Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au cours de mon travail de doctorat, je me suis intéressé aux mécanismes qui contrôlent la séparation équitable du génome lors de la méiose dans l’ovocyte de souris.Le point de contrôle du fuseau contrôle la ségrégation des chromosomes en méiose : en cas d'attachement incorrect des chromosomes au fuseau, l'anaphase est retardée ce qui permet d'éviter les aneuploïdies. En métaphase, l’attachement des chromosomes homologues aux deux pôles opposés du fuseau, génère une force de tension au niveau des kinétochores. Mon travail de thèse a consisté à déterminer si la tension exercée sur les chromosomes est un signal qui permet de satisfaire le point du contrôle du fuseau en méiose I dans l'ovocyte de souris. Lorsque la tension exercée sur les chromosomes homologues par les microtubules est diminuée par un traitement pharmacologique, la dégradation de la sécurine, qui marque l’entrée en anaphase, est retardée. Si le point de contrôle du fuseau est inhibé en absence de tension, l’anaphase n’est pas retardée, ce qui indique que le point de contrôle du fuseau est sensible à la tension.Nous avons aussi montré que la kinase Aurora B/C n’est pas requise pour la réponse du point de contrôle du fuseau aux chromosomes non attachés, mais qu’elle est essentielle à la réponse du point de contrôle du fuseau à la baisse de tensionDans un contexte où les erreurs de ségrégation en méiose sont très fréquentes chez la femme et augmentent drastiquement avec l'âge, nos travaux pourraient permettre d'identifier si ces mécanismes de contrôle sont diminués et moins efficaces avec l'âge chez la femme. / At each cell division, chromosomes must be faithfully segregated so that exactly one set of chromosomes is passed on to the next generation. The spindle assembly checkpoint (SAC) ensures faithful chromosome segregation in meiosis: upon uncorrect attachment of the chromosome to the spindle, anaphase onset is delayed in order to avoid chromosome missegregation and aneuploidies. For my PhD thesis, I wanted to determine whether tension applied by the spindle microtubules on the chromosomes is itself a signal that satisfies the SAC in mouse oocyte meiosis I. When tension is decreased by small molecule inhibitors, securin degradation, which is a readout of anaphase onset, is delayed. If the SAC is inhibited, then tension defects cannot delay anaphase onset. This indicates that the SAC is able to delay anaphase onset upon tension defects.Furthermore, we showed that Aurora B/C kinase is not required for the SAC response to unattached chromosomes but that Aurora B/C is required for the SAC response to tension defects.Chromosome segregation errors are very common in women and increase with age. In that context, our work could help to identify whether these key control mechanisms are less efficient in the mammalian oocyte with age.

La biologie de l'ovocyte canin est très différente de celle des autres espèces mammifères : en particulier, la fin de la maturation ovocytaire dans le follicule se déroule en présence d'une forte concentration en progestérone (lutéinisation préovulatoire) et l'ovulation libère un ovocyte en prophase I, qui n'atteindra le stade métaphase II qu'au bout de 48 à 60 heures de transit oviductal. Parallèlement, les taux de maturation obtenus in vitro chez la chienne sont très faibles. Le but de ce travail était de fournir une description ultrastructurale de la maturation ovocytaire canine in vivo (avant le pic de LH jusqu'à 105 heures post ovulation) et d'y comparer l'évolution des ovocytes mis en maturation in vitro. In vivo, nos résultats en microscopie électronique à transmission montrent que l'ovocyte canin suit globalement le modèle de maturation ovocytaire des mammifères, à l'exception de l'existence d'une période de réactivation transcriptionnelle entre 24 et 48 heures post ovulation. Nous avons mis en évidence, grâce à une étude quantificative de l'incorporation de BrUTP, une activité transcriptionnelle très intense pendant cette période, activité à la fois nucléoplasmique et nucléolaire. Ni le pic de LH ni l'ovulation ne se révèlent suivis de modifications ultrastructurales importantes. Ils ne sont associés respectivement qu'à l'expansion et à la recompaction du cumulus. Les signaux de régulation de la méiose chez la chienne restent donc inconnus. In vitro, l'examen ultrastructural montre que les ovocytes issus d'ovaires d'anoestrus sont très immatures. La comparaison avec les formes observées in vivo indique que les ovocytes qui n'achèvent pas leur méiose in vitro (VG et métaphase I) sont simplement interrompus dans leur maturation et ne présentent pas de formes aberrantes. Quant aux ovocytes ayant atteint le stade métaphase II in vitro, ils montrent un très faible degré de maturation cytoplasmique.

La méiose chez les femelles est un processus de réduction du génome permettant la formation d'un gamète haploïde, l'ovocyte. Dans la plupart des espèces animales, l'ovogénèse est associée à une élimination des centrioles, composants des centrosomes, qui sont les centres organisateurs des microtubules (MTOCs) canoniques. En l'absence de centrioles, le fuseau méiotique est assemblé grâce à la large contribution des MTOCs. Cependant, leur origine, l'importance de leur organisation et de la régulation de leur activité sont peu comprises. J'ai démontré que les MTOCs sont déjà présents dans les ovocytes précurseurs et sont progressivement rassemblés sur l'enveloppe nucléaire chez les ovocytes compétents pour les divisions méiotique. A l'entrée en méiose, les MTOCs sont distribués autour des chromosomes qui se condensent de façon strictement régulée au cours du temps. La perturbation de l'organisation des MTOCs par une surexpression de la kinase Polo-like 4 (Plk4) altère l'activité de nucléation des microtubules à l'entrée en méiose. L'activité anormale de ces MTOCs conduit à la formation de fuseaux non fonctionnels et à l'arrêt méiotique. / Female meiosis is a fundamental process of genome reduction leading to formation of a haploid gamete, the oocyte. In most animal species, oogenesis is associated with elimination of centrioles, constituents of centrosomes, which are canonical Microtubule Organizing Centers (MTOCs). In the absence of centrioles, meiotic spindle is assembled with a large contribution of acentriolar MTOCs. However, their origins, importance of organization and regulation of activity are poorly understood. I have shown that MTOCs pre-exist in the oocyte precursors and that they are progressively gathered on the nuclear envelope as oocytes gain competency for meiotic divisions. At entry into meiosis, MTOCs are redistributed around the condensing chromosomes in a strictly regulated timely fashion. Perturbation of such MTOC organization by transgenic overexpression of Polo-like kinase 4 (Plk4) leads to altered MT-nucleating activity at meiotic entry. Such abnormally active MTOCs mediate the formation of large and non-functional spindles and meiotic arrest.

La méiose ovocytaire comprend une succession de deux divisions cellulaires, sans phase intermédiaire de réplication de l'ADN, permettant l'haploïdisation du gamète femelle en vue de la fusion des génomes parentaux lors de la fécondation. Le caractère fortement asymétrique de ces divisions permet l'expulsion du matériel génétique surnuméraire, dans de petits globules polaires, tout en conservant l'essentiel des ressources cytoplasmiques qui seront nécessaires au développement précoce de l'embryon. De nombreuses études réalisées sur l'ovocyte de souris ont mis en évidence les capacités intrinsèques du gamète à rompre sa symétrie en positionnant son fuseau de manière excentrée à proximité du cortex. En se positionnant de la sorte le fuseau induit, via un gradient de Ran-GTP porté par les chromosomes, une polarisation du cortex ovocytaire qui permettra de restreindre le site d'émission des futurs globules polaires. Cette polarisation se caractérise notamment par une forte accumulation de filaments d'actines dépendante du facteur de nucléation Arp2/3. Nos travaux nous ont permis de mettre en évidence le rôle de Cdc42-GTP, via l'activation de N-WASP, comme intermédiaire entre le gradient de Ran-GTP et la polymérisation polarisée des filaments d'actine. Nous nous sommes également intéressés à la localisation des protéines ERM (Ezrin Radixin Moesin), connues pour favoriser la formation des microvillosités membranaires. Dans l'ovocyte, les microvillosités et les ERM sont toutes deux exclues du cortex polarisé et nous avons pu démontrer le rôle de Ran-GTP dans ce processus. Enfin, nous avons étudié la localisation du réseau d'acto-myosine cortical lors de la deuxième division méiotique qui nécessite la rotation du fuseau de l'ovocyte de souris. Nos résultats révèlent l'existence de deux sous-populations de myosine 2 corticale, l'une dépendante de la chromatine (Ran-GTP/Cdc42-GTP) et l'autre dépendante du fuseau central (Ect2/RhoA). / Oocyte meiosis is accomplished through two successive rounds of cellular divisions, without DNA replication, allowing for gamete haploidization necessary for parental genome fusion after fertilization. These divisions are highly asymmetric and allow extra-DNA expulsion, in small polar bodies, while retaining most of the cytoplasmic resources needed for early embryo development. Studies in mouse oocyte have demonstrated the capabilities of the gamete to autonomously break his symmetry by positioning the spindle near the cortex. By doing so, the spindle is able to induce a cortical polarization that is dependent on a Ran-GTP gradient emanating from the chromosomes. This polarization will be necessary for delimiting extrusion sites of the future polar bodies. A polarized accumulation of Arp2/3 actin filaments is one of the most evident features of oocyte polarization. We have shown that polarization of Cdc42-GTP, trough N-WASP activation, is an essential intermediate between Ran-GTP and the polarized polymerization of actin filaments. We also investigated ERM (Ezrin Radixin Moesin) proteins localization that are known to promote microvilli assembly. According to our data, microvilli and ERM are excluded from the polarized cortex in a Ran-GTP dependent manner. Finally, we studied cortical acto-myosin dynamics during the second meiotic division which requires spindle rotation. We demonstrated the existence of two cortical myosin 2 sub-populations which depend either on chromosomes (Ran-GTP/Cdc42-GTP) or on the central spindle (Ect2/RhoA).

Des signes d'apoptose, une forme de suicide cellulaire programmé, ont été décrits dans les gamètes et l'embryon préimplantatoire de nombreuses espèces de mammifères y compris l'homme, à la fois in vitro et in vivo. Parce que le développement embryonnaire serait lié à un équilibre entre prolifération et mort cellulaire, l'étude du contrôle génétique de l'apoptose dans les embryons préimplantatoires est d'une importance considérable. Par ailleurs, on sait que la qualité des gamètes (en particulier des ovocytes) influencerait leur propre survie mais également le développement embryonnaire précoce. Les régulateurs d'apoptose appartenant à la famille Bcl-2 occupent une place centrale dans les voies de décision de vie ou de mort cellulaire. Dans le premier volet de ce travail de thèse, nous avons analysé l'expression des membres de la famille Bcl-2 lors de la transition ovocyte-embryon au troisième jour (J3) et montré que les trois sous-groupes de la famille Bcl-2 présentent un profil d'expression dynamique tout au long du développement embryonnaire précoce humain. La régulation des niveaux d'expression de ces gènes au cours du développement embryonnaire précoce pourrait donc s'avérer cruciale pour le contrôle de la survie embryonnaire, notamment sous des conditions de culture suboptimales. Dans le second volet, nous nous sommes intéressés à l'analyse du transcriptome au cours du développement embryonnaire précoce humain, et plus particulièrement lors de la spécification du trophectoderme. La confrontation du transcriptome des embryons à J3 avec celui des cellules du trophectoderme nous a permis de mettre en évidence des processus moléculaires qui pourraient jouer un rôle important lors de la différenciation du TE, tels que la stéroïdogenèse et les régulations épigénétiques. En plus de son intérêt fondamental, la connaissance de l'expression génique et des mécanismes moléculaires régulant des processus clés tels que l'apoptose et la différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire préimplantatoire peut permettre d'ouvrir des pistes de recherche diagnostique et thérapeutique intéressantes. / Apoptosis, a form of cell death by self-destruction, has been reported in gametes and preimplantation embryos both in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that cell death processes can impact embryo developmental competence. Moreover, quality of the gametes (particularly of the oocytes) is relevant not only for their own survival but can also influence embryonic development during the early cleavage stages. Thus, the investigation of apoptosis-related genes and mechanisms in early embryos is crucial. Bcl-2 family proteins, through balanced interactions between pro- and anti-apoptotic members, play a pivotal role in controlling cell life and death. In a first part, we analyzed the expression patterns of Bcl-2 family members during the human oocytes-to-day 3 embryo transition and showed that several members were differentially regulated. The regulation of the expression levels of anti- and pro-apoptotic Bcl-2 family members during early embryonic development may therefore be crucial for the control of early embryo survival, especially under suboptimal culture conditions. In a second part, we were interested in studying the transcriptome during human early embryonic development, and particularly during the trophectoderm specification. The comparison of the transcriptome of embryos on day 3 with that of trophectoderm cells allowed us to identify new molecular processes that could play an important role during trophectoderm differentiation and development, such as steroidogenesis and epigenetic regulations. In addition to its fundamental interest, a better knowledge of gene expression and molecular mechanisms regulating key processes such as apoptosis and cell differentiation during human early embryonic development may provide new guides for diagnosis and therapeutic strategies.

La reproduction sexuée repose sur deux processus fondamentaux : la méiose qui permet la formation des gamètes dont le génome est haploïde et la syngamie qui permet, après fécondation, de restaurer la diploïdie par fusion des deux noyaux parentaux haploïdes. Alors que la méiose repose respectivement sur le génome maternel pour l'ovocyte et paternel pour le spermatozoïde, la restauration de la diploïdie dans le zygote repose exclusivement sur le génome maternel. Si un pronucleus maternel compétent pour la réplication est formé au terme de la méiose ovocytaire, le génome paternel quant à lui, n'acquiert cette compétence que sous l'influence de facteurs maternels. En effet, à la fin de la méiose, le génome paternel est « empaqueté » avec des protamines qui le rendent inactif pour toute fonction biologique, en particulier la réplication. L'éviction des protamines et leur remplacement par des histones maternelles sont des étapes indispensables à l'acquisition par le génome paternel de sa compétence à la réplication, préalable à la syngamie. Tous ces événements doivent être extrêmement coordonnés afin de permettre à un premier noyau zygotique comportant les deux lots de chromosomes parentaux de se former et d'entrer dans le premier cycle mitotique.Notre laboratoire a identifié yemanuclein-alpha, aussi appelé yemanuclein (yem) dans un crible moléculaire pour des gènes exprimés spécifiquement dans la lignée germinale femelle, et son premier allèle muté yem1. Cette mutation ponctuelle (V478E) a été identifiée dans un crible génétique de « stérilité femelle ». Une descendance exceptionnelle observée chez les femelles yem1, présente la propriété inattendue d'être parthénogénétique. Cette propriété révèle un double défaut chez le mutant : dans le processus de méiose ovocytaire qui conduit à la formation d'un pronucleus maternel haploïde mais aussi dans la formation d'un pronucleus paternel compétent pour la syngamie. Mes travaux de thèse ont porté sur les deux aspects de la fonction de la Yemanucléine. En conjuguant des méthodes de génétique, de biochimie, et de biologie cellulaire, nous avons pu mettre en évidence des fonctions essentielles de la Yemanucléine dans les étapes initiales de la prophase méiotique de l'ovocyte de drosophile. Nous avons pu montrer que la Yemanucléine joue un rôle clé dans la recombinaison méiotique et plus particulièrement dans la fréquence et la cinétique d'apparition des cassures double brin. Son association au complexe synaptonémal et au complexe cohésine, tous deux connus comme étant nécessaires à la ségrégation chromosomique, est un élément clé de cette fonction.Outre cette fonction méiotique, la Yemanucléine, facteur maternel, est aussi requise pour l'assemblage de la chromatine du pronucleus paternel. Nous montrons dans ce manuscrit qu'elle joue ce rôle à travers son action dans un troisième complexe, en partenariat avec la protéine HIRA. Le complexe multiprotéique contenant la protéine HIRA est connu pour sa fonction de chaperon du variant de l'histone H3.3 et son rôle dans l'assemblage de la chromatine du pronucleus paternel. La Yemanucléine est le premier membre de la famille HPC2/UBN1 caractérisé. Son rôle dans l'assemblage des nucléosomes découplé de la réplication est décrit pour la première fois dans ce manuscrit. C'est aussi la première fois qu'une protéine spécifique de la reproduction est décrite pour son implication à deux étapes clés de ce processus. / Sexual reproduction relies on two key events: formation of cells with a haploid genome through meiosis and restoration of diploidy through syngamy in the zygote. Meiosis completion is supported exclusively by the maternal genome for the oocyte and the paternal genome for the sperm cell. In contrast diploidy restoration in the zygote is entirely dependent on maternal factors. At the end of meiosis the maternal pronucleus is competent for replication, whereas the paternal genome is packed with protamines. These proteins need to be removed in the zygote and replaced by maternally provided histones before the paternal genome acquires competence for replication, a prerequisite for syngamy. All these events must be highly coordinated to allow the first zygotic nucleus to form with the two sets of parental chromosomes and enter the first mitotic cycle. Our laboratory has identified yemanuclein-alpha, also called yemanuclein (yem) in a molecular screen for genes specifically expressed in the female germ line and its first mutant allele yem1, in a female sterile screen. The role played by yem not only in the meiotic process through which a haploid maternal pronucleus is formed but also in the zygotic process that makes a paternal pronucleus competent for syngamy, is underscored by the obtention of exceptional parthenogenetic progeny from yem1 mothers.My thesis work is precisely dedicated to the analysis of both aspects of Yemanuclein function: in the oocyte and the zygote. Using genetic, biochemical and cell biology methods we were able to uncover essential functions of Yemanuclein in early meiotic prophase in the Drosophila oocyte. Using yem1 allele (V478E), we could show its requirement for meiotic recombination especially for the frequency and timing of the double strand breaks formation. Yemanuclein association with two protein complexes, the Synaptonemal Complex (SC) and the Cohesin complex known to be required for proper chromosome segregation, supports these findings. Beyond its meiotic function, Yemanuclein is also required in the zygote for assembly of paternal pronucleus chromatin. This is achieved through a third complex that acts as histone H3.3 chaperone. In the present manuscript we identify Yemanuclein as a partner of HIRA in its role in H3.3 nucleosome assembly and deposition on the paternal pronucleus. Interestingly Yemanuclein is the first member of the HPC2/UBN1 protein family ever characterized. The role of Yem/ HPC2/ UBN1 in replication independent chromatin remodeling remained elusive until very recently. Our work is original in that it is the first to report on a role of one member of this family in oocyte meiosis and paternal chromatin assembly in the zygote.

Aujourd'hui, la congélation de l'embryon est la voie privilégiée pour la cryoconservation des ressources génétiques lapin au sein de la Cryobanque Nationale. Les objectifs de notre travail étaient d'optimiser la production des embryons et de développer une nouvelle voie de cryoconservation des ovocytes MII de lapin par congélation lente et par vitrification. Les expériences menées sur les traitements de superovulation et de synchronisation ainsi que sur le moment d'insémination par rapport au sevrage montrent que les conditions d'environnement des lapines sont plus importantes que la nature des traitements administrés. De plus, l'évaluation du métabolisme, de la structure et de la capacité de développement ovocytaire après réchauffement suggère que la vitrification et la congélation lente altèrent fortement les ovocytes par des lésions associées respectivement à leur importante sensibilité aux cryoprotecteurs et à la cristallisation intracellulaire.

Research on in vitro embryo production (IVP) in the equine is impeded by the limited availability of mature oocytes as the mare is mono ovulating and superovulation is still difficult (Dippert and Squires, 1994; Bezard et al., 1995; Alvarenga et al., 2001b). Despite recent improvement in IVM of equine oocytes, success rates of IVM in that species remain low in all culture media tested compared to other species (Goudet et al., 2000b). However, most studies have focused on the percentage of oocytes reaching the metaphase II stage (nuclear maturation) but few concentrated on the final oocyte competence as measured by its ability to develop into a blastocyst and further establish a pregnancy. Blastocyst production rate is influenced not only by culture environment but also by oocyte maturation conditions. Under in vitro culture conditions, oxidative modifications of cell components via increased ROS represent a major culture induced stress (Johnson and Nasr-Esfahani, 1994). Anti-oxidant systems can attenuate the deleterious effects of oxidative stress by scavenging ROS (Del Corso et al., 1994). Glutathione, a tripeptide thiol, is the major non-protein sulfydryl compound in mammalian cells that plays an important role in protecting the cell from oxidative damage (Meister and Tate, 1976; Meister and Anderson, 1983). It has been suggested that GSH content in oocytes may serve as a reservoir protecting the zygote and the early embryos from oxidative damage before genomic activation and de novo GSH synthesis occur (Furnus et al., 1998; de Matos and Furnus, 2000). The addition of GSH synthesis precursors, such as cysteamine, a thiol compound, to IVM media has been shown to improve IVP in various species (Takahashi et al., 1993; de Matos et al., 1995; Grupen et al., 1995; de Matos et al., 2002a; de Matos et al., 2002b; de Matos et al., 2003; Gasparrini et al., 2003; Oyamada and Fukui, 2004; Balasubramanian and Rho, 2007; Anand et al., 2008; Singhal et al., 2008; Zhou et al., 2008). Very little information on the use of thiol compounds in the equine is available. Conventional in vitro fertilization (IVF) has not been successful in the mare, and a repeatable IVF technique has not yet been developed (Alm et al., 2001). To overcome the limitation of conventional IVF procedures, other methods to produce embryos from oocytes, either in vivo or in vitro, have been investigated. Among these, intra cytoplasmic sperm injection (ICSI) has permitted efficient equine in vitro blastocyst production (Galli et al., 2002; Lazzari et al., 2002; Choi et al., 2006a; Choi et al., 2006c). However, ICSI requires specific equipment and skills. Transfer of an immature oocyte into the preovulatory follicle of an inseminated recipient mare (Intra-Follicular Oocyte Transfer, IFOT) has produced embryos but the success rate was low (Hinrichs and Digiorgio, 1991). Similarly, oocyte transfer (OT) into the oviduct of an inseminated recipient mare was investigated (McKinnon et al., 1988; Carnevale, 1996; Hinrichs et al., 1997; Carnevale et al., 2001; Carnevale et al., 2003; Carnevale, 2004), and commercial programs using OT for mares with reproductive abnormalities are now available (Carnevale et al., 2001). Unfortunately, IFOT is poorly documented in the literature and reports of OT have been published by various laboratories and under various conditions, making comparisons between results and choosing among these as substitutive techniques to ICSI or embryo transfer difficult. The first aim of the present work was to investigate if there is an influence of supplementation with 100 µM of cysteamine on conventional IVF success rate. Cumulus oocytes complexes (COCs) retrieved by transvaginal ultrasound guided aspiration were matured in vitro with or without cysteamine supplementation and were then submitted to conventional IVF using either calcium ionophore or heparin as capacitation treatment for spermatozoa. A total of 131 oocytes were evaluated for evidence of sperm penetration. Both techniques (ionophore or heparin) yielded 6% of IVF and results were similar both for the cysteamine and the control group. This success rate of IVF is low compared to some published data (Palmer et al., 1991; Dell'Aquila et al., 1996; McPartlin et al., 2009) but similar to what others reported in the literature (Choi et al., 1994; Dell'Aquila et al., 1997a). Although, it seems likely that cysteamine did not significantly improve IVF rates under our conditions, our general success rates for IVF procedures may be too low for us to conclude definitely about the effect of cysteamine. As ICSI was not available to us, the second aim of this work was to determine what in vivo technique could best bypass the lack of an efficient conventional IVF procedure. We compared embryo production following transfer of in vivo recovered oocytes (1) into a recipients oviduct or (2) into her preovulatory follicle either immediately after ovum pick up or (3) after in vitro maturation. Recipients were inseminated with fresh semen of a stallion with a known normal fertility. Ten days after transfer, rates of embryos collected in excess to the number of ovulations were calculated and compared for each group. Embryo collection rates were 32.5% (13/40), 5.5% (3/55) and 12.8% (6/47) for OT, post-IVM and immediate IFOT respectively. OT significantly yielded more embryos than immediate and post-IVM IFOT did. These results show that, when ICSI is not an option, intra-oviductal oocyte transfer is to be preferred to IFOT, as an in vivo alternative, to bypass the inadequacy of conventional in vitro fertilization and to assess oocyte developmental competence. After it was established that in comparison to IFOT, OT is the most reliable in vivo alternative to in vitro fertilization where ICSI technology is not available, this technique was used to assess the effect of cysteamine supplementation on nuclear maturation and oocyte competence. The third aim of this work was to investigate the influence of supplementation with 100 µM of cysteamine on in vitro nuclear and cytoplasmic maturation by specific DNA staining and the ability of oocytes to undergo in vivo fertilization after OT. Oocytes were collected by transvaginal ultrasound guided aspiration and matured in vitro with (cysteamine group) or without (control group) cysteamine. The nuclear stage after DNA Hoechst staining and the embryo yield following OT were used as a criterion for assessing nuclear and cytoplasmic maturation, respectively. Overall maturation rate was 52%, which is rates reported in the literature ranging from 40 to 70% in the equine (Goudet et al., 1997a; Bogh et al., 2002; Hinrichs et al., 2005; Galli et al., 2007). Nuclear maturation was not statistically different (p>0.05) between oocytes cultured with or without cysteamine (55% and 47% respectively). From 57 oocytes transferred to the oviduct in each group, the number of embryos collected was 10 (17%) in the control group and 5 in the cysteamine group (9%). Those two percentages were not statistically different (p>0.05). Contrary to the data described in other domestic species, there was no effect of cysteamine on in vitro nuclear maturation, or in vivo embryonic development under our conditions. Under our conditions, the addition of 100 µM of cysteamine to a classic culture medium does not improve equine oocyte maturation or embryonic development after OT. The same dose failed to increase GSH content in the equine (Luciano et al., 2006). However, the effect of cysteamine supplementation is highly species and concentration dependant. The inadequacy of the chosen concentration may explain that equine embryo production has not been increased by the cysteamine under our conditions as opposed to what has been observed in many other species. Alternatively, we can hypothesize that some substances present in the IVM medium can interfere with GSH synthesis. This has been suggested for FSH and estradiol (Bing et al., 2001) and, although our maturation medium is not supplemented with gonadotropins or estradiol, factors contained in fetal calf serum or EGF might also have an effect on GSH synthesis. Considering its beneficial effects in many other species, supplementation with cysteamine to different IVM media should be further investigated in the equine. Ideally combining different concentrations and ICSI or OT in order to determine an optimal concentration and its effects on oocyte developmental competence.