplantatoires est d'une importance considérable. Par ailleurs, on sait que la qualité des gamètes (en particulier des ovocytes) influencerait leur propre survie mais également le développement embryonnaire précoce. Les régulateurs d'apoptose appartenant à la famille Bcl-2 occupent une place centrale dans les voies de décision de vie ou de mort cellulaire. Dans le premier volet de ce travail de thèse, nous avons analysé l'expression des membres de la famille Bcl-2 lors de la transition ovocyte-embryon au troisième jour (J3) et montré que les trois sous-groupes de la famille Bcl-2 présentent un profil d'expression dynamique tout au long du développement embryonnaire précoce humain. La régulation des niveaux d'expression de ces gènes au cours du développement embryonnaire précoce pourrait donc s'avérer cruciale pour le contrôle de la survie embryonnaire, notamment sous des conditions de culture suboptimales. Dans le second volet, nous nous sommes intéressés à l'analyse du transcriptome au cours du développement embryonnaire précoce humain, et plus particulièrement lors de la spécification du trophectoderme. La confrontation du transcriptome des embryons à J3 avec celui des cellules du trophectoderme nous a permis de mettre en évidence des processus moléculaires qui pourraient jouer un rôle important lors de la différenciation du TE, tels que la stéroïdogenèse et les régulations épigénétiques. En plus de son intérêt fondamental, la connaissance de l'expression génique et des mécanismes moléculaires régulant des processus clés tels que l'apoptose et la différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire préimplantatoire peut permettre d'ouvrir des pistes de recherche diagnostique et thérapeutique intéressantes. / Apoptosis, a form of cell death by self-destruction, has been reported in gametes and preimplantation embryos both in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that cell death processes can impact embryo developmental competence. Moreover, quality of the gametes (particularly of the oocytes) is relevant not only for their own survival but can also influence embryonic development during the early cleavage stages. Thus, the investigation of apoptosis-related genes and mechanisms in early embryos is crucial. Bcl-2 family proteins, through balanced interactions between pro- and anti-apoptotic members, play a pivotal role in controlling cell life and death. In a first part, we analyzed the expression patterns of Bcl-2 family members during the human oocytes-to-day 3 embryo transition and showed that several members were differentially regulated. The regulation of the expression levels of anti- and pro-apoptotic Bcl-2 family members during early embryonic development may therefore be crucial for the control of early embryo survival, especially under suboptimal culture conditions. In a second part, we were interested in studying the transcriptome during human early embryonic development, and particularly during the trophectoderm specification. The comparison of the transcriptome of embryos on day 3 with that of trophectoderm cells allowed us to identify new molecular processes that could play an important role during trophectoderm differentiation and development, such as steroidogenesis and epigenetic regulations. In addition to its fundamental interest, a better knowledge of gene expression and molecular mechanisms regulating key processes such as apoptosis and cell differentiation during human early embryonic development may provide new guides for diagnosis and therapeutic strategies.

Η ανάπτυξη του εμβρύου καθορίζεται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων και εξωκυττάριας ύλης. Στην εξωκυττάρια ύλη περιέχονται πρωτεογλυκάνες, εκ των οποίων οι perlecan και aggrecan είναι από τις πρώτες που εκφράζονται στο πρώιμο έμβρυο. Μελετήσαμε τη χωρο-χρονική κατανομή των perlecan και aggrecan με RT-PCR, ανοσοφθορισμό και ανοσοκατακρήμνιση από το στάδιο Χ (μορίδιο) έως το στάδιο ΗΗ17 (29-32 σωμίτες) στο πρώιμο έμβρυο όρνιθας. Επιπρόσθετα, μελετήσαμε το ρόλο των perlecan και aggrecan με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου.Η perlecan πρωτο-ανιχνεύτηκε στο στάδιο του μοριδίου (στάδιο Χ) μόλις πριν τη συναρμολόγηση της πρώτης βασικής μεμβράνης που σχηματίζεται στο πρώιμο έμβρυο. Το πρότυπο κατανομής των μορίων αυτών σε διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Η perlecan πρωτο-ανιχνεύτηκε στο στάδιο του μοριδίου (στάδιο Χ) μόλις πριν τη συναρμολόγηση της πρώτης βασικής μεμβράνης που σχηματίζεται στο πρώιμο έμβρυο. Εξαιρετικά μεγάλη ένταση φθορισμού για την perlecan επέδειξαν οι βασικές μεμβράνες/ εξωκυττάρια ύλη του νευροεπιθηλίου και μεσεγχυματικών ιστών κατά την επιθηλιοποιησή τους και επίσης τα κύτταρα κατά τη γαστριδίωση και τα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων. Όταν αναστείλαμε τη δράσης της με ειδικά αντισώματα έναντι αυτής παρατηρήσαμε φθορά των βασικών μεμβρανών.Ο ρόλος της perlecan φαίνεται να είναι σημαντικός στη δόμηση βασικών μεμβρανών, στην επιθηλιοποίηση ιστών και στη διαθεσιμότητα αυξητικών παραγόντων. Ανιχνεύσαμε την aggrecan για πρώτη φορά στο στάδιο του βλαστιδίου (στάδιο ΧΙΙΙ) και η παρουσία της φαίνεται να είναι καθοριστικής σημασίας στη δημιουργία του βλαστόκοιλου, της πρώτης εμβρυϊκής κοιλότητας στο στάδιο αυτό. Ένταση φθορισμού για την aggrecan στην αναπτυσσόμενης καρδιάς καθώς και στα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων που μεταaναστεύουν. Η αναστολή της δράσης της aggrecan προκάλεσε ανωμαλίες στην αρχιτεκτονική των ιστών και τη φυσιολογική μορφογένεση του εγκεφάλου, της καρδιάς, της ραχιαίας αορτής και της νωτοχορδής. Ο ρόλος της aggrecan σε συνεργισμό με την συνδετική πρωτεΐνη και το υαλουρονικό οξύ φαίνεται να είναι σημαντικός στη δημιουργία και τη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των εμβρυϊκών κοιλοτήτων και στη δημιουργία διόδων για την μετανάστευση κυττάρων και την οργανογένεση. / The development of the embryo is determined by specific interactions between cells and components of the extracellular matrix. The extracellular matrix of the embryo is exuberantly rich in proteoglycans, the primary and earliest expressed ones being perlecan and aggrecan. We studied the spatio-temporal distribution of perlecan and aggrecan by RT-PCR, immunofluore-scence and immunoprecipitation in the early chick embryo from the blastoderm at stage X (morula) to stage HH17 (29-32 somites). In addition, we studied the functional importance of perlecan and aggrecan in the early chick embryo by using blocking antibodies. The distribution pattern of these molecules in different cell populations was developmentally regurated. Perlecan was first detectable at the morula stage just before the assembly of the first basement membrane. Perlecan fluorescence was intense in the basement membranes/ extracellular matrix of the neuroepithelium and mesenchematic tissues during their epithelialization and also in migrating cells at gastrula stage and in the neural crest cells. Lack of functional perlecan caused damaged basement membranes. The role of perlecan seemw to be important in the formation of basement membrane, in the epithelialization of tissues and in availability of growth factors.Aggrecan was first detectable at the blastula stage (stage XIII) and its presence may be important for the formation of blastocoel, the first embryonic cavity at this stage. In the developing heart, aggrecan fluorescence was intense and also in the migrating neural crest cells.Lack of functional aggrecan interfered with tissue architecture during normal morphogenesis of the brain, notochord, heart tube and dorsal aorta. The role of aggrecan in concert with link protein and hyaluronic acid is fundamental for the formation and maintenance of embryonic cavities and for determination of passages during migration of cells and organogenesis.

Depuis quelques années, une biopsie testiculaire suivie d’une congélation du tissu testiculaire est proposée aux enfants atteints de cancer avant introduction d’un traitement gonadotoxique. Cette procédure de préservation de la fertilité est proposée avec l’espoir qu’une méthode de restauration de la fertilité soit développée. Le tissu testiculaire décongelé pourrait ainsi être utilisé afin d’effectuer une maturation in vitro, évitant la réintroduction de cellules tumorales, pour produire des spermatozoïdes. Ce travail de thèse a consisté, dans un premier temps, à évaluer la mise en place de la méthylation de l’ADN au sein du tissu testiculaire prépubère de souris au cours de la spermatogenèse in vitro. La culture de tissu testiculaire frais ou décongelé de souris prépubère permet le maintien des niveaux d’expression des ADN méthyltransférases 1 et 3a dans les spermatogonies et les spermatocytes. De plus, la méthylation de l’ADN est retrouvée jusque dans les spermatozoïdes produits in vitro. Par la suite, la qualité nucléaire des spermatozoïdes ainsi obtenus a été analysée. La culture de tissu testiculaire n’a pas d’impact sur le taux d’aneuploïdie, la condensation de la chromatine et la fragmentation de l’ADN spermatique. Cependant, la congélation suivie par la culture organotypique augmente la proportion de spermatozoïdes avec un ADN oxydé. Enfin, la fonctionnalité des spermatozoïdes produits in vitro a été analysée par micro-injection ovocytaire et la dynamique de différentes marques épigénétiques a été étudiée au cours du développement préimplantatoire. Les taux de développement embryonnaire sont diminués par l’utilisation de spermatozoïdes produits in vitro. Les niveaux des histones H3K4me3, H3K27me3 et H3K9ac sont peu modifiés dans les embryons issus de spermatozoïdes générés in vitro alors que la méthylation et déméthylation de l’ADN sont plus impactées. La production de spermatozoïdes après culture de tissu prépubère frais ou décongelé dans le modèle murin a permis de mettre en évidence que cette procédure n’est pas sans impact sur l’embryon précoce bien que la qualité des spermatozoïdes produits soit peu altérée. / In recent years, testicular biopsy followed by the freezing of testicular tissue has been proposed to children with cancer before the introduction of a gonadotoxic treatment. This fertility preservation procedure is offered with the hope that a fertility restoration method will be developed. The thawed testicular tissue could thus be used to perform in vitro maturation, avoiding the reintroduction of tumor cells, to produce spermatozoa. This thesis work first consisted in assessing the establishment of DNA methylation in mouse prepubertal testicular tissue during in vitro spermatogenesis. The culture of fresh or thawed mouse testicular testicular tissue allows the expression levels of DNA methyltransferases 1 and 3a to be maintained in spermatogonia and spermatocytes. In addition, DNA methylation is found even in in vitro produced spermatozoa. The nuclear quality of these spermatozoa was then analyzed. The culture of testicular tissue has no impact on sperm aneuploidy rate, chromatin condensation and DNA fragmentation. However, freezing followed by organotypic culture increases the proportion of spermatozoa with oxidized DNA. Finally, the functionality of in vitro produced spermatozoa was analyzed by oocyte microinjection and the dynamics of different epigenetic marks was studied during preimplantation development. Embryo developmental rates are decreased when using in vitro produced spermatozoa. The levels of H3K4me3, H3K27me3 and H3K9ac are slightly modified in embryos derived from spermatozoa generated in vitro whereas DNA methylation and demethylation are more affected. The production of spermatozoa after culture of fresh or thawed prepubertal tissue in the mouse model has shown that this procedure is not without impact on the early embryo, although the quality of the spermatozoa produced is relatively unaltered.

传统大陆法系民法体系下，「物」与「人」乃二元对立之概念。随着人类观念的发展及科学技术的进步，民法上的「物」和「人」的也在不断发展变化之中，在近几十年来，生殖科技逐渐兴起并不断发展，随之出现了可以于体外存活的冷冻早期人类胚胎，其属性应当是民法上的「物」还是「人」引发了很多法律上的争论。而在中国大陆由于人工生殖法律并未完善，也因此出现了早期胚胎处置权不明等一系列与早期胚胎相关的问题。而这些问题的本质是，早期胚胎是人还是物？ 本文通过对比两岸法律中关于胎兒以及早期胚胎相关的规定，分析在相同的文化背景下的两岸法律中，早期胚胎是一个怎样的地位。并结合外国法律提出早期胚胎在中国大陆应当受到怎样的对待。本文的主要内容包括: 一、早期胚胎的生物学属性以及传统法律中关于人和物的规定，提出早期胚胎为何在法律中会是一个尬尴的存在。 二、两岸法律下有关早期胚胎以及胎兒的规定，两岸学者对早期胚胎地位的看法。提出本文对于早期胚胎法律地位的看法。 三、早期胚胎处置权在大陆的处理模式。 四、国外对早期胚胎相关问题的规定，主要介绍相对开放的英国、相对保守的德国以及摇摆不定的美国。 五、提出早期胚胎相关问题的立法建议。 / Under the traditional system of civil law, "property" and "person" are concepts of binary oppositions. With the progress of the human mind and the development of science and technology, the meaning of "property" and "person" in the civil law is constantly evolving and changing. In recent decades, the reproductive technology growed up and continued to develop. Because of the appearance of IVF，frozen human early-embryos can survive out of human body. There is a question. Are these human embryos “property” or “person”. In mainland China, the legislation of reproductive technology is imperfect. Because of this, a series of issue on early-embryos are showing up. The nature of these problems is whether the early-embryo is a person or property. This paper compares the provisions on fetal and early-embryo of Taiwan and P.R.China,finding the status of early-embryo in the same culture.The main contents include: 1、Biological properties of early-embryo and provision of property and person in traditional common law.The reason why is early-embryo an awkward Existence in traditional law. 2、 Provision of fetal and early-embyro.The points of scholars in Taiwan and P.R.China on the status of early-embyo. 3、The right to dispose early-embryos in P.R.China. 4、The foreign provisions on early-embryo including England,German and America. 5、 Legislative proposals related to the issue of early embryos.

Οι εξωκυττάριες ουσίες παράγονται από τα κύτταρα, εκκρίνονται από αυτά και αλληλεπιδρώντας τόσο μεταξύ τους όσο και με τα κύτταρα ρυθμίζουν πολλές αναπτυξιακές πορείες. Μελετήσαμε τη χρονική και τοπική εμφάνιση των mRNAs της εντακτίνης και της λαμινίνης, γλυκοπρωτεϊνών των εξωκυττάριων ουσιών, στο πρώϊμο έμβρυο όρνιθας. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνική της in situ υβριδοποίησης, που κατέδειξε διαφορική έκφραση της εντακτίνης και των αλυσίδων της λαμινίνης σε ξεχωριστούς κυτταρικούς πληθυσμούς και όργανα σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου. Επίσης μελετήσαμε την χρονική και τοπική κατανομή του πολυπεπτι- δίου της εντακτίνης από το στάδιο του μοριδίου ως την αρχή της οργανογένεσης με τις τεχνικές του ανοσοφθορισμού και της ανοσοκατακρήμνισης. Ανιχνεύσαμε την παρουσία της εντα-κτίνης ήδη από το στάδιο του όψιμου μοριδίου. Με τη χρήση αντισωμάτων για την εντακτίνη μελετήσαμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη του πρώϊμου εμβρύου. Στα αποτελέσματά μας φάνη-κε οτι η εντακτίνη είναι απαραίτητη για το σωστό προσανατο-λισμό των κυττάρων καθώς μεταναστεύουν κατά την γαστριδίω-ση. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή του σχηματισμού του εμβρυϊκού άξονα. / The extracelular matrix is a complex cell product which regulates many developmental processes. We used specific antisense RNA probes for the laminin α1, β1 and γ1 chains and for entactin, two extracellular matrix glycoproteins, to study the tissue specific and temporal patterns of their mRNAs in the early chick embryo. Our work employing in situ hybridization, showed strong signals of the laminin and of entactin mRNAs at the morula stage and differential express-ion of these mRNAs in the forming embryonic tissues and organs in the developing chick embryo. We also studied the time of appearance and subsequent distribution of the entactin polypeptide using immunofluorescence and immunopre-cipitation from the morula stage up to the early organogene-sis in the chick embryo. The first presence of entactin was detected at the late morula stage and showed differential expression in the various cell populations in the develop- ing embryo. To study the role of entactin in the major cell-ular migrations during gastrulation we used blocking anti- bodies in set of functional studies. Entactin seemed to be essential for the directional migrations of cells during gastulation and the embryonic axis was not formed in the embryos treated with the anti-entactin antibodies.

La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire. / Nature has developed strategies to ensure the beginning of life in conditions of homoplasmy, i.e. cells harboring the same mitochondrial DNA (mtDNA). However, novel mtDNA haplotypes can arise by many means during life, leading to heteroplasmy. For instance, mtDNA heteroplasmy can originate artificially through assisted reproductive technologies and naturally by the process of aging. Therefore, this doctoral thesis was divided into two general objectives: Firstly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) during development from embryos, to fetuses and adult tissues, in cattle. Secondly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy caused by aging in adult germinal and somatic tissues, during oogenesis and early embryogenesis, and in in vitro culture procedures in mice. In the first series of experiments in cattle, fetal fibroblasts carrying an mtDNA mutation (insertion of 66 bp) were fused to host oocytes carrying wild type mtDNA. The presence of mtDNA from the donor cell was analyzed in 30 SCNT clones at different stages of development: 17-day-old embryos (n=17); 40-day-old fetuses (n=3); 60-day-old fetuses (n=3); one 240 day-old fetus; and 3 post-natal clones (18-24 months). Every individual clone proved to be heteroplasmic and 99% (103/104) of the analyzed tissue samples were heteroplasmic as well. Only the ovary coming from a 240 day old fetus was homoplasmic for the mtDNA of the recipient oocyte. In most (95.2%) of the analyzed tissue samples (99/104) the mean of heteroplasmy was 1.46%. In contrast, one 40-day-old fetus presented high levels of heteroplasmy (20.9%) indicating rare events of donor mtDNA increases. Since most SCNT clones showed heteroplasmy at proportions comparable to the donor mtDNA at the moment of embryo reconstruction, we concluded that heteroplasmy produced by nuclear transfer techniques using somatic cells is due to the neutral segregation of the mtDNA. In the second series of experiments, performed in mice, females of different ages, i.e. young (0-8 months), middle (8-16 months) and old (16-24 months), were synchronized (gonadotropins) and sacrificed to obtain germinal vesicle oocytes, metaphase-II oocytes in vivo and in vitro. Also, 2-cell and blastocyst stage embryos were obtained from young females in vivo and in vitro. Somatic tissues from females of the three age periods were obtained: brain, granulosa, liver and muscle and the effect of aging was measured on fertility. The effects of aging, stage of development and in vitro culture on the heteroplasmy were measured in oocytes and embryos. Also, the effects of aging were measured in somatic and germinal tissues on total copies of mtDNA, percentage of mtDNA common deletion and the expression of three genes: Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. We observed that female fertility in the mouse colony decreases with age. Aging affected mtDNA in somatic tissues but no effect was observed in granulosa, oocytes and embryos. MtDNA deletions increased during the resumption of meiosis and decreased during early embryo development; and culture in vitro did not affect the mtDNA in most germinal tissues. Because we did not find effects of age in most mitochondrial parameters analyzed in oocytes and embryos, we suggest that mtDNA common deletion in germinal tissues is more related with the cellular status of energy production than with the process of aging. Two different sources of mutations in the mtDNA generated in normal or reconstructed oocytes produced different heteroplasmy outcomes at the beginning of embryogenesis. In cattle, artificial heteroplasmy involving a small insertion (66 bp) in the non coding region (D-loop) of the mitochondrial DNA was apparently not harmful to the embryo, allowing persistence of the foreign mtDNA during the different stages of clonal development. In mice, the natural heteroplasmy of a large deletion (4974 bp, common deletion) in the coding region of the mtDNA was apparently harmful to the embryo and, therefore, may have been eliminated to ensure homoplasmy at the beginning of embryonic development.

La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire. / Nature has developed strategies to ensure the beginning of life in conditions of homoplasmy, i.e. cells harboring the same mitochondrial DNA (mtDNA). However, novel mtDNA haplotypes can arise by many means during life, leading to heteroplasmy. For instance, mtDNA heteroplasmy can originate artificially through assisted reproductive technologies and naturally by the process of aging. Therefore, this doctoral thesis was divided into two general objectives: Firstly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) during development from embryos, to fetuses and adult tissues, in cattle. Secondly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy caused by aging in adult germinal and somatic tissues, during oogenesis and early embryogenesis, and in in vitro culture procedures in mice. In the first series of experiments in cattle, fetal fibroblasts carrying an mtDNA mutation (insertion of 66 bp) were fused to host oocytes carrying wild type mtDNA. The presence of mtDNA from the donor cell was analyzed in 30 SCNT clones at different stages of development: 17-day-old embryos (n=17); 40-day-old fetuses (n=3); 60-day-old fetuses (n=3); one 240 day-old fetus; and 3 post-natal clones (18-24 months). Every individual clone proved to be heteroplasmic and 99% (103/104) of the analyzed tissue samples were heteroplasmic as well. Only the ovary coming from a 240 day old fetus was homoplasmic for the mtDNA of the recipient oocyte. In most (95.2%) of the analyzed tissue samples (99/104) the mean of heteroplasmy was 1.46%. In contrast, one 40-day-old fetus presented high levels of heteroplasmy (20.9%) indicating rare events of donor mtDNA increases. Since most SCNT clones showed heteroplasmy at proportions comparable to the donor mtDNA at the moment of embryo reconstruction, we concluded that heteroplasmy produced by nuclear transfer techniques using somatic cells is due to the neutral segregation of the mtDNA. In the second series of experiments, performed in mice, females of different ages, i.e. young (0-8 months), middle (8-16 months) and old (16-24 months), were synchronized (gonadotropins) and sacrificed to obtain germinal vesicle oocytes, metaphase-II oocytes in vivo and in vitro. Also, 2-cell and blastocyst stage embryos were obtained from young females in vivo and in vitro. Somatic tissues from females of the three age periods were obtained: brain, granulosa, liver and muscle and the effect of aging was measured on fertility. The effects of aging, stage of development and in vitro culture on the heteroplasmy were measured in oocytes and embryos. Also, the effects of aging were measured in somatic and germinal tissues on total copies of mtDNA, percentage of mtDNA common deletion and the expression of three genes: Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. We observed that female fertility in the mouse colony decreases with age. Aging affected mtDNA in somatic tissues but no effect was observed in granulosa, oocytes and embryos. MtDNA deletions increased during the resumption of meiosis and decreased during early embryo development; and culture in vitro did not affect the mtDNA in most germinal tissues. Because we did not find effects of age in most mitochondrial parameters analyzed in oocytes and embryos, we suggest that mtDNA common deletion in germinal tissues is more related with the cellular status of energy production than with the process of aging. Two different sources of mutations in the mtDNA generated in normal or reconstructed oocytes produced different heteroplasmy outcomes at the beginning of embryogenesis. In cattle, artificial heteroplasmy involving a small insertion (66 bp) in the non coding region (D-loop) of the mitochondrial DNA was apparently not harmful to the embryo, allowing persistence of the foreign mtDNA during the different stages of clonal development. In mice, the natural heteroplasmy of a large deletion (4974 bp, common deletion) in the coding region of the mtDNA was apparently harmful to the embryo and, therefore, may have been eliminated to ensure homoplasmy at the beginning of embryonic development.